2015年9月22日Nature communication在线发表了解析丙酮丁醇梭菌硫解酶CaTHL三维结构及酶活性调节机制的研究。不同于大肠杆菌硫解酶EcTHL，CaTHL的活性是通过两个半胱氨酸残基（Cys88和Cys378）之间形成可逆的二硫键而被氧化还原开关调控。在野生型丙酮丁醇梭菌ATCC824中过量表达CaTHL会导致产酸和产溶剂紊乱使产丁醇减少。而不能形成二硫键的CaTHL^{V77Q/N153Y/A286K}突变株酶活性较高，且过量表达能产更多的丁醇。结果表明CaTHL是调控丙酮丁醇梭菌主代谢的关键酶，其活性通过氧化还原转化机制调节。
　　

　　图1CaTHL受氧化还原开关调节的机制
　　丁醇是一种四碳直链饱和醇，有广泛工业化用途，也被看作有前景的生物燃料，以模式菌株丙酮丁醇梭菌为代表的一类厌氧、产孢细菌——产溶剂梭菌以可再生原料发酵产丁醇已有百年历史。

　　一直以来，科学家尝试通过菌株改造、发酵过程优化等方法提高丁醇产量，但由于产溶剂梭菌遗传操作局限性及其代谢的复杂性，当前丁醇批次发酵浓度仍低于20 g/L。对产溶剂梭菌代谢复杂性的深入了解，或许能开启高产丁醇细胞工厂的大门。而CaTHL结构和调节功能的解析似乎就是开启这扇大门的开端。

　　1）CaTHL氧化和还原态的结构分别解析

　　


　　　　

　　图2CaTHL氧化和还原态结构活性位点分析

　　CaTHL的单体结构与II型生物合成硫解酶家族通用的折叠方式一致，有3个结构域：N基端、环形结构域和C端结构域组成。但不同于其他硫解酶，氧化状态下CaTHL活性位点的两个半胱氨酸残基Cys88和Cys378形成二硫键（图2d）。二硫键导致负责催化的半胱氨酸的氧化，同时半胱氨酸环构象变化，导致CaTHL在氧化状态时无活性（Inactive）。

　　突变体CaTHL^C378S不能形成二硫键（图2e）。通过CaTHL^C378S获得还原态结构，还原态下，两个活性中心的半胱氨酸残基和催化半胱氨酸环得以恢复，还原态的CaTHL是有活性的。还原态的CaTHL与CoA结合的结构也被解析，结果发现CaTHL与同类硫解酶的底物催化机制是一致的。

　　2）CaTHL受氧化还原调节的开关机制

　添加过氧化氢（H₂O₂）和二硫苏糖醇(DTT)可逆的改变CaTHL活性，而其他硫解酶EcTHL、ZcTHL却不可逆的被H₂O₂失活或不能形成二硫键。这表明CaTHL被氧化还原开关调节的机制是特异的。研究者对三者的结构比对后认为，CaTHL调控机制的特异是由其不稳定的可变区（flexible region）决定的，这里将其称之为调控决定区（RDR）（图2d,e）。

　　


　　

　　图3野生型CaTHL和RDR突变体CaTHL^{V77Q/N153Y/A286K}

　　2）CaTHL对丙酮丁醇梭菌代谢的影响及应用

　　丙酮丁醇梭菌丁醇发酵过程可为产酸、产溶剂两时期，CaTHL酶活性的变化会影响ATP的生成和辅酶再生。在丙酮丁醇梭菌ATCC824中过表达CaTHL会使丁醇产量降低到4.5 g/L（vs WT，10.7 g/L），酸累积增多，证据显示这是酸回用减少，产溶剂基因未能正常表达所致。

　　调控决定区RDR重设计获得突变体CaTHL^{V77Q/N153Y/A286K}，CaTHL^{V77Q/N153Y/A286K}因不形成二硫键而一直处于有活性状态，较CaTHL酶活提高3倍（图3）。在ThlA失活的丙酮丁醇梭菌中表达CaTHL^{V77Q/N153Y/A286K}较表达CaTHL产生更多的丁醇。

　　总的来说，CaTHL负责丁醇合成中调控乙酰-CoA节点的代谢流，其特殊的开关调控机制的解析有助于通过理性的代谢工程策略构建丁醇高产菌。

　　原文链接：http://www.nature.com/ncomms/2015/150922/ncomms9410/full/ncomms9410.htmlhttp://www.kaist.edu/html/en/index.html

来源：工业生物技术信息网