条件恐惧是学习与记忆研究中常用的行为范式。在听觉条件恐惧学习中，小鼠先听到一个声音，再被给予一个足部电击。小鼠会将声音与电击关联起来，并在声音到来时表现出恐惧反应。关于条件恐惧的神经环路基础，人们普遍认为，听觉信息从听觉丘脑和皮层传入，然后经由听觉丘脑——侧杏仁核及听皮层-——侧杏仁核通路，在侧杏仁核与来自体感皮层的电击信息整合。然而，在此项研究中，结合荧光标记、病毒示踪和免疫电镜技术等，研究人员发现了一个新的投射通路：侧杏仁核——听觉皮层（图A）。运用化学遗传和光遗传技术，研究人员发现选择性抑制此通路的神经活动可大幅度降低小鼠的恐惧反应（图B），表明此通路在恐惧记忆中起着关键作用。
侧杏仁核——听皮层通路在条件恐惧学习后是否表现出突触可塑性？皮层中的突触由突触前轴突小结和突触后树突棘构成。研究人员用双光子成像技术对小鼠听皮层进行在体长期成像，以追踪此通路中来自侧杏仁核的轴突小结和听皮层细胞的树突棘的结构变化。研究发现侧杏仁核的轴突小结和听皮层第五层细胞的顶树突的树突棘在恐惧学习3天之后都有显著增加（图C）。与之形成对照的是，来自前扣带回皮层和听觉丘脑的突触前轴突小结，以及听皮层第2/3层细胞的树突棘，在恐惧学习之后都没有显著变化，提示恐惧学习可特异性地造成侧杏仁核细胞与听皮层第5层细胞的突触重构。
同一根树突上的不同树突棘和同一根轴突上的不同轴突小结都分别会与不同的神经元形成突触。突触可塑性是否可由特定的连接通路决定？为回答这一问题，研究人员在活体动物中首次使用了双色双光子成像技术。通过在特定通路中的突触前与突触后神经元中表达不同的荧光蛋白，研究人员可以直接观察到该通路中的突触结构。用这个方法，研究人员发现，恐惧学习后，侧杏仁核——听皮层通路中的轴突小结及树突棘增加比例都远高于平均（图D），即突触可塑性可由连接通路决定。进一步研究发现，侧杏仁核——听皮层通路中的突触数目在恐惧训练两小时后就有显著增加，且增加可延续至3天以上（图E），与恐惧记忆形成和巩固的时程一致，提示此通路可能与恐惧记忆的存储相关。
使用双色成像技术，研究人员还发现，新形成的突触绝大多数都是在已存在的突触结构上添加新的突触结构的方式形成（图F），很少有突触前后均为新形成的“全新”突触。这个新增突触连接的方式可以节省空间和结构蛋白数量，是一种很“经济”的突触形成方式。并且，在所有观察过的皮层下—皮层，以及皮层—皮层通路中，突触形成都遵循此规律，故而此规律可能是成年动物大脑皮层中新增突触的通用规则。
此项工作在蒲慕明院士的指导下，由神经所的杨扬和刘丹倩共同完成。该研究首次发现了在恐惧记忆中起重要作用的侧杏仁核——听觉皮层通路，及该通路与恐惧学习相关的特异性重构。此研究为研究通路特异结构的可塑性提供了新方法，对条件恐惧学习的神经环路研究是重要的补充，并且提示了成年动物大脑中新突触形成的基本规律。（神经所）
图A：局部注射EGFP顺向标记LA的神经元，在同侧ACx能检测到荧光标记的轴突信号。图B：在LA注射表达hM4D的病毒。在恐惧记忆测试时，在ACx局部注射hM4D的配体CNO以阻断LA-ACx通路的突触传递。* p < 0.05, ** p < 0.01。图C：在LA注射表达eArch3.0的病毒。在恐惧记忆测试时，在ACx照射绿光以抑制投射到ACx的LA轴突。图D：左：训练后3天，投射到ACx表层的LA轴突小结的形成比例和消失比例。右：ACx L5神经元顶树突上树突棘的形成和消失比例。每个圆圈代表一只小鼠。图E：左：双色双光子在体成像观察LA的轴突（绿）和L5神经元顶树突（红）。白色箭头，三角形和菱形分别指示稳定的，新形成的和消失的突触。右：对照组和实验组中，LA-ACx突触在训练后新形成及消失的比例。***p<0.001。图F：左：新的树突棘与已有的轴突小结形成新的突触。右：新的轴突小结与已有的树突棘形成新的突触。
