李冬1,何永平1,张肖静2,梁瑜海1,张玉龙1,范丹1,张杰1,3
(1.水质科学与水环境恢复工程北京市重点实验室(北京工业大学),100124 北京; 2.郑州轻工业学院 环境污染治理与生态修复河南省协同创新中心,450001 郑州; 3.城市水资源与水环境国家重点实验室(哈尔滨工业大学),150090 哈尔滨)
摘要:
为考察不同有机碳源质量浓度对亚硝化的全程自养脱氮工艺（SNAD）脱氮性能的影响，将该工艺应用到生活污水的处理中，采用MBR反应器，以葡萄糖作为有机物来源，通过逐步增大COD来实现，并运用PCR-DGGE技术研究了微生物种群结构的变化.反应器运行结果和DGGE图谱分析表明：碳氮比为0~2时，COD的增加不会抑制AOB和Anammox菌，AOB和Anammox菌的菌属种类不受影响，反而通过反硝化作用提高氮去除负荷.总氮去除率和氮去除负荷分别为67%和0.34 kg/（m3·d）左右.碳氮比为3~4及生活污水运行条件下，Anammox菌不受影响，AOB的活性受到抑制，菌属种类减少，脱氮效率下降.生活污水运行阶段，总氮去除率和氮去除负荷平均分别为73%和0.17 kg/（m3·d）.Nitrosomonas和Candidatus Kuenenia stuttgartiensis一直是反应器内的优势菌属，共同完成脱氮过程.
关键词: 同步亚硝化厌氧氨氧化和反硝化 有机物 生活污水 聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳 微生物
DOI：10.11918/j.issn.0367-6234.2016.02.012
分类号:X172
文献标识码:A
基金项目:国家自然科学基金(51222807); 国家科技重大专项-水专项(2012ZX07202-005).
Effect of organic carbon on nitrogen removal and the microbial communities in SNAD process
LI Dong1, HE Yongping1, ZHANG Xiaojing2, LIANG Yuhai1, ZHANG Yulong1, FAN Dan1, ZHANG Jie1,3
(1.Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering(Beijing University of Technology), 100124 Beijing,China; 2.Collaborative Innovation Center of Environmental Pollution Control and Ecological Restoration, Zhengzhou University of Light Industry, 450001 Zhengzhou,China; 3.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment(Harbin Institute of Technology), 150090 Harbin,China)
Abstract:
Effect of different organic substrate concentration on nitrogen removal in SNAD and the application of this process to treat domestic wastewater were investigated in a MBR, with gradually increased glucose as a source of organic matter. Besides, changes of microbial communities were observed by PCR-DGGE techniques. Experimental results and DGGE profiles showed that the increase of organic carbon concentration did not inhibited the activity and category species of AOB and Anammox bacteria when the C/N ration was ranged 0 to 2.0. Meanwhile, a significantly improvement of nitrogen removal was observed via effective denitrification, with a total nitrogen removal efficiency of 67% and nitrogen removal rate of 0.34 kg/(m3·d), respectively. Under the C/N of 3-4 condition, the anammox bacteria in the system changed insignificantly, but AOB was inhibited and the category species reduced, resulting a decreasing of nitrogen removal efficiency.Total nitrogen removal efficiency and nitrogen removal rate were about 73% and 0.17 kg/(m3·d), respectively.Nitrosomonas and Candidatus Kuenenia stuttgartiensis were the predominant microorganisms in the SNAD reactor and played a major role in autotrophic nitrogen removal.
Key words: SNAD organic carbon domestic wastewater PCR-DGGE microbes
李冬, 何永平, 张肖静, 梁瑜海, 张玉龙, 范丹, 张杰. 有机碳源对SNAD工艺脱氮性能及微生物种群结构的影响[J]. 哈尔滨工业大学学报, 2016, 48(2): 68-75. DOI: 10.11918/j.issn.0367-6234.2016.02.012.
LI Dong, HE Yongping, ZHANG Xiaojing, LIANG Yuhai, ZHANG Yulong, FAN Dan, ZHANG Jie. Effect of organic carbon on nitrogen removal and the microbial communities in SNAD process[J]. Journal of Harbin Institute of Technology, 2016, 48(2): 68-75. DOI: 10.11918/j.issn.0367-6234.2016.02.012.
基金项目 国家自然科学基金（51222807）；国家科技重大专项-水专项（2012ZX07202-005） 作者简介 李冬(1976—), 女, 教授, 博士生导师;
张杰(1938-), 男, 博士生导师, 中国工程院院士 通信作者 李冬, lidong2006@bjut.edu.cn 文章历史 收稿日期: 2014-08-08
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有机碳源对SNAD工艺脱氮性能及微生物种群结构的影响
李冬1
, 何永平1, 张肖静2, 梁瑜海1, 张玉龙1, 范丹1, 张杰1,3 1. 水质科学与水环境恢复工程北京市重点实验室(北京工业大学), 100124 北京;
2. 郑州轻工业学院 环境污染治理与生态修复河南省协同创新中心, 450001 郑州;
3. 城市水资源与水环境国家重点实验室(哈尔滨工业大学), 150090 哈尔滨
收稿日期: 2014-08-08
基金项目: 国家自然科学基金（51222807）；国家科技重大专项-水专项（2012ZX07202-005）
作者简介: 李冬(1976—), 女, 教授, 博士生导师;
张杰(1938-), 男, 博士生导师, 中国工程院院士
通信作者: 李冬, lidong2006@bjut.edu.cn
摘要: 为考察不同有机碳源质量浓度对亚硝化的全程自养脱氮工艺（SNAD）脱氮性能的影响，将该工艺应用到生活污水的处理中，采用MBR反应器，以葡萄糖作为有机物来源，通过逐步增大COD来实现，并运用PCR-DGGE技术研究了微生物种群结构的变化.反应器运行结果和DGGE图谱分析表明：碳氮比为0~2时，COD的增加不会抑制AOB和Anammox菌，AOB和Anammox菌的菌属种类不受影响，反而通过反硝化作用提高氮去除负荷.总氮去除率和氮去除负荷分别为67%和0.34 kg/（m3·d）左右.碳氮比为3~4及生活污水运行条件下，Anammox菌不受影响，AOB的活性受到抑制，菌属种类减少，脱氮效率下降.生活污水运行阶段，总氮去除率和氮去除负荷平均分别为73%和0.17 kg/（m3·d）.Nitrosomonas和Candidatus Kuenenia stuttgartiensis一直是反应器内的优势菌属，共同完成脱氮过程.
关键词: 同步亚硝化厌氧氨氧化和反硝化 有机物 生活污水 聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳 微生物
Effect of organic carbon on nitrogen removal and the microbial communities in SNAD process
LI Dong1
, HE Yongping1, ZHANG Xiaojing2, LIANG Yuhai1, ZHANG Yulong1, FAN Dan1, ZHANG Jie1,3 1. Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering(Beijing University of Technology), 100124 Beijing, China;
2. Collaborative Innovation Center of Environmental Pollution Control and Ecological Restoration, Zhengzhou University of Light Industry, 450001 Zhengzhou, China;
3. State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment(Harbin Institute of Technology), 150090 Harbin, China
Abstract: Effect of different organic substrate concentration on nitrogen removal in SNAD and the application of this process to treat domestic wastewater were investigated in a MBR, with gradually increased glucose as a source of organic matter. Besides, changes of microbial communities were observed by PCR-DGGE techniques. Experimental results and DGGE profiles showed that the increase of organic carbon concentration did not inhibited the activity and category species of AOB and Anammox bacteria when the C/N ration was ranged 0 to 2.0. Meanwhile, a significantly improvement of nitrogen removal was observed via effective denitrification, with a total nitrogen removal efficiency of 67% and nitrogen removal rate of 0.34 kg/(m3·d), respectively. Under the C/N of 3-4 condition, the anammox bacteria in the system changed insignificantly, but AOB was inhibited and the category species reduced, resulting a decreasing of nitrogen removal efficiency.Total nitrogen removal efficiency and nitrogen removal rate were about 73% and 0.17 kg/(m3·d), respectively.Nitrosomonas and Candidatus Kuenenia stuttgartiensis were the predominant microorganisms in the SNAD reactor and played a major role in autotrophic nitrogen removal.
Keywords: SNAD organic carbon domestic wastewater PCR-DGGE microbes
目前, 水体中氮素污染物的去除仍是水处理领域研究的热点与难点.传统硝化-反硝化脱氮工艺虽然脱氮效率高, 但投资与运行费用高, 耗能大, 污泥产量高[1].基于亚硝化的全程自养脱氮(CANON)[2]工艺有效地克服了传统脱氮工艺中固有的缺点.CANON工艺是指氨氧化菌(AOB)和厌氧氨氧化(Anammox)菌共存于同一反应器内, AOB在微氧条件下, 以氧作为电子受体将NH4+-N部分氧化为NO2--N, Anammox菌以AOB产生的NO2--N为电子受体, 与剩余NH4+-N反应, 生成N2并释放, 达到脱氮目的.CANON系统内化学计量方程式如下
(1) CANON工艺因具有高效脱氮、耗能少、无需外加碳源且污泥产量低等优点受到国内外诸多学者的青睐.但根据式(1), 理论上CANON工艺只能达到89%的总氮去除率, 产生11%左右的NO3--N无法根除.并且, 只含氨氮不含有机物的水体几乎不存在, 由于AOB和Anammox菌均是自养菌, 有机物的存在势必对这两种菌产生影响.如何同时去除水体中的氨氮和有机物, 进一步提高脱氮效率, 是研究学者努力的方向.Chen等[3]提出了同步亚硝化、厌氧氨氧化和反硝化(SNAD)工艺, 即在同一反应器内AOB和Anammox菌共同完成CANON反应, 反硝化细菌以有机物为电子供体, 将产生的少量NO3--N还原为N2, 解决了上述难题.近年来, SNAD工艺的研究多集中在化肥工业废水、养猪废水等高氨氮、低碳氮比的废水处理中[4-6], 而关于不同有机物质量浓度对SNAD工艺的影响及将其应用于低氨氮、高碳氮比的生活污水的处理少见报道.本研究以MBR系统内SNAD工艺为对象, 探讨了不同有机物质量浓度对SNAD工艺的影响及对系统内AOB和Anammox菌种群结构的影响, 进一步考察SNAD工艺应用于实际生活污水同步脱氮除有机物的处理, 以期为该工艺应用于工程实践提供理论依据.
1 实验 1.1 实验装置本实验在已成功以连续流方式运行CANON工艺的基础上进行.运行期间, 曝气量为0.2 mL/min、NH4+-N质量浓度为150 mg/L时, NH4+-N去除率、总氮去除率和氮去除负荷分别为88%、51.67%和0.45 kg/(m3·d).实验装置为有机玻璃制成的圆柱形MBR反应器, 如图 1所示.圆柱内径13 cm, 高度40 cm, 有效容积3 L, 内置聚偏氟乙烯(PVDF)中空纤维膜组件, 膜孔径为0.1 μm, 有效膜面积为0.2 m2, 膜通量36 L/h.反应器底部设置曝气环, 采用鼓风曝气, 曝气量由转子流量计控制, 中间设有搅拌机, 用于基质和O2均匀扩散, 外部设置水浴套筒, 由温度控制仪控制反应器内温度.
Figure 1
1—进水箱; 2—进水泵; 3—膜组件; 4—出水泵; 5—鼓风机; 6—气体流量计; 7—曝气环; 8—DO电极; 9—pH电极; 10—DO在线测定仪; 11— pH在线测定仪; 12—搅拌机; 13—水浴.图 1 实验装置示意 1.2 实验用水与实验方法实验用水前期采用人工配水, 分别以(NH4)2SO4、NaHCO3和葡萄糖作为NH4+-N、碱度和COD的来源.进水中额外添加MgSO4·5H2O、CaCl2、KH2PO4和营养液Ⅰ、Ⅱ作为营养物质, 营养液Ⅰ包括EDTA 5 000 mg/L和FeSO45 000 mg/L.营养液Ⅱ包括EDTA 15 000 mg/L、ZnSO4·7H2O 430 mg/L、CoCl2·6H2O 240 mg/L、MnCl2·4H2O 990 mg/L、CuSO4·5H2O 250 mg/L、Na2MoO4·2H2O 220 mg/L、NiCl2·6H2O 190 mg/L、Na2SeO4·10H2O 210 mg/L和H3BO414 mg/L, 水质情况见表 1.后期实验用水取自北京工业大学教工家属西区化粪池中的生活污水, 不再另外投加任何其他物质, 水质情况见表 2.
表 1
表 1 人工配水水质 
表 1 人工配水水质
表 2
表 2 生活污水水质 
表 2 生活污水水质
实验在常温(23~25)℃条件下采用连续流方式运行, 分为两个阶段：第Ⅰ阶段, 配水运行, COD为0、50、100、200、300、400 mg/L; 第Ⅱ阶段, 生活污水运行.不同阶段主要运行条件见表 3.
表 3
表 3 不同阶段主要运行条件 
表 3 不同阶段主要运行条件
1.3 分析项目与方法NH4+-N、NO2--N、NO3--N、COD等指标均采用国家规定的标准方法测定[7]; DO、ORP、pH及温度测定分别采用EUTECH DO2000PPG多功能溶解氧在线测定仪、WTW ORP296型在线测定仪、WTW pH296型在线测定仪测定.
1.4 DNA提取、PCR-DGGE、克隆和测序 1.4.1 基因组DNA的提取在COD为0、200、400 mg/L及生活污水运行稳定期, 从MBR反应器内采集混合液.用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)提取基因组DNA, 具体操作按说明书进行.所提取的基因组DNA用0.8%(质量分数)的琼脂糖凝胶电泳检测, 以备PCR用.
1.4.2 PCR扩增及DGGE电泳采用巢式PCR方法, 分别扩增β-proteobacteria菌门的AOB, Planctomycetales菌门的Anammox菌.为扩增AOB的16S rDNA, 第一轮扩增使用CTO189fA/B和CTO189fC混合引物(体积比2:1)作为正向引物, 反向引物采用CTO654r.之后以第一轮PCR扩增产物为模板, 使用通用引物对F338(带GC夹)/R518进行第二轮PCR扩增.对于Anammox菌特异性片段的扩增, 第一轮先以引物对Pla46F/630R进行浮霉球菌扩增.之后以第一轮PCR扩增产物为模板, 使用引物对Amx368f(带GC夹)/Amx820r进行第二轮PCR扩增.PCR反应体系为25 μL, 其中包含2.5 μL 10 × Ex Taq buffer (Mg2+ Plus), 2.0 μL DNTP, 1.0 μL BSA, 1.0 μL引物, 0.125 μL TaKaRa Ex Taq酶, 模板DNA约1.0 ng, 用无菌水补齐至25 μL.引物碱基序列及反应条件见表 4.
表 4
表 4 PCR常用引物对应程序 
表 4 PCR常用引物对应程序
PCR扩增产物用1.5%(质量分数)的琼脂糖凝胶进行电泳检测.采用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行PCR产物的纯化回收, 具体操作按说明书进行.对PCR产物进行DGGE分析：聚丙烯酰胺质量分数8%, 变性梯度为30%~60%, 电压120 V, 电泳时间5 h, 电泳在Dcode Universal Mutation Detection System仪器上进行.电泳结束后按Bassam等[12]的方法对凝胶进行银染和拍照.
1.4.3 克隆和测序切取DGGE图谱中的目的条带溶于150 μL TE(pH 8.0)溶液中, 4 ℃过夜, 以此为模板, 以不含GC夹的引物进行PCR扩增, 并对PCR产物进行纯化.按照pMD19-T plasmid vector system说明书进行基因片段与载体的连接后, 转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中, 通过蓝白斑法筛选阳性克隆子, 过夜培养后进行测序.采用BLAST对测序结果和基因库中已知序列进行相似性分析.
2 结果与讨论 2.1 反应器运行性能 2.1.1 配水阶段反应器运行性能此阶段主要探讨不同碳氮比对SNAD工艺运行性能的影响及调控方法.NH4+-N质量浓度为100 mg/L, COD依次从0 mg/L逐渐递增到400 mg/L, 本阶段反应器运行效果如图 2所示.由图 2(a)可以看出, 0~53 d, 随着碳氮比的增大, 即分别为0、0.5、1.0、2.0, 出水NH4+-N质量浓度基本不变, 维持在24 mg/L, 出水NO2--N和NO3--N质量浓度逐渐减小, 分别下降到0.2和5.0 mg/L左右.图 2(b)也显示NH4+-N去除率(RAR)一直在75%左右, 总氮去除率(RTN)和氮去除负荷(RNR)由于出水NO2--N和NO3--N质量浓度的减小, 不断增大至67%和0.34 kg/(m3·d)左右.当碳氮比为3时, 由于HRT控制不稳, 导致第54~59天出水NH4+-N质量浓度变化也较大, 但第60~64天HRT稳定后, 出水NH4+-N质量浓度明显增高, RTN和RNR降低, 因此, 第65~71天, 曝气量由0.1 mL/min调至0.2 mL/min, 以氧化更多的NH4+-N, 此时, 出水NH4+-N质量浓度只是轻微减小.在第72~79天将HRT由(5.0±0.5)增大至(7.0±0.5)h, 出水NH4+-N质量浓度进一步降至13.0 mg/L左右, 出水NO3--N质量浓度增加到9.3 mg/L, RTN上升到75%左右, RNR有所回升, 为0.23 kg/(m3·d)左右.继续增大碳氮比至4, 出水NH4+-N质量浓度增加至21.0 mg/L, 而出水NO3--N质量浓度减小至4.0 mg/L, RTN和RNR分别为72%和0.24 kg/(m3·d).图 2(c)表明, 当COD为50 mg/L时, 出水COD在23~30 mg/L, 随着COD的增加, 出水COD变化范围为9.0~14.0 mg/L, COD去除率不断增大, 在95%以上.
Figure 2
图 2 配水阶段反应器运行性能 2.1.2 生活污水阶段反应器运行性能此阶段引入生活污水, 如图 3所示.第94~103天, 进水为人工配水和生活污水各一半, 混合均匀，考虑到生活污水中好氧异养微生物较多, 会消耗较多的溶解氧, 将HRT增大到12 h左右.从图 3可以看出, 出水NH4+-N质量浓度在3 mg/L左右, 出水NO2--N接近0 mg/L, 出水NO3--N质量浓度为3 mg/L左右, 出水COD在25~33 mg/L波动. RAR和RTN分别达95%和89%以上.第104~120天为完全原水运行时期, 由于进水中只加入50%生活污水时, RAR和RTN已较高, 便将HRT减小到(7.0±0.5) h.前9 d, 随着反应器的运行, 出水NH4+-N质量浓度越来越大, 导致RTN和RNR急剧下降.第114天将HRT增加至(8.3±0.1) h, 出水NH4+-N质量浓度迅速降至23.0 mg/L左右, 出水NO2--N和NO3--N质量浓度几乎为0 mg/L, RTN和RNR也分别上升到73%和0.17 kg/(m3·d)左右, 出水COD略升至30.0~40.0 mg/L, COD去除率达90%左右.
Figure 3
图 3 生活污水阶段反应器运行性能 2.2 反应器运行性能分析由于AOB和Anammox菌是自养菌, 不需要有机物作为碳源或能源物质, 当反应器中存在有机物时, 势必会改变其生存环境的物化特性, 从而促进或抑制其生长和脱氮性能.本实验配水运行阶段, 当碳氮比≤2时, 随着COD的增加, RAR基本保持不变, RTN和RNR由于出水NO2--N和NO3--N质量浓度的减少而增大.这是因为在低质量浓度有机碳源下, AOB和Anammox菌未受到影响, 而反硝化细菌活性增强, 通过反硝化作用将NO2--N和NO3--N还原为N2, 提高了脱氮效率.有学者[13-15]认为低质量浓度的有机物不会显著影响Anammox反应, 反而通过反硝化作用提高总氮去除率.当碳氮比为3时, 出水NO3--N质量浓度进一步下降, 但出水NH4+-N质量浓度上升幅度较大.有机碳源对AOB和Anammox菌的抑制作用表现为：有机物的加入会使好氧异养菌繁殖, 与AOB竞争O2, 从而抑制AOB的活性; 同时, 会使反硝化细菌生长, 与Anammox菌竞争底物NO2--N, 致使Anammox菌活性降低甚至失活[4].周少奇[16]发现高碳源环境下, 由于反硝化菌的生长速率大于Anammox菌, 大量繁殖, 在竞争NO2--N时占优势.本研究中导致出水NH4+-N质量浓度升高, 理论上可能存在以下原因：①因好氧异养菌大量繁殖, AOB受到抑制, 导致Anammox菌所需的底物——NO2--N减少, 也受到抑制; ②AOB未受到影响, 因反硝化菌的过度繁殖, 使得NO2--N减少Anammox菌受到抑制; ③因好氧异养菌和反硝化菌均大量繁殖, 致使AOB和Anammox菌同时受到抑制.分析如下：如图 4(a)所示, 当碳氮比为0、0.5、1.0、2.0, 曝气量为0.1 mL/min时, DO维持在0.3 mg/L, 而ORP由-22 mV逐渐减小到-105 mV左右.反应器内随着碳氮比的增加, DO相对稳定, O2可供好氧异养菌和AOB同时利用, 表明在碳氮比≤2的条件下, 在竞争O2时, 好氧异养菌未对AOB菌造成不利影响, 而ORP的减小是因为反硝化菌的作用.文献[17]在研究循环式活性污泥法时认为, 在缺氧区ORP能指示反硝化碳源是否充足, 即反硝化作用加强会导致ORP减小.虽然存在反硝化菌, 但在低质量浓度有机碳源下, 其对NO2--N的亲和力要小于Anammox菌对NO2--N的亲和力[18]，所以Anammox菌也未受到抑制, 这与反应器内氮素变化情况一致.当碳氮比为3时, 第54~64天, DO和ORP大幅下降(文献[17]的研究表明，ORP随着DO质量浓度的下降而下降), 高质量浓度有机物的存在使好氧异养菌大量繁殖, 消耗大量O2, AOB可能由于供氧不足受到抑制, 生成少量的NO2--N, Anammox菌因基质NO2--N质量浓度不足活性降低, 导致出水NH4+-N质量浓度升高, RNR降低.根据以上分析将O2调至0.2 mL/min, 此时DO仍为0.1 mg/L, 出水NH4+-N质量浓度降低, 但还是较高, 第72天, 增大HRT, DO为0.2 mg/L, 出水NH4+-N质量浓度进一步降低.当碳氮比为4时, DO减至0.1 mg/L, 出水NH4+-N质量浓度轻微升高.如图 4(b)所示, 生活污水运行阶段同理, 不再赘述.
Figure 4
图 4 不同阶段O2、DO、ORP的变化 由以上分析可知, 当碳氮比为3时, 出水NH4+-N质量浓度升高的原因符合第①种.若是因为AOB未受到影响, 反硝化菌过度繁殖, 便会导致反应器内ORP的升高, 与此时DO和ORP大幅下降的现象不符.若是因为好氧异养菌和反硝化菌均大量繁殖, 当增大DO质量浓度或HRT, 虽然AOB活性恢复, 但由于反硝化菌继续大量增殖与Anammox菌竞争NO2--N, 势必会抑制Anammox菌, 加之后期碳氮比为4, Anammox菌一直处于劣势, 种群结构会受到影响, 但2.3节DGGE图谱显示Anammox菌种群结构在运行期间未发生变化.所以, 本研究中碳氮比≥3致使反应器脱氮性能下降, 主要是好氧异养菌大量繁殖, AOB受到抑制所致.
从图 2(c)可以看出，COD去除率随COD的增加而增大.原因是当COD较低时, 异养菌数量较少, 只能氧化少量的有机物, 当COD越来越大, 异养菌大量增殖, 氧化了大量有机物.比较配水运行阶段与生活污水运行阶段出水COD, 后者偏大, 主要是由原水中存在难降解有机物所致.
图 5为实验结束时, 曝气量为0.2 mL/min, 以生活污水为进水的周期实验.0~10 h, COD逐步下降, 而NH4+-N质量浓度变化不明显, 说明COD最先被好氧异养菌氧化, 并消耗O2, 抑制了AOB的活性.当COD降至89.42 mg/L时, NH4+-N质量浓度开始下降, AOB和Anammox菌发挥作用, 同时反硝化细菌将生成的NO3--N还原为N2, 使得NO3--N质量浓度没有升高, AOB、Anammox菌和反硝化细菌共同完成脱氮作用.同时也说明在高碳氮比的情况下, 由于好氧异养菌先将大部分COD去除, 解除了反硝化细菌过度繁殖竞争基质NO2--N对Anammox菌的不利影响, 这也是本实验中虽然碳氮比高于其他学者研究值[15, 19], 但在短期内未对Anammox菌产生抑制的原因.
Figure 5
图 5 周期实验中COD、三氮质量浓度的变化 2.3 AOB和Anammox菌种群结构变化图 6中a、b、c、d 4个泳道分别对应COD为0、200、400 mg/L及生活污水运行阶段AOB的DGGE图谱.对图中10个条带进行DNA基因序列测序, 结果表明，所有AOB均属于β-proteobacteria, 主要是Nitrosomonas, 包括Nitrosomonas sp.、Nitrosomonas europaea、Nitrosococcus mobilis和Nitrosomonas oligotropha且相似度均在98%及以上, 如表 5所示, 表明Nitrosomonas是反应器内的优势菌种.Ducey等[20]在研究亚硝化时, 对153个克隆的16S rRNA基因序列进行测序分析, 结果表明大部分属于Nitrosomonas. Liu等[21]认为相对于Nitrosospira, Nitrosomonas更适于在CANON反应器中生长.对比4个阶段AOB的种群结构变化可以看出：碳氮比由0~2, 条带数量均为10, 无条带缺失, AOB菌属种类不受影响; 当碳氮比为4时, 条带数量减少到9, 缺少了条带4(Nitrosomonas sp.), AOB种群结构有所变化, 菌属种类减少, 说明在高质量浓度有机碳下, 好氧异养菌快速增殖竞争O2, AOB受到抑制; 在处理生活污水时, 条带数量减少至8, 缺少了条带4(Nitrosomonas sp.)和条带6(Nitrosomonas sp.), AOB菌属种类进一步减少, 原因是生活污水中存在多而繁杂的好氧异养菌, 其引入对AOB更为不利, 影响了AOB的种群结构.
Figure 6
图 6 AOB的DGGE图谱 表 5
表 5 DGGE条带上AOB的DNA序列比对结果 
表 5 DGGE条带上AOB的DNA序列比对结果
图 7中a、b、c、d 4个泳道分别对应COD为0、200、400 mg/L及生活污水运行阶段Anammox菌的DGGE图谱.对图中3个条带进行DNA基因序列测序, 结果表明均属于Planctomycetia, 包括Candidatus Kuenenia stuttgartiensis和anaerobic ammonium-oxidizing planctomycete, 相似度高达99%及以上(表 6).Hu等[22]的研究表明，Candidatus Kuenenia stuttgartiensis是一种存在于淡水环境中的Anammox, 且在污水脱氮系统中常见[23].
Figure 7
图 7 Anammox菌的DGGE图谱 表 6
表 6 DGGE条带上Anammox菌的DNA序列比对结果 
表 6 DGGE条带上Anammox菌的DNA序列比对结果
从图 7可以看出, 在4个阶段中Anammox菌菌属种类没有变化, 全部为3个同位置的条带, 说明在碳氮比由0增到4的过程中, 通过及时调整运行参数, 短期内Anammox菌种群结构不会受到影响.AOB和Anammox菌的DGGE图谱分析表明，Nitrosomonas和Candidatus Kuenenia stuttgartiensis一直是反应器内的优势菌种, 共同完成脱氮过程, 且有机物对种群结构的影响与对反应器脱氮性能的影响一致.
3 结论1) 碳氮比为0~2(ρ(NH4+-N)=100 mg/L、COD为0~200 mg/L)条件下, COD的增加不会抑制AOB和Anammox菌, 反而通过反硝化作用提高氮去除负荷.总氮去除率和氮去除负荷平均分别为67%和0.34 kg/(m3·d).可见, SNAD工艺对于低碳氮比废水的脱氮处理有很好的应用前景.
2) 碳氮比为3~4(ρ(NH4+-N)=100 mg/L、COD为300~400 mg/L)及生活污水运行条件下, 由于大量COD的存在使得好氧异养菌不断增殖, 抑制AOB的活性, 脱氮效率下降, 影响自养系统脱氮性能的稳定性, 可通过调整曝气量和HRT改善出水水质.生活污水运行阶段, 总氮去除率和氮去除负荷平均分别为73%和0.17 kg/(m3·d), 反应器脱氮性能尚需进一步提高.
3) 人工配水阶段，随碳氮比的增加, COD去除率不断升高, 在95%以上.生活污水运行阶段, 由于存在难降解有机物，COD去除率在90%左右.可见, SNAD工艺可以提高脱氮效率, 还可有效去除有机物.
4) AOB和Anammox菌的DGGE图谱分析表明：碳氮比为0~2时, COD的增加对AOB和Anammox菌的菌属种类无影响.碳氮比为3~4及生活污水运行时, COD的增加使AOB菌属种类减少，而通过及时调控运行参数(DO、HRT)短期内Anammox菌不会受到影响, 对其长期作用还需进一步研究.这与反应器的脱氮性能变化一致.Nitrosomonas和Candidatus Kuenenia stuttgartiensis一直是反应器内的优势菌种, 共同完成脱氮过程.以后, 可着重研究如何创造有利于这两种菌生存的环境.
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