第二节    DNA复制的酶学

    复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程，需要多种高分子物质的共同参与：

底物，即dATP，dGTP，dCTP和dTTP，总称dNTP；聚合酶（polymerase），依赖DNA的DNA聚合酶，简称为DNA－pol；模板（template），指解开成单链的DNA母链；引物（primer），提供3’－OH末端，使dNTP可以依次聚合；其他酶和蛋白质因子。

                       一、复制的化学反应

    核苷酸和核苷酸之间，是通过磷酸二酯键的生成而逐一聚会的。反应的底物是dNTP而不是dNMP。 dNMP是脱氧一磷酸核苷（oxynucleotide monophosphate），dNTP是脱氧三磷酸核苷（oxynucleotide triphosphate），N可以代表 A，G，C，T 4种碱基任何一种。

核苷酸的聚会反应见图11－4。

    dNTP上最靠近核糖的一个磷酸称为。α－P，向左依次为β－P和γ一P。a－P与相邻的核苷酸上核糖的3’－OH生成磷酸二酯键，dNTP的β，γ－P以焦磷酸（PPi）形式被释放。这只是连续反应中的一次，从总体来看复制的延长过程，反应式为：

     或其中的每一步简写为：

    上述这些反应式都未考虑参与聚会的众多因素。生物体内，反应过程是按图11－4的方式进行的。它反映了DNA链生成过程，需要有模板、引物，而且遵照碱基互补规律，按模板的指引来延长。此外，值得指出的是，新链只能从5’一端向3’一端延长。底物的5’－P是加合到原有的链3’一末端核糖的3’－OH基上形成磷酸二酯键的，这就是复制的方向性。由于DNA双螺旋的两股链走向相反，因此复制时也按相反走向各自按模板链指引合成新链。

                            二、DNA聚合酶

    DNA聚合酶的全称是依赖 DNA的 DNA聚合酶（DNA－dependent DNA polymerase），可缩写为DNA-pol。1958年，A．Kornberg在大肠杆菌中发现了这种酶，并在100kg的细菌沉渣中提纯出仅0.5g的DNA聚合酶。在试管内的实验还证实，加有模板、底物和引物，DNA聚合酶可催化新链DNA的生成。在双螺旋模型确立后不久，又直接证明DNA是可复制的，这是一个具有重大意义的发现。当时曾把这种酶称为复制酶（replicase），以后随着其他种类DNA聚合酶的发现，这种最先发现的酶就称为DNA－pol I。

    （一）原核生物的DNA聚合酶

    大肠杆菌（E．coli）有很多变异株，经过人工处理和筛选，可以培育出来一个或某几个基因发生变异的菌株。在发现DNA－pol I的基础上，又找到了DNA－pol I基因有缺陷的菌株，照样可进行 DNA复制。从这些变异菌株中相继提取到 DNA－po1II和 DNA－pol III。现在已知的原核生物DNA－pol就是这三种。

    按每个细胞内分子个数比，DNA-pol I，II，III，的比例为400：40：20。可是DNA-polIII

的比活性大于DNA-pol I 10倍以上，每分钟能催化多至105个核苷酸的聚合，据此认为，在原核生物细胞内，DNA-polIII是在复制延长中真正催化新链核苷酸聚合的酶。

DNA-polIII的分子量约为 140kD，是由10种亚基组成的不对称二聚体（图 10－5A）。其中，α，ε，θ组成核心酶，兼有核苷酸的聚合和核酸链的 3’   5’外切酶活性。两边的β亚基起着夹住模板链又能使酶沿模板链滑动的作用。其余的亚基统称为γ-复合物，每一亚

基的具体功能尚在研究中。

    DNA－pol II只是在无pol I及 pol III的情况下才起作用，其真正的功能也未完全清楚。

    DNA一pol I是单一肽链的大分子，分子量为109kD，其二级结构以a-螺旋为主，可划分为从A至R共18个a一螺旋肽段（图11-5B）。螺旋肽段之间由一些非螺旋结构的短肽连接。其中H区与I区之间的无规结构较长，由50个氨基酸残基构成，在图中未表示出来。I螺旋与O螺旋之间有较大的空隙，可以容纳DNA链，而50个氨基酸的无规结构，就像一个盖子那样共同把DNA链包围起来，使其向一个方向滑动。 DNA－pol I只能催化延长约20个核苷酸左右，这也说明它不是真正在复制延长过程中起作用的酶。

DNA－pol I在活细胞内的功能，主要是对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现

的空隙进行填补。

用特异的蛋白酶，可以把DNA-pol I水解为两个片段，即在图11－5（B）的F，G螺旋之间发生断裂。从A至F螺旋区共323个氨基酸残基，称为小片段，此片段有5’   3’

核酸外切酶活性。从G螺旋区直至R螺旋区及C末端，共604个氨基酸残基，称为大片段，或称 klenow大片段（Klenow fragmentt），具有 DNA聚合酶活性和 3’、  5’核酸外切酶活性。DNA-pol I的大片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究的常用工具酶。

   （二）真核生物的DNA聚合酶

    真核生物 DNA聚合酶现已发现至少有 5种，分别称为 DNA-pol a，β，γ，δ，ε。

DNA－pol a和δ，都是在复制延长中起催化作用的。在活细胞内的实验证明，DNA－pol a

只能延长数百个核苷酸，而 DNA-pol δ可延长的新链却长得多。据此认为：DNA-pol δ是延长领头链而pol a则是延长随从链的（见第三节）。  DNA-polε。则与原核生物的 DNA-polI相似，在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。DNA－polβ也只是在没有其他DNA-pol时才发挥催化功能。

    真核生物的 DNA－polγ在线粒体内。 50年代以前，只知道 DNA存在于细胞核染色