中国医学科学院北京协和医学院病原生物学研究所 国家卫生健康委员会病原系统生物学重点实验室，北京 100176
收稿日期：2021-02-20；接收日期：2021-03-27；网络出版时间：2021-05-06
基金项目：国家自然科学基金(Nos. 32000080，31870108，32070081)，北京自然科学基金(No. 5192019)，中国医学科学院医学创新工程(No. 2016-I2M-1-013)，中国医学科学院基本科研业务费(Nos. 2017PT31049，2018PT51009，2018PT31012) 资助
摘要：发光杆菌是一种来自肠杆菌科的革兰氏阴性细菌，一般情况下与昆虫或线虫共生。除了作为昆虫病原体的角色，一种名为非共生发光杆菌(Photorhabdus asymbiotica，Pa) 的物种在世界各地能引起人体组织的感染。然而，这种跨界感染的分子机制目前尚未有深入研究。本论文通过探究非共生发光杆菌毒力装置(PVC) 对于真核细胞的影响，对其感染机制进行阐释。首先，RNA测序和qPCR等研究数据表明，在PVC处理的哺乳动物巨噬细胞中，NF-κB和MAPK通路被强烈激活。进而本研究在细胞水平通过Western blotting等方法对PVC处理引起的MAPK信号通路激活的现象进行多重验证。NF-κB活性的检测以及p65蛋白核移位的实验结果证实了巨噬细胞经PVC处理后产生的NF-κB活化作用。此外，PVC处理早期也能促进巨噬细胞对细菌的吞噬作用，而细胞骨架聚合抑制剂能抑制这种吞噬作用。结果表明，PVC通过激活NF-κB和MAPK信号通路参与细菌对巨噬细胞的侵染作用，这将为分析Pa在人类感染中的致病性提供新的思路。
关键词：非共生发光杆菌非共生发光杆菌毒力装置巨噬细胞胞吞作用信号通路
Photorhabdus virulence cassette promotes bacterial invasion into macrophages by activating NF-κB and MAPK signaling pathway
Xia Wang, Jiawei Shen, Haoxiang Su, Liguo Liu, Feng Jiang
NHC Key Laboratory of Systems Biology of Pathogens, Institute of Pathogen Biology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100176, China
Received: February 20, 2021; Accepted: March 27, 2021; Published: May 6, 2021
Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 32000080, 31870108, 32070081), the Beijing Natural Science Foundation, China (No. 5192019), the CAMS Innovation Fund for Medical Sciences, China (No. 2016-I2M-1-013), the Non-Profit Central Institute Fund of Chinese Academy of Medical Sciences, China (Nos. 2017PT31049, 2018PT51009, 2018PT31012)
Corresponding author: Feng Jiang. Tel: +86-10-67877731; E-mail: jiangf@ipbcams.ac.cn.
Abstract: Photorhabdus is a Gram-negative bacterium from the family Enterobacteriaceae that lives in a symbiotic association with nematode or insects. In addition to the role of being insect pathogens, one species called Photorhabdus asymbiotica (Pa) causes human infection around the world. Nevertheless, how does this transkingdom infection occur remains elusive. Here we focus on one pathogenic determinant called Photorhabdus virulence cassette (PVC) that is founded in the Pa genome and many other pathogens. The RNA-seq and qPCR data showed that the NF-κB and MAPK pathways were drastically activated in the PVC-treated mammalian macrophages. Western blotting assays using samples treated with various inhibitors of the affected pathways confirmed the results we have observed for MAPK pathway previously. p65 translocation assays validated the NF-κB activation in the macrophages after PVC treatment. Moreover, the bacterial phagocytosis by macrophage was also promoted by PVC at the early stage, and this phagocytosis was inhibited by cytoskeleton inhibitors. Thus, the results indicated that PVC is involved in the bacterial invasion by activating NF-κB and MAPK signaling pathway, providing a new perspective for analyzing the pathogenicity of Pa in human infections.
Keywords: Photorhabdus asymbioticaPhotorhabdus virulence cassettemacrophagephagocytosissignaling pathway
自然界中的微生物在进化过程中获得了多种多样的分子机制，使其在复杂的生物环境中得以生存。其中，可伸缩注射系统(Contractile injection systems，CISs) 便是微生物适应环境生存竞争的“武器”之一，该系统可以帮助微生物将多种效应分子转运至胞外以使其获得生存优势[1]。其中细菌六型分泌系统(Type Ⅵ secretion system，T6SS) 是当前研究比较深入的CISs之一，其结构、装配和作用机制均已得到详尽的阐释[2]。
此外，在细菌和古细菌中还发现有一种细胞外CISs (Extracellular CISs，eCISs)，eCISs自身可被释放至胞外并发挥作用。作为一种重要的eCIS，发光杆菌属(Photorhabdus spp.) 中的毒力装置Photorhabdus virulence cassette (PVC) 已经被证明可以作用于真核细胞并将效应蛋白注射至昆虫血细胞中，并且对昆虫细胞产生毒性[3-4]。随着研究的深入，PVC的结构和功能越来越引起国际同行的兴趣。
2019年本课题组报道了非共生发光杆菌Photorhabdus asymbiotica ATCC43949中PVC的装置结构，其中部分区域的最高分辨率达到了2.9 ? ，并且对其组装机制进行了深入的研究[5]。此后又对Pvc基因簇下游RRSPPa基因编码蛋白在真核生物中的功能进行了详尽的阐释[6]。在此基础上，课题组进一步对PVC装置自身在真核生物中的功能展开探究。本研究首先通过PVC对巨噬细胞转录水平的影响探寻相关线索，初步推测PVC与巨噬细胞中真核细胞中的核因子kappa B (Nuclear factor kappa B，NF-κB) 和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路的激活相关。NF-κB/MAPK信号通路广泛参与多种动物组织细胞的炎症反应、细胞凋亡等基因转录的调节过程，当细胞受到外来因素刺激时(如脂多糖、细菌微生物感染、组织损伤等)，该信号通路被激活为有活性的二聚体形式，调节靶基因的表达，最终调控炎症反应[7-8]。
本研究从多个方面对PVC的功能进行探究，发现PVC可激活巨噬细胞中的NF-κB/MAPK信号通路，进而促进巨噬细胞的胞吞能力，初步揭示了PVC在真核中的作用机制，为进一步的研究和应用奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞系和菌株鼠源巨噬细胞RAW264.7为本实验室长期保存；NF-κB活性报告细胞(Raw and THP-1 Dual，IRF-Lucia and MIP-2-SEAP macrophage reporter cell line) 购自Invivogen公司。发光杆菌Pa ATCC43949和大肠杆菌DH5α均为本实验室保存菌株。
1.1.2 实验试剂分子生物学试剂：分子克隆所用DNA聚合酶、DNA内切酶、连接酶购自Fermentas公司；PCR产物回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、RNA逆转录试剂盒及qPCR试剂盒购自QIAGEN公司；RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司。
细胞生物学试剂：DMSO、RPMI 1640、胰酶、抗生素均购自Hyclone公司；胎牛血清购自Gibco公司；细胞胞浆/细胞核分离试剂盒购自华兴博创公司；大肠杆菌BioParticles?细胞吞噬结合物试剂盒购自Invitrogen公司；细胞松弛素D购自Sigma公司。
抗体：兔抗p-IKKαβ抗体、兔抗IKKα抗体、兔抗IKKβ抗体、兔抗IκBα抗体、兔抗p-NF-κB p65抗体、兔抗NF-κB p65抗体、兔抗GAPDH抗体购自Cell signaling technology公司；HRP标记的山羊抗兔的二抗购自华兴博创公司。
抑制剂：MEK的抑制剂Trametinib、TAK1的抑制剂NG25、p38的抑制剂SB203580和JNK的抑制剂SP600125均购自MCE公司。
1.2 实验方法1.2.1 细胞培养巨噬细胞培养于添加10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞生长至70%密度时，使用PVC对其进行处理。
1.2.2 PVC的表达、纯化及鉴定将表达有PVC基因簇的E. coli在30 ℃培养24 h，收集并裂解菌体，后使用分步超速离心收集PVC复合物。随后将收集到的PVC溶液与购自JNC公司的Cellufine ET Clean L凝胶室温混匀2 h后离心，以去除PVC溶液中的残余内毒素。然后将纯化后的PVC进行负染色及电镜观察，将收集到的PVC复合物置于载网，负染后进行电镜观察并收集数据。
1.2.3 RNA-seq以及qRT-PCR的验证使用纯化后的PVC装置处理鼠源巨噬细胞RAW264.7，处理时间为2 h，同时以未处理组作为对照，通过高通量测序分别测定巨噬细胞的转录组。然后针对转录组结果中出现明显表达上调的基因设计引物进行qRT-PCR，以对高通量结果进行进一步验证。
1.2.4 Western blotting首先将PVC处理后的巨噬细胞RAW264.7及U937使用RIPA裂解液裂解细胞并提取细胞的总蛋白，BCA试剂盒测定各组样品蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液煮沸备用。蛋白经10% SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，BSA封闭后分别使用关键蛋白的抗体和磷酸化抗体作为一抗。该实验中分别使用兔抗p-IKKαβ抗体、兔抗IKKα抗体、兔抗IKKβ抗体、兔抗IkBα抗体、兔抗NF-κB p65抗体、兔抗GAPDH抗体等为一抗，HRP标记的山羊抗兔的二抗进行检测。
1.2.5 细胞核质分离使用PVC处理细胞后，使用细胞胞浆/细胞核分离试剂盒进行胞浆和细胞核的提取和分离，然后通过Western blotting实验分别测定全细胞、胞浆、细胞核中p65和Lamin B1的含量。
1.2.6 巨噬细胞核移位的测定将巨噬细胞接种于玻底培养皿中，待长到适当浓度后使用PVC处理细胞，同时以无处理组为对照，2 h后使用4%多聚甲醛室温固定30 min，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS) 洗涤，加兔抗人NF-κB p65多克隆抗体，4 ℃孵育过夜，PBS洗3次。然后加入稀释的山羊抗兔TRITC IgG (二抗)，37 ℃暗湿盒中温育1 h，PBS洗3次，加入稀释的DAPI染细胞核，PBS洗3次，随后置于Leica共聚焦显微镜下观察，最后用ImagJ定量软件观察和测定细胞内荧光的变化。
1.2.7 NF-κB转录激活测定使用PVC溶液处理带有NF-κB启动子的巨噬细胞RAW264.7 Dual及THP-1 Dual (处理时间分别为15 min、30 min)，以无处理组为对照，通过检测细胞上清培养液中的分泌型碱性磷酸酶活性来确定NF-κB启动子的激活情况。
1.2.8 巨噬细胞胞吞能力的检测使用PVC装置处理巨噬细胞(处理时间分别为2 h和4 h)，以无处理组为对照，使用大肠杆菌BioParticles?细胞吞噬结合物试剂盒完成巨噬细胞胞吞作用的检测，并拍摄相应时间的显微图片。
2 结果与分析2.1 成熟PVC颗粒的表达纯化及生物信息学分析以非共生发光杆菌的基因组(图 1A) 为模板，并利用CATCH方法构建的质粒pCNM3[5, 9]转入大肠杆菌EPI300菌株中。然后经过富集裂解菌体和超速离心等步骤得到纯化的成熟PVC颗粒，并经过负染电子显微镜进行样品观察，确定得到了正确的PVC蛋白溶液(图 1B)。随后，本研究对PVC的一个关键组分外鞘蛋白Pvc2及其类似蛋白进行了生物信息学分析，从多个包括PVC、AFP、T6SS、R-type pyocin和T4噬菌体等结构的相应组分进行分析发现，PVC与R-type pyocin具有更接近的进化上的关系，而与T4噬菌体的进化关系更远(图 1C)。
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| 图 1 PVC基因簇示意图(A) 成熟结构(B) 及与类似结构的进化关系(C) Fig. 1 Gene locus of PVC cluster (A) in Pa chromosome, matured PVC particles (B) and its evolutionary relationship with other similar structures (C). P. asymbiotica: Photorhabdus asymbiotica; S. entomophila: Serratia entomophila; P. aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa; V. cholerae: Vibrio cholerae; T6SS: type 6 secretion system. |
| 图选项 |
2.2 PVC颗粒对巨噬细胞信号通路的影响使用纯化的PVC蛋白溶液刺激培养的小鼠巨噬细胞RAW264.7后，提取相应细胞的总RNA并反转录成cDNA进行RNA转录组检测。同时提取未被处理的细胞(UT，untreated) 总RNA作为对照。结果显示，PVC能显著提高巨噬细胞内MAPK和NF-κB信号通路的细胞因子转录水平，其中fos、tnf、jun及nfkbia等基因的表达上调更为明显(图 2A)。为了更进一步确定相应基因的表达情况，随后用qRT-PCR对反转录得到的cDNA进行了进一步的检测。结果表明在PVC处理的细胞组中，il1b、fos、tnf、jun及nfkbia等基因的转录本数量的确发生了十分明显的上升(图 2B)，这就更确定了之前在RNA-seq中所得到的结论。
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| 图 2 PVC处理小鼠巨噬细胞RAW264.7前后转录组变化 Fig. 2 PVC activates NF-κB and MAPK pathways in RAW264.7 macrophages. (A) Volcano plot of transcriptional changes in PVC-treated versus PVC-untreated RAW264.7 cells. (B) qRT-PCR verification of the activated transcripts in (A). UT: untreated. |
| 图选项 |
2.3 PVC颗粒提高MAPK及NF-κB通路细胞因子的磷酸化水平一般来说，许多蛋白激酶的磷酸化是信号通路激活的重要指标。其中Erk1/2、JNK1/2/3及p38蛋白是MAPK通路的关键蛋白激酶，而IKK及IκBα则在NF-κB通路中扮演了重要的角色。为了进一步检测PVC是如何影响MAPK和NF-κB信号通路的，本研究对相关信号通路的上述关键蛋白激酶的磷酸化水平进行了Western blotting检测。结果表明，在RAW264.7细胞中，MAPK通路的Erk1/2、JNK1/2/3及p38蛋白的磷酸化水平在PVC处理后都得到了较大的提高，而它们的总蛋白水平基本没有变化(图 3A)。同样地，IKK和IκBα蛋白的磷酸化水平也显著上升，并且总IκBα蛋白在PVC处理初期发生了下降，这都提示了PVC对NF-κB信号通路的激活作用。本研究随后选取人类的巨噬细胞U937进行了类似的实验，并得到了和小鼠巨噬细胞中相近的结果(图 3B)。因此，本研究认为PVC是通过提高MAPK和NF-κB途径中关键蛋白激酶的磷酸化水平来激活相应的信号通路。
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| 图 3 PVC上调MAPK和NF-κB信号通路的磷酸化水平 Fig. 3 Activation of PVC on the MAPK and NF-κB signaling pathways in macrophages. (A) The RAW264.7 cells were pretreated with PVC for the indicated time and Western blotting was performed to detect the phosphorylated and total proteins. (B) Similar experiments were performed as in (A) and the protein expression was detected in U937 cells. |
| 图选项 |
2.4 抑制剂处理进一步验证PVC在巨噬细胞NF-κB/MAPK信号通路中的功能在初步确定PVC对NF-κB/MAPK信号通路的激活作用之后，为了进一步验证PVC的作用并探寻PVC在该通路中的具体作用位点，本研究分别在细胞培养基中加入MAPK信号通路靶点的抑制剂，进而使用PVC处理，检测通路中关键蛋白的总体水平和磷酸化水平。使用MEK的抑制剂Trametinib、TAK1的抑制剂NG25、p38的抑制剂SB203580和JNK1/2/3的抑制剂SP600125分别处理细胞，然后检测NF-κB/MAPK信号通路的情况。结果如图 4所示，使用MAPK通路关键蛋白激酶抑制剂处理细胞后，PVC对ERK、p38、JNK的激活被抑制，这验证了PVC对MAPK通路的激活作用。而经典的NF-κB通路关键蛋白IκBα的磷酸化水平也受到NG25抑制剂的影响，这表明该信号途径同样受到了PVC的作用。
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| 图 4 多种抑制剂处理后MAPK和NF-κB信号通路的变化 Fig. 4 Comparison of the protein expression changes in the MAPK and NF-κB pathways after treatments with diverse inhibitors. |
| 图选项 |
2.5 PVC可促进巨噬细胞中p65蛋白的核移位并提高NF-κB的活性基于p65蛋白的核移位是NF-κB信号通路激活的主要方式之一，本研究在细胞水平检测了PVC对巨噬细胞中p65核移位的影响。分别对无处理组和PVC组细胞进行胞浆和细胞核的分离，然后通过Western blotting检测PVC处理后p65在细胞胞浆和细胞核中蛋白量的变化。实验结果表明(图 5A)，无处理组细胞中p65蛋白主要存在于细胞胞浆中，而PVC组细胞中p65蛋白出现了明显的核转移现象。该结果初步表明，PVC可促进细胞中p65的核移位，进而激活NF-κB信号通路。
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| 图 5 p65蛋白核转移情况检测 Fig. 5 p65 translocation assays after PVC treatment. (A) The cytosol and nucleus of RAW264.7 cells were separated and the relevant proteins were detected. (B–C) The NF-κB activities were tested in PVC-treated RAW264.7 and THP-1 carrying NF-κB promoter. (D) Confocal microscopy observation of the p65 translocation into RAW264.7 nucleus after PVC treatment. (E) The activated cells (p65 in nucleus) in (D) were calculated. ***:P < 0.001. |
| 图选项 |
本研究进而使用PVC处理NF-κB活性报告细胞(Dual IRF-Lucia、MIP-2-SEAP murine macrophage reporter cell line)，并通过测定荧光素酶分泌型碱性磷酸酶(Secreted alkaline phos phatase，SEAP) 强度来确定细胞内NF-κB的活性。实验结果表明(图 5B-C)，与无处理组相比，PVC处理后巨噬细胞RAW264.7 Dual和THP-1 Dual内NF-κB的活性显著提高，这进一步确定了PVC对细胞NF-κB信号通路的激活。本研究同时还进行了共聚焦显微镜的观测，相应结果验证了PVC细胞中p65的核移位现象(图 5D–E)。
2.6 PVC可促进巨噬细胞的胞吞作用细胞的胞吞是细胞将细胞外基质、病毒、微组织或纳米粒子运送到细胞内部的一个重要生理过程。本研究首先使用PVC装置处理巨噬细胞(处理时间分别为2 h和4 h)，或者TAK1 (控制NF-κB/MAPK信号通路的蛋白激酶) 的抑制剂NG25，与无处理组对照检测细胞胞吞作用的变化。此外，作为肌动蛋白聚合抑制剂，细胞松弛素D (Cytochalasin D，Cyto D) 可抑制巨噬细胞的胞吞作用，因此使用Cyto D处理细胞作为对照进一步验证PVC对巨噬细胞胞吞作用的影响。结果表明(图 6A)，PVC处理2 h和4 h后，巨噬细胞胞内荧光强度均显著高于无处理组，而加入NG25或者Cyto D后无论是否进行PVC处理其荧光强度均低于无处理组，这表明PVC可促进巨噬细胞的胞吞能力，而这种能力是通过激活NF-κB/ MAPK信号通路而实现的。进而使用荧光显微镜对巨噬细胞进行观测(图 6B)，结果表明，PVC组(PVC处理2 h) 细胞的荧光亮度显著高于无处理组、NG25组和Cyto D组，这进一步验证了PVC对于细胞胞吞能力的促进作用。
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| 图 6 巨噬细胞吞噬功能比较分析 Fig. 6 PVC treatments promote bacterial phagocytosis by RAW264.7 macrophage. (A) The phagocytosis of E. coli by macrophages treated with PVC for 2 h and 4 h. (B) The representative pictures of 2 h samples in (A). Bar 50 μm. Cyto D: cytochalasin D. ***: P < 0.001. |
| 图选项 |
3 讨论作为一种eCIS，PVC已被证明可将效应蛋白转运至真核细胞中发挥毒力作用，而PVC本身对于真核细胞的影响目前尚无报道，本课题将针对这一科学问题进行深入探究。
近年来关于细菌分泌系统对NF-κB/MAPK信号通路的影响也引起了国际上的广泛关注。研究表明，类鼻疽伯克氏菌Burkholderia pseudomallei可通过细菌的三型分泌系统(Type Ⅲ secretion system，T3SS) 激活真核细胞HEK293T中的NF-κB信号通路[10]；此外MAPK通路被证明可调控多种动物个体发育的变态过程[11-12]，P. luteoviolacea即可通过其eCIS (即MAC装置) 调控激活华美盘管虫Hydroides elegans中的MAPK信号通路，进而影响其发育变态的过程[13]。本研究通过PVC对巨噬细胞转录水平的影响探寻相关线索，初步推测PVC与细胞中NF-κB/MAPK信号通路的激活相关。进而在细胞水平从多个方面对该假设进行验证，随后对PVC是否可通过NF-κB/MAPK信号通路影响巨噬细胞的胞吞能力进行探究，为深入研究PVC在真核生物中的功能提供了可靠的线索和思路。
先前有研究表明，细胞外刺激物可通过NF-κB/ MAPK信号通路促进巨噬细胞的胞吞作用[14-15]。在本研究中也发现，PVC的刺激可促进巨噬细胞的胞吞能力，并且其分子机制与NF-κB/MAPK信号通路有关。鉴于目前在国际上尚无关于PVC装置自身与真核细胞相互作用机制的相关报道，而此前有研究表明P. asymbiotica可以被巨噬细胞所吞噬，随后在细胞内复制并诱导宿主细胞凋亡[16]。此外，还有研究表明使用P. luteoviolacea中的MAC装置处理鼠巨噬细胞J774A.1后会导致巨噬细胞的死亡[17]。基于以上研究基础，本课题首先选择小鼠单核巨噬细胞RAW264.7作为PVC与真核细胞作用的研究对象。在哺乳动物中，巨噬细胞是维持宿主稳定的主要功能细胞，通过增强免疫应答对宿主的感染作出反应。研究表明，细菌侵染能诱导巨噬细胞发生明显的表型变化，分泌大量的炎性因子和介质，激活一系列的细胞信号通路。因此研究PVC对于巨噬细胞的功能具有重要意义。在后续的工作中，本课题组还将在其他真核细胞系中(包括人外周血单核细胞系THP-1、人宫颈癌细胞HeLa、人肾上皮细胞系HEK293T等) 验证PVC对细胞作用的普遍性。此外还将利用lambda Red重组技术敲除Pa ATCC43949中Pvc1基因，以野生型菌株为对照，在细菌的生理水平从各个方面检测NF-κB/MAPK通路的变化，如NF-κB的活性、NF-κB/MAPK通路关键节点蛋白的变化以及PVC的敲除对巨噬细胞胞吞能力的影响等。
综上所述，本研究首先通过转录组学的研究发现PVC与巨噬细胞中NF-κB/MAPK信号通路的激活相关，进而在细胞水平从多个方面进行验证，包括确定MAPK信号通路的关键蛋白的变化，通过抑制剂处理验证PVC在NF-κB/MAPK信号通路中的功能，以及PVC对NF-κB活性以及核移位的影响。此外，本研究还发现PVC可通过NF-κB/MAPK信号通路影响巨噬细胞的胞吞能力。本研究初步揭示了PVC在真核细胞中的作用机制，研究表明PVC不仅可以作为一种转运装置将效应蛋白注射于真核细胞中，其装置自身对于真核细胞也有重要的影响，这丰富了对PVC及其作用机制的认识，为致病性细菌的预防和干预治疗提供参考。鉴于CISs在微生物中的广泛存在，本研究为CISs介导的细菌-真核生物相互作用提供了新的研究思路和基础。
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