1. 华南农业大学 动物科学学院 国家生猪种业工程技术研究中心，广东 广州 510642;
2. 温氏食品集团股份有限公司，广东 新兴 527439
收稿日期：2020-10-27；接收日期：2021-02-05；网络出版时间：2021-02-22
基金项目：广东省“珠江人才计划”本土创新科研团队项目(No. 2019BT02N630) 资助
摘要：近年来，基于成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas) 的基因编辑技术飞速发展，该系统可以利用同源定向重组(Homology directed repair，HDR) 来完成其介导的精准编辑，但效率极低，限制了其在农业和生物医学等领域上的推广应用。基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑技术作为一种新兴的基因组编辑技术，能在不产生双链断裂的情况下实现碱基的定向突变，相对于CRISPR/Cas介导的HDR编辑具有更高的编辑效率和特异性。目前，已开发出了可将C碱基突变为T碱基的胞嘧啶碱基编辑器(Cytidine base editors，CBE)，将A碱基突变为G碱基的腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editors，ABE)，以及可实现碱基任意变换和小片段精准插入和缺失的Prime编辑器(Prime editors，PE)。另外，能实现C到G颠换的糖基化酶碱基编辑器(Glycosylase base editors，GBE) 以及能同时编辑A和C两种底物的双碱基编辑器也已被开发出来。文中主要综述了几种DNA碱基编辑器的开发历程、研究进展及各自优点和局限性；介绍了DNA碱基编辑技术在生物医学以及农业中的成功应用案例，以期为DNA碱基编辑器的进一步优化和选择应用提供借鉴。
关键词：CRISPR/Cas碱基编辑胞嘧啶碱基编辑器腺嘌呤碱基编辑器Prime编辑器
CRISPR/Cas-mediated DNA base editing technology and its application in biomedicine and agriculture
Chuanzhao Yu1, Jianxin Mo2, Xin Zhao1, Guoling Li1, Xianwei Zhang2
1. National Engineering Research Center for Swine Breeding Industry, College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China;
2. Wens Foodstuff Co., Ltd., Xinxing 527439, Guangdong, China
Received: October 27, 2020; Accepted: February 5, 2021; Published: February 22, 2021
Supported by: Local Innovative and Research Teams Project of Guangdong Pearl River Talents Program, China (No. 2019BT02N630)
Corresponding author: Xianwei Zhang. Tel/Fax: +86-766-2986345; E-mail: zxianw@163.com.
Abstract: In recent years, the genome editing technologies based on the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein (CRISPR/Cas) have developed rapidly. The system can use homologous directed recombination (HDR) to achieve precise editing that it medicated, but the efficiency is extremely low, which limits its application in agriculture and biomedical fields. As an emerging genome editing technology, the CRISPR/Cas-mediated DNA base editing technologies can achieve targeted mutations of bases without generating double-strand breaks, and has higher editing efficiency and specificity compared with CRISPR/Cas-mediated HDR editing. At present, cytidine base editors (CBEs) that can mutate C to T, adenine base editors (ABEs) that can mutate A to G, and prime editors (PEs) that enable arbitrary base conversion and precise insertion and deletion of small fragments, have been developed. In addition, glycosylase base editors (GBEs) capable of transitioning from C to G and double base editors capable of editing both A and C simultaneously, have been developed. This review summarizes the development, advances, advantages and limitations of several DNA base editors. The successful applications of DNA base editing technology in biomedicine and agriculture, together with the prospects for further optimization and selection of DNA base editors, are discussed.
Keywords: CRISPR/Casbase editingcytidine base editorsadenine base editorsprime editors
成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas)是细菌和古菌抵抗外源病毒和噬菌体入侵的一种适应性免疫机制，通过靶向切割外源入侵核酸发挥免疫防御作用[1]。基于该系统，研究者构建了CRISPR/Cas基因编辑工具，并在基础研究中广泛应用[2]。CRISPR/Cas基因编辑系统的工作原理为：在单链向导RNA (Single guide RNA，sgRNA)引导下，Cas蛋白在靶位点引起双链断裂(Double-stranded DNA break，DSB)，DSB激活细胞内源的非同源末端链接(Non-homologous end joining，NHEJ) 通路或者同源定向重组(Homology-directed repair，HDR) 通路修复DSB缺口，从而实现对靶位点的编辑，NHEJ通路容易引入插入/缺失(Insertions/deletions，Indels) 突变，HDR通路可介导目标位点的精准编辑[3-4]。在自然条件下，NHEJ通路在DSB缺口引入Indels具有随机性，无法实现定向编辑，而HDR介导的精确编辑效率极低，筛选基因编辑细胞系的难度较大[5-6]。基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑技术，将灭活的或有单链切割活性的Cas蛋白与碱基脱氨酶或者逆转录酶融合，可在不引入DSB的情况下实现碱基的定向编辑，突破了传统CRISPR/Cas基因编辑系统的限制，极大地提高了精准基因编辑效率和编辑特异性，是加速动植物遗传改良进程和推动基因治疗临床应用的强大工具[7-10]。目前能实现DNA碱基编辑的编辑器主要有3种，分别是胞嘧啶碱基编辑器(Cytidine base editors，CBEs)、腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editors，ABEs) 和Prime编辑器(Prime editors，PEs)，它们分别可以实现C到T (G到A)、A到G (T到C) 以及任意碱基的替换[7-8, 10]。最近，在CBEs和ABEs的基础上，研究者们开发出了能同时编辑A和C两种底物的双碱基编辑器(SPACE、Target-ACEmax、A & C-BEmax)；另外，在CBEs的基础上，研究者们开发出了能实现C到G颠换的糖基化酶碱基编辑器(GBE、CGBE1)，进一步丰富了DNA碱基编辑工具包[11-16]。DNA碱基编辑器发挥作用时不会产生DSB，限制了随机的Indels产生，在生物医学以及农业育种领域显示出巨大的应用前景，然而，脱靶编辑、原间隔序列邻近基序(Protospacer adjacent motif，PAM) 兼容性、编辑窗口内副产物的产生以及安全性问题限制了DNA碱基编辑器的推广应用。文中就DNA碱基编辑技术的最新研究进展进行了综述，以期为DNA碱基编辑技术的进一步优化及其在生物医学和农业领域的推广应用提供借鉴。
1 基于CRISPR/Cas系统DNA碱基编辑器的开发1.1 CBEs的开发CBEs是最先被开发出基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑器，2016年，由Komor等[7]将鼠源的胞嘧啶脱氨酶(Apolipoprotein B mRNA editing enzyme，catalyticpolypeptide-like，APOBEC1) 融合到CRISPR/Cas9系统构建所得。CBEs的编辑原理为：sgRNA与靶位点的互补链结合发挥定位功能，APOBEC1以靶位点上sgRNA的非互补链为底物在PAM序列上游13–17 bp区域内催化C碱基突变为尿嘧啶(U)，在DNA复制过程中U被识别为A，使目标碱基C突变成A，从而实现C→A的定向突变。
Komor等[7]通过16个氨基酸残基的XTEN连接肽把APOBEC1融合到失去内切核酸酶活性的Cas9蛋白(dCas9) N末端，构建得到第一代CBE，并将其命名为BE1。BE1的编辑效率极低，在人H293T细胞中的编辑效率仅有0.8%?7.7%。Komor等[7]推测，BE1编辑活性低可能与细胞内的DNA修复机制有关，目标碱基C突变为U后容易激活细胞内的DNA切除修复通路，导致U碱基被尿嘧啶DNA糖苷酶(Uracil DNA glycosylases，UDGs) 切除[17]。据此，Komor团队将尿嘧啶DNA糖苷酶抑制因子(Uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI) 融合在BE1中dCas9的C末端，形成了第二代CBEs，并命名为BE2。UGI有效抑制了UDG的活性，使编辑效率提高了3倍[7]。为了进一步提高编辑效率，他们将BE2中的dCas9替换成了具有单链切割活性的nCas9，nCas9可在非编辑链引入切刻，创造了一个以编辑链为模板修复非编辑链的环境，开发出了第三代CBEs(BE3)[7] (图 1A)。BE3的编辑活性较BE2大幅提高，在人H293T细胞中的编辑效率达到了37%[7]。几乎同时，Nishida等[9]也单独开发出一种名叫Target-AID的CBE，并且能够在酵母细胞和哺乳动物细胞中实现有效的编辑。Target-AID与BE3有所不同，Target-AID所用的胞嘧啶脱氨酶来自七鳃鳗，并且UGI和七鳃鳗来源的脱氨酶(PmCDA1) 都连接在dCas9或nCas9的C末端。BE3和Target-AID这两种最初的胞嘧啶碱基编辑器被开发出来后，研究者们通过更换新型Cas蛋白和脱氨酶、优化Cas蛋白与脱氨酶间的连接子、添加多个拷贝的UGI等方式先后开发出了各种不同的CBEs[18-19]。尽管各种CBEs分别在编辑效率、可编辑范围以及脱靶编辑等方面得到了不同程度的改善，但其只能介导C到T的替换，这限制了CBEs的应用范围。
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| 图 1 BE3[7]、ABE7.10[8]、SPACE[13]、GBE[16]和PE3[10]的工作原理图 Fig. 1 Mechanisms of BE3[7], ABE7.10[8], SPACE[13], GBE[16] and PE3[10]. (A) Under the action of cytosine deaminase and UGI, the BE3 system deaminases the C in the active window at the target site into U, and achieve C to T mutation after DNA repair. (B) Under the action of adenine deaminase, the ABE7.10 system deaminates A in the active window at the target site into I, and mutates A to G after DNA repair. (C) Under the action of adenine deaminase, cytosine deaminase and UGI, SPACE system simultaneously deaminates C into U and A into U in the active window at the target site, and achieve mutations of C to T and A to G simultaneously after DNA repair. (D) Under the action of cytosine deaminase and UNG, the GBE system deaminates the C in the active window at the target site into U, and achieve C to G mutation after DNA repair. (E) The PE3 system, under the action of reverse enzyme, install the base sequence in the reverse transcription template into the target site, and achieve arbitrary base conversion and precise insertion and deletion of small fragments after DNA repair. |
| 图选项 |
1.2 ABEs的开发在人类致病点突变中由碱基对A-T到G-C突变的只有14%，而碱基对C-G到T-A突变的有48%，所以能将碱基对A-T定向突变为G-C的ABEs相对于CBEs更具应用前景[8]。2017年，Gaudelli等[8]将腺嘌呤脱氨酶融合到CRISPR/Cas9系统中，研发得到ABEs，实现了碱基对A-T到G-C的定向突变。ABEs的工作原理与CBEs相似，在CRISPR/Cas9系统的引导下，腺嘌呤脱氨酶将目标碱基A突变为肌苷(I)，在DNA复制过程中I被识别为G并与C配对，从而使碱基对A-T突变为G-C。
目前在自然界中只发现作用于游离腺嘌呤、游离腺苷酸、RNA中的腺苷酸、以及RNA与DNA异源二聚体中的腺苷酸脱氨酶，没有发现作用于DNA上腺嘌呤的脱氨酶，因此相较于CBEs，ABEs的开发更为复杂[20]。Gaudelli等[8]以大肠杆菌源的tRNA腺苷酸脱氨酶ecTadA作为改造对象，将ecTadA与nCas9融合，接着在ecTadA中引入随机突变构建突变体库，利用突变体库矫正氯霉素抗性基因CamR上的灭活突变，以筛选作用于DNA上A碱基的ecTadA变异体。结果发现，在TadA上携带A106V和D108N突变的大肠杆菌在氯霉素筛选培养基中大量富集。通过序列比对分析发现，氨基酸残基D108与其底物tRNA的目标碱基A上游的尿嘧啶U形成氢键，D108N突变破坏了该氢键，使TadA易于与DNA结合。将突变A106V和D108N引入ecTadA-nCas9中，构建得到了第一代ABEs (TadA*-XTEN-nCas9-NSL，ABE1.2)，但ABE1.2在HEK293T细胞中的平均编辑效率仅为3.2%。为了提高编辑活性，他们对ABE1.2进行了一系列的改造优化，最终经过7轮的改造他们得到了具有较高编辑效率的ABE7.10 (图 1B)。与ABE1.2相比，ABE7.10的编辑活性得到了极大的改善，尤其对多腺嘌呤位点具有较优表现，ABE7.10在人细胞中编辑效率达到58%，产物纯度达99%，脱靶效率低于0.1%，具有较高的编辑效率和较好的特异性[8]。
ABEs的开发为治疗由C-G到T-A突变引起的遗传病提供了可能，然而，ABEs在基因组中有限的可编辑位点、编辑效率低和脱靶编辑等问题限制了其应用。针对这些问题许多研究者在前人的基础上对ABEs进行了改造优化开发出了各种不同的ABEs。CRISPR/Cas系统与靶位点结合需要PAM序列的存在，目前广泛使用的SpCas9识别的PAM序列为NGG，然而，只有约1/4的致病性点突变在适当的位置含有NGG序列，这给相关遗传病的治疗带来了困难[21]。研究者们为了解决这一问题用不同的Cas9或Cas9变体替换SpCas9开发出了能识别不同PAM序列的ABEs，例如，能识别NG的NG-ABE，能识别NG/NAA/ NAT的xCas9-ABE以及能识别NNG的ScCas9- ABE[22-23]。虽然基于各种不同Cas9的ABEs能识别不同的PAM序列，但ABE与SpCas9以外的任何其他来源的Cas9都显示出有限的兼容性，这使其编辑效率降低。Richter等[24]利用噬菌体辅助的连续和非连续进化(PACE和PANCE) 方法，将脱氧腺苷脱氨酶的催化速率提高了590倍(与ABE7.10相比)，开发出了下一代ABEs，称为ABE8e，ABE8e与SpCas9以外的一些Cas9也显示出较好的兼容性。另外，ABEs存在的脱靶问题特别是非sgRNA依赖的RNA脱氨问题也是限制ABEs应用的主要因素。因为ABE7.10和ABEmax中包含的wtTadA是对RNA起作用的，这可能是造成ABE介导的不依赖sgRNA的RNA脱氨的因素。Rees等[25]将ABEmax中wtTadA催化位点沉默(wtTadA-E59A) 并进一步工程化eTadA* (eTadAV106W) 构建得到的ABEmax-AW表现出的RNA脱氨活性明显低于ABEmax，此外，Richter等[24]向ABE8e中引入相同的突变(V106W) 同样也减少了RNA脱氨作用。
1.3 双碱基编辑器的开发CBEs和ABEs这两种DNA碱基编辑器虽然能实现精确的基因组编辑，但是，它们都只能催化单一类型的核苷酸转变，产物相对单一。最近，有3项研究介绍了一种能同时编辑C和A两种碱基的双碱基编辑器，这种双碱基编辑系统都是由nCas9与胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶融合而成，能同时使C-G和A-T转变为T-A和G-C[12-14]。双碱基编辑器的开发进一步拓宽了碱基编辑器的功能。
首先，Grünewald等[13]将先前描述的腺嘌呤碱基编辑器miniABEmax-V82G中的腺嘌呤脱氨酶和胞嘧啶碱基编辑器Target-AID中的胞嘧啶脱氨酶分别融合到nCas9的N端和C端，并融入两个拷贝的UGI，开发出了一种双碱基编辑器SPACE (图 1C)。在HEK293T细胞中，SPACE保留了碱基编辑器的碱基编辑功能，在目标位点很少产生意外的Indels，并且脱靶率也相对较低，重点是与同时表达miniABEmax-V82G和Target-AID相比，SPACE实现了更高效的双重编辑。在另一项研究中，Zhang等[12]也开发出一种名叫A & C-BEmax的双碱基编辑器，他们在ABE7.10的N端添加胞嘧啶脱氨酶hAID得到融合体ABE7.10-N-AID，然后对其进行密码子优化并添加2分子核定位信号(NLS) 生成了ABE7.10-N-AIDmax，最后在ABE7.10-N-AIDmax中添加2个拷贝的UGI得到了A & C-BEmax。A & C-BEmax与ABEmax相比A到G的编辑效率相似或略有降低，而与AID-BE4max相比C到T的编辑效率则有所提高，另外，与同时表达ABEmax和AID-BE4max相比A & C-BEmax的双重编辑率明显更高[12]。除了SPACE和A & C- BEmax之外，Sakata等[14]将胞嘧啶脱氨酶PmCDA1和腺嘌呤脱氨酶TadA与nCas9融合同样得到了双碱基编辑器Target-ACEmax。Target- ACEmax在47个被测试的基因组靶点上同样显示出较高的同时编辑碱基C和A的编辑活性[14]。
双碱基编辑器的开发解决了同时表达两个单碱基编辑器编辑效率低的问题，能实现更加复杂的碱基编辑，在校正疾病相关等位基因、遗传筛查和谱系追踪等方面有着一系列的潜在应用[26]。
1.4 GBE的开发虽然碱基对A-T到G-C以及C-G到T-A的替换能纠正大部分的点突变遗传疾病，但是仍有一部分点突变遗传疾病是由碱基颠换造成的，如G-C到C-G的颠换占到了人类疾病相关点突变的11%[8]，因此能催化C到G颠换的碱基编辑器的开发同样有着重要意义，最近，这种能催化C到G颠换的碱基编辑器也已被开发出来[15-16]。
在前期一些研究中，研究者们发现CBEs在碱基编辑过程中碱基C会随机突变为其他碱基而不是碱基T[9, 27-28]。基于此，如果正确地利用和控制此过程，C可能会特异地转换为任意碱基。Zhao等[16]研究发现，在大肠杆菌8种不同的位点CBE (nCas9-AID) 可高效地诱导C到A的颠换，并且证实该颠换是由大肠杆菌中尿嘧啶DNA糖基化酶(Uracil DNA N-glycosylase，UNG) 介导的DNA修复产生的。基于该思路，研究者对CBE进行改造，他们将原有的UGI删除掉并添加UNG构建得到GBE系统APOBEC-nCas9-Ung[16] (图 1D)。APOBEC-nCas9-Ung可在哺乳动物细胞中目标区域的C6位点高效地诱导C到G的颠换，并且该GBE系统诱导的Indel以及脱靶风险均与相关的CBE系统相近[16]。另外，Kurt等[15]通过相似的策略对CBE进行改造同样也获得了能诱导C到G颠换的碱基编辑器CGBE1，CGBE1由nCas9和大鼠APOBEC1胞嘧啶脱氨酶变体(R33A) 以及来源于大肠杆菌的尿嘧啶DNA糖基化酶(Escherichia coli-derived uracil DNA N-glycosylase，eUNG) 构成。CGBE1在人类细胞中，尤其是在富含AT的序列中能有效地诱导C到G的颠换，并且很少会造成非预期的C到W (W=A+T) 的编辑和Indel突变[15]。此外，研究人员删除了CGBE1中的eUNG得到了一种名叫miniCGBE1的编辑器，该编辑器降低了Indel的产生频率，但是略微降低了编辑效率[15]。
GBE/CGBE的开发使碱基编辑工具包又添加了新成员，进一步完善了碱基编辑系统，同时也为那些由G到C突变而引起的人类遗传疾病治疗带来了曙光。
1.5 PEs的开发CBEs和ABEs的编辑产物纯度容易受编辑窗口内目标碱基数影响，当编辑窗口存在多个目标碱基时，容易产生副产物[7-8, 29]。另外，CBEs和ABEs只实现了4种碱基替换(C→T、G→A、A→G和T→C)，无法实现碱基的任意颠换(C→A，C→T，C→G；G→A，G→T，G→C；A→T；A→C；A→G；T→A，T→G，T→C)。为了克服这些问题，Anzalone等[10]把逆转录酶与nCas9融合，并在sgRNA的3′端添加逆转录模板，研发得到的prime编辑器(PEs)，实现了碱基的随意转换和短片段的精准插入和缺失。PEs系统由逆转录酶、nCas9和pegRNA (Prime editing extended guide RNA) 构成，其中pegRNA通过在gRNA序列3′末端添加一个5–6 nt的反转录引物结合位点(Prime binding sites，PBS) 和一个7–22 nt包含编辑信息的逆转录模板构建得到(图 1E)。PEs的工作原理为：nCas9在靶位点引入切刻，切刻的3′末端与pegRNA上的PBS结合并在逆转录酶的作用下将pegRNA上逆转录模板的编辑信息复制到DNA链上，接着切刻处5′尾巴被细胞内的核酸内切酶(例如FEN1) 或者5′核酸外切酶(例如EXO1) 切除，3′尾巴在DNA连接酶的作用下整合到DNA双链上，形成由编辑链和非编辑链构成的异源DNA双链，nCas9在非编辑链上引入第二切刻，诱导细胞以编辑链为模板对非编辑链进行修复，从而实现对靶位点的精准编辑。
Anzalone研究团队将莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase，M-MLV RT) 融合到nCas9的C末端构建得到了第一代prime编辑器PE1[10]。将PE1编码质粒转染到HEK293T细胞对其编辑活性进行检测发现，PE1介导靶位点目标碱基颠换的效率仅为0.7%–5.5%，靶位点Indels突变效率为4%–17%。为了提高PEs的编辑活性，该研究团队首先对各种工程化的M-MLV RT进行测试筛选，最终他们得到了1种五突变的M-MLV RT (D200N、L603W、T330P、T306K和W313F)，该变体具有更好的热稳定性和酶活性并且更容易和底物结合，他们将其引入PE1中构建得到了PE2。进一步，研究者尝试在非编辑链引入第二切刻，诱导细胞通过同源重组通路以编辑链为模板对非编辑链进行修复。据此构建得到了第三代prime编辑器PE3，PE3在HEK293T细胞中的编辑效率较PE2提高了1.5–4.2倍，最高可达到55%。另外，为降低引入Indels的风险，研究者将引导第二切刻的sgRNA靶向编辑后产生的DNA新链，使第二切刻在第一切刻修复后产生，构建得到编辑器PE3b。PE3b的编辑特异性比PE3提高了13倍，靶位点Indels突变效率仅为0.74%。
目前，PEs已经被应用于多种哺乳动物细胞系以及水稻和小麦等重要农业植物的基因组编辑，并且还被成功应用于小鼠模型的构建[10, 30-35]。但值得注意的是，PEs的编辑效率普遍比较低并且存在不稳定的现象，PEs的编辑效率受到细胞类型、Cas9活性以及pegRNA等多种因素的影响[36-39]。优化pegRNA能有效地提高PEs的编辑效率，因为在pegRNA的3′端含有PBS和RT，因此其设计更为复杂，需要考虑多个参数[38, 40]。目前，已经有相关工具被开发出来用于pegRNA的设计，例如，Chow等[40]开发的名为pegFinder (http://pegfinder.sidichenlab.org) 的网络设计工具，该工具可以根据目标DNA序列快速设计pegRNA，pegFinder可以预测sgRNA的靶向评分和脱靶评分并将评分纳入其排名系统，重要的是pegFinder还支持靶向范围扩大的Cas9变体的pegRNA设计。最近，Kim等[39]利用54 836对pegRNA及其靶序列对PE2在人类细胞中的编辑活性进行了高通量评估，在此基础上他们开发出了3种计算模型及在线pegRNA设计工具deepcrispr (http://deepcrispr.info/DeepPE) 可用于pegRNA的设计和编辑效率的预测。除了优化pegRNA的设计，在未来的研究中还可以通过选用更合适的逆转录酶、筛选活性更高的Cas9蛋白以及优化编辑器的表达来提高PEs的编辑效率[36-38]。相信随着研究的深入，PEs的可用性将会得到极大提高。
2 基于CRISPR/Cas系统DNA碱基编辑器的优化2.1 提高编辑效率碱基编辑器编辑效率同时受到细胞内的修复机制、编辑器的表达水平、细胞内DNA的修饰等因素的影响。为了提高碱基编辑器的编辑效率，研究人员做了许多的探索，至今，已有多种高编辑效率的碱基编辑器被开发出来。细胞内UDG介导的碱基切除修复(Base-excision repair，BER)机制是影响CBEs编辑效率的主要因素，通过增加UGI的表达量来进一步抑制碱基的切除修复能有效地提高CBEs的编辑效率。例如，Komor等[41]将另一个UGI融合到BE3中开发出的含有两分子UGI的BE4有效地提高了碱基编辑效率；Wang等[42]通过共表达BE3和游离的UGI也有效地提高了碱基编辑效率。另外，研究表明增加碱基编辑器在细胞内的表达量能有效地提高编辑效率，添加核定位信号(Nuclear localization signal，NLS)、密码子优化以及祖先序列重建能有效地增加编辑器在细胞内的表达[43]。Koblan等[43]在BE4系统的C末端和N末端分别融合了一分子的NLS信号序列，使BE4的编辑效率提高1.3倍；在此基础上，他们通过密码子优化提高脱氨酶APOBEC1和nCas9的表达量，开发出了BE4max，使编辑效率又提高了1.8倍；为了进一步提高BE4max的编辑效率，他们对胞嘧啶脱氨酶进行祖先序列重建，在BE4max的基础上开发出了AncBE4max。针对ABE7.10他们用密码子优化的方式构建得到的ABEmax同样也提高了碱基编辑效率[43]。另外，DNA的修饰也可能影响碱基编辑效率，Wang等[44]通过调节局部DNA甲基化表明CpG甲基化确实对BE3介导的C到T的编辑效率产生负面影响。他们通过筛选多种APOBEC和AID脱氨酶发现，含有人类APOBEC3A脱氨酶的CBEs (hA3A-BE3) 在高甲基化水平和GpC二核苷酸含量高的区域有着更高的编辑效率，在hA3A-BE3基础上融合3个拷贝数的UGI构建得到的hA3A-eBE进一步提高了碱基编辑效率[44]。Zhang等[45]研究发现在CBEs中添加单链DNA结合结构域(Single-stranded DNA-binding domain，ssDBD) 能增加脱氨酶的编辑活性及其与单链DNA的亲和力，基于此，他们在nCas9和脱氨酶之间插入Rad51蛋白的非序列特异性ssDBD构建得到的一些hyCBEs，成功提高了碱基编辑效率。Richter等[24]使用噬菌体辅助的非连续和连续进化的方法进化了ABE7.10的脱氨酶成分并获得了脱氨作用更好的ABE8e，因为ABE8e的脱氨作用更好，所以编辑器SpABE8e在HEK293T细胞的编辑效率比SpABE7.10高3–11倍。针对植物基因组，Hua等[46]利用ecTadA*7.10-nSpCas9 (D10A)融合体构建得到了简化的植物碱基编辑器ABE-P1S，因为ABE-P1S结构更简单，所以其更容易在细胞中表达。相对于由ecTadA-ecTadA*7.10- nSpCas9 (D10A) 融合体构成的植物编辑器ABE-P1，ABE-P1S在细胞中的蛋白表达量更高，对应的编辑效率也更高。
2.2 扩大编辑范围碱基编辑器的编辑范围由CRISPR/Cas系统决定，CRISPR/Cas系统与靶位点结合需要PAM序列的存在，PAM极大地限制了基因组可编辑位点，这样就阻碍了碱基编辑器的广泛应用[47]。为了打破该限制，研究者们用Cas9直系同源物或经过工程设计改造的Cas9变体构建了多种碱基编辑器，以供使用者根据编辑需要选择适宜的编辑器。例如，用来自金黄色葡萄球菌的SaCas9及其变体KKH-SaCas9替代SpCas9产生的CBEs，识别的PAM序列分别为NNGRRT和NNNRRT (R=A+G)；用来自耳形葡萄球菌的SauriCas9替代SpCas9产生的SauriBE4max和SauriABEmax则可以识别序列为NNGG的PAM[47-48]。将Cpf1与胞嘧啶脱氨酶融合设计的基于CRISPR/Cpf1的碱基编辑器，该系统可识别富含T的PAM (TTTV，V=A+C+G) 序列[49]。另外，把传统SpyCas9的PAM相互作用区域替换为新发现的猕猴链球菌Cas9 (SmacCas9) 的PAM相互作用区域产生的Spy-mac BE4max和Spy-mac ABEmax可以识别NAA的PAM序列，但只有PAM序列是TAAA时有较高效率[50]。通过对SpCas9进行工程改造，Kim等[47]开发出了VQR-BE3、EQR-BE3和VRER- BE3，它们识别的PAM序列分别为NGA、NGAG和NGCG。Nishimasu等[51]将Target-AID中SpCas9替换为他们设计改造的SpCas9-NG能针对PAM为NG位点实现有效碱基编辑。Hu等[52]利用噬菌体辅助连续进化法筛选得到SpCas9的变异体xCas9，xCas9可以识别NG、GAA和GAT等PAM序列，他们基于xCas9开发得到了xCas9(3.7)-BE3和xCas9(3.7)-ABE。最近，Miller等[53]引入了几个新的SpCas9变体，它们分别识别NRRH、NRTH和NRCH的PAM序列，从而使碱基编辑器能够对具有NR PAM序列的目标进行操作；Walton等[54]开发的另一个名为spry的SpCas9变体显示了对NRN和NYN (Y=C+T) 的PAM序列的偏好，但是偏好程度不明显，这种变体几乎可以针对基因组中所有位点进行编辑。
2.3 降低脱靶率脱靶编辑是限制碱基编辑技术推广应用的主要问题。脱靶编辑是指编辑器在目标位点之外引入非预期突变。对于碱基编辑器有两种情况会造成脱靶，一种是因为Cas9与非靶位点非特异性结合造成的脱靶也就是Cas9依赖的脱靶，另一种是非Cas9依赖的脱氨酶与非靶位点结合而造成的脱靶[55-57]。一个减少Cas9依赖的脱靶编辑的有效方法就是在CBEs和ABEs中使用高保真的SpCas9变体。野生型的SpCas9与DNA靶链的磷酸骨架存在非特异性的相互作用，这种非特异性的相互作用增加了碱基编辑器的脱靶风险，而高保真的SpCas9变体能减少这种非特异性的相互作用[58]。目前，已有多项研究利用SpCas9变体成功提高了碱基编辑器的特异性，例如，研究人员利用xCas9、HF-Cas9和Sniper-Cas9等高保真的SpCas9变体构建得到的xCas(3.7)-BE3、HF-BE3和Sniper-BE3都能有效地减少脱靶编辑[52, 58-59]。另外，Gehrke等[60]将高保真SpCas9变异体SpCas9-HF1和HypaCas9引入eA3A-BE3中同样也减少了脱靶的碱基编辑。另外，改变碱基编辑器的递送方式也可以有效地降低脱靶编辑率[58, 61-62]。目前，多数研究都是通过转染质粒或病毒载体这些基于DNA的构建体来实现碱基编辑，质粒载体可以利用电穿孔或阳离子脂质纳米颗粒等方法转染细胞，而病毒载体则可以利用慢病毒、腺病毒或腺相关病毒转染细胞[63-65]。虽然基于DNA的构建体能在细胞中高效地表达并且实现有效编辑，但其在细胞中的长期表达会增加脱靶风险[66]。因为mRNA和核糖核蛋白(Ribonucleoprotein，RNP) 在细胞中会很快被降解，这样脱靶编辑的可能性就会降低。为了降低脱靶风险，许多研究者将碱基编辑器以mRNA或RNP的形式导入细胞来实现碱基编辑。Kim等[61]利用显微注射或电穿孔的方法将BE3的mRNA或RNP导入小鼠胚胎中，实现了有效碱基编辑同时有着很高的特异性。Rees等[58]以RNP的形式将BE3导入哺乳动物细胞，同时他们还将特异性更好的HF-BE3以质粒转染的方式导入细胞，结果发现，BE3的RNP传递具有更高的特异性。关于非Cas9依赖的脱氨酶引起的脱靶，Zuo等[56]分别将BE3和ABE7.10注射到小鼠二细胞期胚胎其中一个卵裂球，E14.5时分选编辑细胞和非编辑细胞，通过全基因测序分析BE3和ABE7.10的脱靶效应。发现在每个胚胎中BE3注射组的单核苷酸变异(Single nucleotide variants，SNVs) 个数为283个，较对照组多了200倍，ABE7.10注射组的SNVs数量为10个，与SNVs的自然发生率相近[56]。进一步分析发现，BE3组90%突变源于APOBEC1导致的G→A或者C→T突变，与sgRNA的脱靶位点关系不大[56]。CBEs全基因组非Cas9依赖的脱靶主要是因为胞嘧啶脱氨酶域的内在DNA亲和力，因此降低胞嘧啶脱氨酶域与DNA之间的亲和力可能是提高CBEs编辑器特异性的有效方法，基于此Doman等[67]开发的YE1-BE4及YE1-BE4变体有效地减少了非Cas9依赖的脱靶编辑。对于ABEs，由于腺嘌呤脱氨酶TadA对底物DNA的结合力本身较弱，所以ABEs在全基因组范围内有着更好的特异性。值得注意的是，DNA碱基编辑器还会引起RNA水平的脱靶[25, 57, 68]。针对RNA的脱氨，可以通过改造脱氨酶与RNA的活性结合位点来降低脱氨酶与RNA之间的相互作用从而减少脱靶的RNA编辑[18]。例如，Grünewald等[57]发现在BE3中将突变引入rAPOBEC1 (rAPOBEC1-R33A和rAPOBEC1-R33A/ K34A)，产生的SECURE-BE3，减少了非Cas9依赖的RNA脱氨作用。他们还发现当脱氨酶是eA3A时，RNA的脱氨效果很低[69]。此外，Zhou等[68]开发的ABE7.10F148A能够完全避免ABEs在RNA范围的脱靶编辑。
与CBEs和ABEs不同，PEs本身没有碱基脱氨功能，其脱靶编辑主要发生于sgRNA的脱靶位点。在HEK293T细胞中，利用已知脱靶位点的sgRNA对PE2和PE3的编辑特异性检测[70-71]。发现在16个已知的脱靶位点中，仅在3个位点中检测到脱靶编辑，并且只有1个位点的脱靶编辑效率达到1%，远低于CRISPR/Cas9系统的脱靶编辑效率(最高为60%)，证明PEs系统具有较高的编辑特异性[10]。
2.4 缩小和扩大编辑窗口碱基编辑器在靶位点上的可编辑范围称为编辑窗口，CBEs和ABEs的编辑窗口位于PAM序列远端2–6 bp或4–8 bp区域的5 bp范围内，PEs没有具体的编辑窗口，理论上可在第一切刻3′末端后引入任意编辑[7-10]。CBEs和ABEs编辑窗口中存在多个C碱基和A碱基时可能会有副产物的生成，这限制了它们在编辑要求比较高的领域中的应用。缩小编辑窗口能有效地减少副产物的生成，目前，已有研究者对碱基编辑器进行了优化，成功缩小了编辑窗口。Kim等[47]通过改造APOBEC1的结构域研发得到的YE1-BE3、YE2-BE3、EE-BE3和YEE-BE3，成功缩小了CBEs的编辑窗口；Wang等[44]通过替换APOBEC1底物识别结构域hA3A中的氨基酸，开发出了hA3A-BE3-Y130F和hA3A-BE3-Y132D，也缩小编辑窗口；Tan等[72]通过截短七鳃鳗胞苷脱氨酶(PmCDA1) 的C末端和改变PmCDA1和nCas9之间刚性连接子的长度同样也缩小了编辑器的编辑窗口。
虽然缩小编辑窗口能提高碱基编辑的精确性，但减少了全基因组范围的可编辑位点，而扩大编辑窗口能增加全基因组范围的可编辑范围。对于扩大编辑窗口，也有研究者做了一些探索。Jiang等[73]利用SunTag信号放大系统创建了一个名叫BE-PLUS的碱基编辑器能将编辑窗口扩大到14 bp。Huang[22]等使用环化排列的Cas9变异体替代编辑器的Cas9蛋白，使窗口扩展到8–9 bp。
2.5 改变序列偏好目标碱基上下游碱基的种类是影响碱基编辑器编辑效率的重要因素。以BE3为例，当目标碱基C的上游碱基是T时，编辑效率较高，上游碱基是G时，编辑效率较低[7, 29]。研究表明，碱基编辑器的序列偏好性决定于脱氨酶[41]。据此，Komor等[41]分别用胞嘧啶脱氨酶CDA1和AID替换了BE3中的APOBEC1，构建了CDA1-BE3和AID-BE3，使编辑器在GC位点具有更高的编辑效率。Gehrke等[60]利用人为修饰的人源APOBEC3A构建了eA3A-BE3，使其偏好于TC位点。另外，Thuronyi等[74]利用PACE技术对CBEs中APOBEC1进行优化得到了序列兼容性更强的evoAPOBEC1-BE4max和evoCDA1-BE4max，evoAPOBEC1-BE4max对GC位点的编辑效率是野生型APOBEC1的26倍。
3 基于CRISPR/Cas系统DNA碱基编辑技术在生物医学中的应用3.1 纠正致病突变在人类遗传病中，半数以上是由单个碱基突变引起的，碱基编辑技术的高效编辑能力为研发人类遗传病的基因疗法提供了方便[29]。利用碱基编辑技术矫正人类致病突变已有了初步的尝试，目前，CBEs和ABEs已经被用来纠正癌症、β-地中海贫血、杜氏肌营养不良症以及Ⅰ型遗传性酪氨酸血症等疾病相关的突变[75]。Komor等[7]首次开发出BE3时就测试了其在哺乳动物细胞中纠正疾病相关的突变的潜力，他们将编码BE3的核转染DNA和合适的sgRNA转进永生化的小鼠星形胶质细胞中，目的是将APOE4基因中Arg158突变成Cys158。转染2 d后，他们测序发现有58%–75%的Arg158转化为Cys158，该突变能有效地减少得阿尔茨海默症的风险[7]。同样的，Gaudelli等[8]首次开发ABE7.10时也对其纠正疾病相关突变的能力进行了测试。遗传性血色素沉积(Hereditary haemochromatosis，HHC) 通常由人类HFE基因中第845位核苷酸的G到A突变引起的HFE蛋白中的Cys182转换为Tyr282所造成。Gaudelli等[8]将编码ABE7.10的核转染DNA和sgRNA转染进永生化淋巴母细胞系中，转染后分离成功转染的细胞并对其基因组DNA进行高通量测序，结果观察到在转染细胞的28%测序读取中Tyr282密码子向Cys182转化。此研究证明了ABEs在人类细胞中纠正疾病相关突变的巨大潜力。β-地中海贫血是一个全球性的健康问题，由HBB基因突变引起，在中国和东南亚的β-地中海贫血患者中，HBB-28 (A > G) 突变是3种最常见的突变之一。Liang等[76]利用BE3纠正了由患者外周血中的淋巴细胞构建的克隆胚胎中HBB-28 (A > G) 的致病突变。首先他们在含有HBB-28 (A > G) 突变片段的HEK293T细胞中证实了纠正人细胞中HBB-28 (A > G) 突变的可行性，接着他们将BE3 mRNA和sgRNA注射进由患者外周血中的淋巴细胞与体外成熟的卵母细胞融合形成的胚胎中，结果有45.4% (10/22) 的G-28被转化为A或C。其中一个胚胎中G-28被转化为C，在其他9个胚胎中G-28被转化为A[76]。该研究证实利用碱基编辑技术在人类胚胎中修复致病突变的可行性。另外，Zeng等[77]利用A3A(N57Q)-BE3对BCL11A基因增强子进行编辑，不但达到了预防镰刀状细胞病的目的，而且防止了源于β-地中海贫血患者造血干/祖细胞(Hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs) 诱导的血红蛋白链的失衡。
3.2 构建疾病模型人类疾病动物模型是现代生物医学研究疾病致病机理和研发疾病治疗方法的有效工具，快速有效地制备人类疾病模型可促进生物医学领域的发展，而碱基编辑技术的迅猛发展为疾病模型的制备提供了极大的便利(图 2)。小鼠是最常见的模式动物，在疾病研究中被广泛应用。Kim等[61]在小鼠受精卵中利用BE3在DMD和Tyr两个基因的蛋白编码区提前引入终止密码子，成功获得DMD和Tyr基因敲除小鼠模型，证明了利用碱基编辑器制备基因编辑动物的可行性。Liu等[78]在小鼠受精卵中利用ABEs在雄激素不敏感综合征相关基因Ar和并指畸形有关基因hoxd13中引入致病突变，成功制备得到表现出这两种疾病临床症状的小鼠模型。另外，Liu等[32]利用PE3成功构建了并指畸形相关基因hoxd13单个碱基突变的小鼠模型。除了小鼠模型外，Liu等[79]利用BE3、ABE7.10和BE4-GAM制备了多种与人类多种疾病相关的兔模型。在大动物模型中，Yuan等[80]利用BE4-Gam制备了β-1, 4-乙酰半乳糖基转移酶2、α-1, 3-半乳糖基转移酶和胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶缺陷的猪模型，证明碱基编辑器同样适用于大动物疾病模型制备。另外，针对非哺乳动物，也有研究人员利用碱基编辑技术构建了斑马鱼和非洲爪蟾模型[81-82]。例如，Zhang等[81]针对人类眼皮肤白发病构建的斑马鱼模型；Park等[82]针对眼皮肤白发病构建的非洲爪蟾模型。利用碱基编辑器建立致病基因点突变动物模型为进一步真正进行临床疾病治疗奠定了坚实的基础[18]。
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| 图 2 DNA碱基编辑器在构建动物模型中的应用 Fig. 2 Application of DNA base editors in animal model construction. SNV: single-nucleotide variant. |
| 图选项 |
3.3 筛选耐药突变利用化学药物杀死癌细胞是目前治疗癌症最有效的手段之一，但是癌细胞的耐药突变抑制了药物的治疗效果。利用单碱基编辑技术鉴定癌细胞的耐药突变，可为癌症治疗提供有效的用药依据。Ma等[27]利用他们开发的dCas9-AIDx碱基编辑器在慢性粒细胞白血病细胞中编辑BCR-ABL，成功鉴定了慢性髓细胞样白血病细胞中对伊马替尼(Imatinib) 的抗性突变。基于同样的策略，Hess等[28]利用他们研发的CRISPR-X碱基编辑器成功鉴定出了引发波替单抗(Bortezomib) 耐药性的突变。
4 基于CRISPR/Cas系统DNA碱基编辑技术在农业中的应用利用传统的育种手段，如杂交育种，培育优良畜禽和作物品种需要很长的周期，耗费大量的财力和物力，且无法突破种源的限制，极大地减缓了动植物育种的进程。碱基编辑技术可在DNA水平对动植物的遗传信息进行定向改造，直接对目标性状进行改良或者赋予动植物新的遗传性状，相较于传统育种手段具有更直接的育种效果。目前，碱基编辑技术已被成功应用于动植物遗传育种研究，在改善经济性状、提高抗病能力以及增强作物耐药能力等方面取得了可喜进展[83]。
在动物育种中，Zhou等[84]把BE3的编码mRNA和sgRNA注射到绵羊受精卵中，成功对细胞因子信号抑制物2基因(Suppressor cytokine signaling 2，SOCS2) 实现了精确编辑，获得的基因编辑羔羊的生长性能明显优于野性型羔羊。Li等[85]通过显微注射技术将BE3质粒和靶向多个位点的混合sgRNA导入到山羊单细胞胚胎中，对成纤维细胞生长因子5 (FGF5) 编码基因实现高效编辑，基因编辑山羊的纤维显著长于野生山羊，毛囊显著多于野生型山羊。除了畜禽育种外，Liu等[79]利用BE3编辑兔Mstn基因使其在外显子1处发生C到T突变，从而提前产生终止密码子使基因失活，最终他们得到的突变型兔显示出了双肌表型。另外，Li等[86]还证明BE3系统在家蚕的胚胎细胞和BmE细胞中也能进行有效编辑。综上所述，碱基编辑技术是加速农业动物育种进程的有效方法。
随着基因组学的深入研究，越来越多的与作物重要经济性状相关的功能SNPs被发掘出来。利用碱基编辑技术将这些SNPs引入到作物品种中，可加快作物的育种进程。例如，Chao等[87]利用腺嘌呤碱基编辑器成功获得了对除草剂氟乐灵(Haloxyfop-P-methyl) 有抗性的水稻植株。Shimatani等[88]利用胞嘧啶碱基编辑器成功获得了抗除草剂咪唑啉酮(Imidazolidinone，IMZ) 的水稻植株。另外，Zong等[89]通过农杆菌介导法将碱基编辑器编码质粒导入未成熟植物胚中，获得了OsCDC48编辑水稻、TaLOX2编辑小麦和ZmCENH3编辑玉米；Ren等[90]利用他们开发出的胞嘧啶碱基编辑器rBE9诱导水稻基因(ALS、FTIP1e、OsAOS1、OsJAR1、OsJAR2和OsCOI2)的碱基编辑；Kang等[91]利用植物亲和性ABE7.10 (pcABE7.10) 诱变了拟南芥的4个基因(AtALS、AtPDS、AtFT、AtLFY) 和2个油菜基因(BnALS和BnPDS)。此外，关于PEs在植物中的应用也有了多篇报道，例如，Lin等[31]将改造优化的适用于植物的编辑器PPE3通过农杆菌介导法导入水稻愈伤组织并成功诱导OsALS-T2基因发生单碱基突变(G-to-T)。最近，Jiang等[92]利用PEs对玉米中2个乙酰乳酸合酶基因ZmALS1和ZmALS2进行编辑，结果发现这两个基因中共有53.2% (33/62) 的S621I突变和6.5% (4/62) 的W542L突变，其中S621I和W542L双重突变频率有4.8% (3/62)。总之，碱基编辑技术的应用为农作物育种带来了极大便利，解决了传统诱变育种的随机性强和效率低的问题。
5 总结与展望毫无疑问，DNA碱基编辑器的开发对于基因编辑领域的影响是巨大的。相对于CRISPR/Cas介导的HDR编辑，碱基编辑器的最大优势就是可以在不产生DSB的情况下实现高效精准的编辑。自2016年基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑器首次开发至今，目前，已有各种在编辑效率、编辑范围和编辑特异性等方面得到优化的DNA碱基编辑器被开发，另外，双碱基编辑器、糖基化酶碱基编辑器以及prime编辑器的问世更是为碱基编辑提供了更多的选择。虽然通过对DNA碱基编辑器的优化改良使其在编辑效率、编辑特异性和编辑范围等方面取得了不错进展，但在不产生任何副产物的情况下依然不能对任意细胞中任何位点实现高效的编辑。想要进一步推广DNA碱基编辑器在生物医学以及农业领域中的应用必须对其作更多的改进。沿着前人的研究思路，在今后的研究中继续去探索发现更多具有不同特点的脱氨酶和Cas蛋白，将它们引入DNA碱基编辑器中以提高DNA碱基编辑器的编辑精准度、编辑效率和编辑范围；此外，优化sgRNA设计、编辑器在细胞中的表达以及编辑器的递送载体等都是提高DNA碱基编辑器可应用性的有效方法。DNA碱基编辑技术已经在人类遗传疾病研究及其相关动物模型制备、药物开发、动植物育种等方面显现出巨大潜力。DNA碱基编辑技术还在不断完善成熟中，该技术的进步将推动我国及全世界在生物医药和农业生产等领域的快速发展。
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