杨梦婷^1,2, 李晓晓^1,2, 林晨², 刘明靓^1,2, 陈叶梓^1,2, 赵云², 刘朝奇^1,2
1. 三峡大学 医学院 肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002;
2. 三峡大学 医学院，湖北 宜昌 443002
收稿日期：2020-09-06；接收日期：2020-12-25；网络出版时间：2021-01-13
基金项目：国家自然科学基金(Nos. 81473461, 81673675) 资助

摘要：为了获得有活性的白喉毒素突变体蛋白(Cross-reacting material 197，CRM197)，本研究利用分子伴侣pG-KJE8与重组质粒pET28a-CRM197在大肠杆菌原核表达系统中进行共表达，来促进目的蛋白的正确折叠，进而提高CRM197蛋白的可溶性表达。将质粒转化至大肠杆菌后并诱导其表达目的蛋白，再通过SDS-PAGE胶染色、Western blotting等技术对所得蛋白进行检测分析。结果发现：利用体外重组技术成功得到了pET28a-CRM197重组蛋白原核表达质粒，且CRM197重组蛋白在原核表达系统中主要以包涵体形式表达；通过探索和优化，确定了诱导蛋白的最佳浓度和温度，当加入终浓度为1.0 mmol/L IPTG、0.5 mg/mL L-阿拉伯糖、5.0 ng/mL四环素, 在20 ℃条件下诱导16 h时，目的蛋白的可溶性表达得到显著提高；可溶性表达的CRM197重组蛋白可以与CRM197一抗发生特异性结合，免疫反应性良好。因此，研究发现分子伴侣pG-KJE8可以促进CRM197重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达，且能很好地与CRM197一抗发生特异性结合，证实CRM197重组蛋白具有良好的免疫反应性，为CRM197蛋白的工业化生产及应用奠定了一定的基础。
关键词：白喉毒素突变体蛋白原核表达分子伴侣可溶性蛋白
Molecular chaperones facilitate soluble expression of recombinant non-toxic mutant CRM197 of diphtheria toxin in Escherichia coli
Mengting Yang^1,2, Xiaoxiao Li^1,2, Chen Lin², Mingjing Liu^1,2, Yezi Chen^1,2, Yun Zhao², Chaoqi Liu^1,2
1. Hubei Provincial Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy, School of Medicine, China Three Gorges University, Yichang 443002, Hubei, China;
2. School of Medicine, China Three Gorges University, Yichang 443002, Hubei, China
Received: September 6, 2020; Accepted: December 25, 2020; Published: January 13, 2021
Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 81473461, 81673675)
Corresponding author: Chaoqi Liu. Tel: +86-717-6397179; E-mail: ctgulcq@163.com.

Abstract: Diphtheria toxin is an ADP-ribosyltransferase toxic to human cells. Mutation of the active site in its catalytic domain eliminates the toxicity, but retains its immunogenicity. A non-toxic mutant of diphtheria toxin known as CRM197 protein has become an ideal carrier protein for conjugate vaccines. CRM197 can further improve its immunogenicity by cross-linking with other antigens, so it has good potential to find broad applications. Unfortunately, inclusion bodies are easily formed during the expression of recombinant CRM197 protein in Escherichia coli, which greatly reduces its yield. In order to address this problem, pG-KJE8 vector carrying molecular chaperones and plasmid pET28a-CRM197, were co-expressed in Escherichia coli. The results showed that the recombinant CRM197 protein was successfully expressed and appeared largely in inclusion bodies. The molecular chaperones DnaK, DnaJ, GrpE, GroES and GroEL5 expressed can facilitate correct and rapid folding of CRM197. Furthermore, it can also improve the recovery rate of soluble CRM197 protein. The soluble expression of CRM197 was maximized upon addition of 1.0 mmol/L IPTG, 0.5 mg L-arabinose, 5.0 ng/mL tetracycline and induction at 20^oC for 16 h. The soluble CRM197 protein shows good immunoreactivity, demonstrating the molecular chaperones expressed from pG-KJE8 facilitated the soluble expression of CRM197 protein in E. coli.
Keywords: CRM197prokaryotic expressionmolecular chaperonesoluble protein
白喉毒素(Diphtheria toxin，DT) 是一种ADP-核糖基化酶，分子量约为58 kDa，以535个氨基酸残基的原酶形式分泌，可以被类胰蛋白酶处理并释放出两个片段(A和B)^[1]，其中A片段具有催化活性位点^[2]，是发生毒性作用的唯一片段。CRM197蛋白是白喉毒素的突变体^[3-4]，仅包含一个G52E突变^[5]，即第52位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸，此突变使白喉毒素酶活性位点发生了改变，导致CRM197丧失了ADP-核糖转移酶活性^[6]，从而失去细胞毒性^[7]。因其无细胞毒性，CRM197一般作为一种安全的载体被广泛应用于疫苗^[8]。
据研究报道，CRM197不仅可以用作疫苗抗原载体，还应用于阿尔茨海默症(AD)^[9]、肿瘤治疗^[10-11]和结核病防治^[12-13]等多个领域的研究，具有一定的临床应用价值。Vingtdeux等^[9]将CRM197作为表位呈递的载体蛋白，把焦谷氨酸抗β淀粉样蛋白(AβpE3) 递送到体内，并触发特异性抗AβpE3抗体的产生。而AβpE3具有治疗阿尔茨海默症的潜能，结果证明CRM197与AβpE3的结合可以产生特异性AD疫苗。Yotsumoto等^[10]为了评估肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF) 作为EGFR突变的肺癌的治疗靶标的有效性，将CRM197直接作用与具有突变的EGFR肺癌细胞中，结果表明CRM197可以诱导细胞凋亡并有显著的抑瘤性。Hu等^[14]利用CRM197与结核分枝杆菌分泌的CFP10和TB10.4两种抗原缀合，发现该缀合物可引起CFP10-TB10.4融合蛋白高度特异性的IgG滴度，且对心脏、肝脏及肾功能无明显毒性，证实CRM197为结核病的治疗提供了新方向。
CRM197蛋白表达的宿主菌主要为白喉杆菌^[15]，但白喉杆菌的发酵条件极为苛刻，且发酵成本较高，不利于工业化生产^[16-17]。大肠杆菌因具有生长速度快、遗传背景简单、表达水平高等特点，逐步成为基因工程首选的表达系统。CRM197蛋白在原核表达系统中极易形成包涵体，使蛋白失去活性，包涵体的复性操作十分复杂，增加了其应用难度^[18]。
质粒pG-KJE8的araB启动子可以表达DnaK、DnaJ和GrpE，Pzt-1启动子可以表达GroEL和GroES，通过表达DnaK、DnaJ、GrpE、GroES和GroEL 5种蛋白从而实现蛋白质的正确、快速折叠，进而增加可溶性表达蛋白的回收率^[19]。其具体机制为，在辅助蛋白DnaJ和核苷酸交换因子GrpE的帮助下，DnaK通过其自身构象发生变化，实现快速与折叠中间体的结合与释放，促进蛋白质正确折叠，同时伴侣蛋白GroEL与GroES辅助蛋白可以形成一个空腔，为蛋白的正确折叠提供微环境，进而促进去折叠蛋白向天然状态的流动，加速蛋白质的正确折叠。周宇等^[16]通过构建新型的双质粒自动切割原核表达系统来提高CRM197蛋白的可溶性表达；王艳芳等^[20]利用pG-KJE8、pGro7、pG-Tf2和pTf16 4种分子伴侣来促进牛支原体膜蛋白的可溶性表达，通过对诱导温度及时间的优化，最终证实分子伴侣pG-Tf2和pG-KJE8能提高牛支原体膜蛋白的可溶性表达。
本研究在CRM197蛋白的表达过程中加入分子伴侣pG-KJE8质粒，使其在大肠杆菌原核表达系统中共表达，来促进目的蛋白的正确折叠，防止其沉降聚集，来提高CRM197蛋白的可溶性表达。同时在高表达系统中通过对诱导剂、诱导温度和时间的不断优化^[21]，尽可能增加目的蛋白的可溶性表达，为大规模生产提供理论依据。
1 材料与方法1.1 菌株及质粒通过GenBank网站查询基因CRM197，其编号为No.KU521393；含有密码子优化的重组质粒pET28a-CRM197由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成；大肠杆菌Escherichia coli DH5α、E. coli BL21 (DE3) 菌株由本研究所保存；分子伴侣pG-KJE8购自武汉淼灵生物科技有限公司。
1.2 主要试剂及仪器氯霉素、硫酸卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、四环素、L-阿拉伯糖均购自武汉科瑞生物技术有限公司。氯化钙购自Sigma公司。DNA marker购自北京天根生物有限科技公司公司。质粒提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。胰蛋白胨、酵母粉购自OXOID公司。氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司。鼠源His单克隆抗体(mAb)、HRP标记的羊抗鼠IgG均购自北京中衫金桥生物技术有限公司。含有CRM197多克隆抗体的小鼠血清由本实验室提供。镍柱纯化试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。超声波细胞破碎仪购自BRANSON公司。落地式高速低温离心机购自BECKMAN COULTER公司。
1.3 重组蛋白CRM197的可溶性表达鉴定取2 μL重组质粒pET28a-CRM197加到表达载体BL21 (DE3) 中，置于冰上反应30 min；42 ℃热激90 s，冰上静置10 min。提前将卡那霉素固体培养基取出置于37 ℃恒温培养箱中复温15 min，将菌液用涂布棒均匀涂布在卡那霉素培养基中，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养过夜。次日挑取单克隆于卡那霉素液体培养基中，37 ℃过夜培养；按菌液比1︰100的比例加入到新鲜培养基中扩大培养，当OD₆₀₀约0.6时，加入终浓度为1.0 mmol/L IPTG诱导剂进行诱导表达，收集菌液，用SDS-PAGE进行分析鉴定。
1.4 分子伴侣共表达菌株的构建及SDS-PAGE分析鉴定将分子伴侣PG-KJE8质粒转化至表达菌株BL21 (DE3) 中，方法见1.3。次日挑取单克隆至含有氯霉素抗性的液体培养基中，37 ℃过夜培养，将其制成感受态。取2 μL重组质粒pET28a-CRM197转化至含分子伴侣pG-KJE8质粒的BL21 (DE3) 表达菌株中，方法见1.3。次日挑取单克隆至含有硫酸卡那霉素和氯霉素抗性的液体培养基中，按照1.3的方法进行诱导表达。收集菌液，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，弃上清，菌体用磷酸缓冲液(PBS) 洗涤两次，洗涤后称重，按每克加5 mL的PBS回溶，超声破碎20 min (65%，工作3 s，间歇2 s)，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，收集上清与沉淀。沉淀用与上清等体积的PBS重悬，加入5×上样缓冲液煮沸10 min，取10 μL上清和沉淀进行10%的SDS-PAGE分析，以不含分子伴侣诱导的重组菌作为阴性对照。
1.5 目的蛋白诱导条件的优化为了获得大量的CRM197可溶性蛋白，本实验对诱导剂的浓度及诱导温度进行了一定的优化，利用正交试验，通过改变IPTG、L-阿拉伯糖及四环素等诱导剂的浓度，并进行SDS-PAGE分析，选择出最优的诱导条件；同时用最佳的诱导浓度分别在20 ℃和37 ℃恒温摇床中诱导16 h及6 h，收集菌液，用SDS-PAGE进行鉴定，分析其表达特异性。
1.6 目的蛋白的纯化与SDS-PAGE分析鉴定收集诱导表达的重组菌，经PBS洗涤后，超声破碎20 min，在低温高速离心机中4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清。上清经0.45 μm的滤器过滤，然后经镍柱亲和纯化，利用不同浓度的咪唑进行梯度洗涤、洗脱，从而达到纯化除杂的目的。收集各个组分，进行SDS-PAGE分析，上样量为10 μL。
1.7 目的蛋白的免疫反应性检测将纯化后的目的蛋白经10%的SDS-PAGE电泳后，用湿转法转至PVDF膜，条件为250 mA，1.5 h。转印后的PVDF膜用5%脱脂牛奶在37 ℃摇床上封闭1 h，再用含0.5%的Tween-20的Tris-HCl缓冲液(即TBST) 振荡洗涤3次，每次10 min。加入含有CRM197的鼠源阳性血清(1∶200) 稀释，4 ℃孵育过夜，次日用TBST振荡洗涤3次，每次10 min；加入HRP标记的羊抗鼠IgG (1∶5 000稀释)，室温孵育1 h，TBST洗涤3次后，ECL显色。
2 结果与分析2.1 重组蛋白CRM197的可溶性表达分析经1.0 mmol/L IPTG诱导后，收集菌液进行超声破碎，以未诱导组作对照，进行SDS-PAGE检测，观察目的蛋白的可溶性。图 1中SDS-PAGE显示目的蛋白约在58 kDa处，与预期一致；通过比较沉淀和上清中目的蛋白的量，发现目的蛋白主要以包涵体形式表达。

图 1 CRM197重组蛋白的可溶性分析 Fig. 1 Solubility analysis of CRM197 recombinant protein. 1: protein pre-stained marker; 2: RM197 recombinant bacteria precipitated after ultrasound; 3: CRM197 recombinant bacteria supernatant after ultrasound; 4: not induced (negative control).

图选项

2.2 分子伴侣共表达的SDS-PAGE分析将分子伴侣pG-KJE8质粒与pET28a- CRM197重组质粒在大肠杆菌BL21 (DE3) 表达载体中共表达，按照1.3中的方法进行诱导，37 ℃诱导6 h后，收集菌液，超声破碎，用超声后的上清与未加分子伴侣诱导后的超声上清进行SDS-PAGE分析。图 2表明，分子伴侣pG-KJE8质粒能提高CRM197蛋白的可溶性表达。经分析软件Image J分析得出，含分子伴侣的上清中目的蛋白的表达量是不含分子伴侣的3.2倍，由此证实分子伴侣pG-KJE8质粒能显著提高目的蛋白CRM197的可溶性表达。

图 2 含分子伴侣与不含分子伴侣重组蛋白的SDS-PAGE分析 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein with or without molecular chaperones. 1: protein pre-stained marker; 2: pET28a-CRM197 recombinant protein supernatant; 3: uninduced bacteria (negative control); 4: pET28a-CRM197-pG-KJE8 recombinant protein supernatant.

图选项

2.3 目的蛋白诱导条件的优化为了使目的蛋白的表达量增大，本研究对诱导剂的浓度与诱导温度进行的优化。对诱导剂采用正交试验进行选择，从SDS-PAGE可看出8号为最佳诱导条件(图 3–4)。同时用37 ℃和20 ℃恒温摇床分别诱导6 h及16 h，收集菌液，超声破碎，用各自的总菌与超声后的上清进行SDS-PAGE分析；证实目的蛋白在20 ℃时的总菌表达量和上清表达量都明显高于37℃的表达量(图 5)，因此选择20 ℃作为诱导的最佳温度。

图 3 诱导剂浓度的优化分析 Fig. 3 Optimization analysis of inducer concentration. 1: protein pre-stained marker; 2: 111; 3: 122; 4: 133; 5: 211; 6: 222; 7: 233; 8: 311; 9: 322; 10: 333.

图选项

图 4 正交试验分析最佳诱导剂浓度 Fig. 4 Orthogonal test analysis of optimal inducer concentration. 1: 111; 2: 122; 3: 133; 4: 211; 5: 222; 6: 233; 7: 311; 8:322; 9: 333.

图选项

图 5 CRM197蛋白20 ℃、37 ℃诱导表达的SDS-PAGE分析 Fig. 5 SDS-PAGE analysis of CRM197 protein induced expression at 20 ℃ and 37 ℃. 1: protein pre-stained marker; 2, 3: supernatant of recombinant bacteria induced at 20 ℃; 4, 5: supernatant of recombinant bacteria induced at 37 ℃; 6, 7: total bacteria of recombinant bacteria induced at 20 ℃; 8, 9: tatal bacteria of recombinant bacteria induced at 37 ℃.

图选项

2.4 目的蛋白的纯化与SDS-PAGE分析鉴定将含有分子伴侣pG-KJE8的重组菌进行诱导表达，收集菌体，菌体用PBS洗涤两次，复用PBS回溶，超声破碎20 min，在低温高速离心机中4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清，经0.45 μm滤膜过滤后用Ni柱纯化目的蛋白。经过多次实验探索，发现当洗脱液为pH 7.0、200 mmol/L的咪唑时，杂蛋白的洗脱能力较好；当洗脱液为pH 6.5、500 mmol/L咪唑时，杂蛋白基本被洗脱，只剩所需的目的蛋白(图 6)。经分析软件Image J分析，进一步得出目的蛋白的收率为91.4%，证明pH 6.5、500 mmol/L的咪唑为最佳纯化浓度。

图 6 CRM197蛋白纯化的SDS-PAGE分析 Fig. 6 SDS-PAGE analysis of CRM197 protein purification. 1: protein pre-stained marker; 2: uninduced bacteria (negative control); 3: recombinant bacteria containing molecular chaperones; 4: pH 7.0, 200 mmol/L imidazole eluent; 5: pH 6.5, 500 mmol/L imidazole eluent.

图选项

2.5 表达产物的Western blotting鉴定及免疫反应性检测结果Western blotting结果显示，当使用含CRM197鼠源的阳性血清作为一抗时，CRM197重组蛋白能被其识别(图 7A)；当时用His单抗作为一抗时，表达产物能够与之发生特异性结合(图 7B)；两者均在58 kDa处出现特异性条带，说明检测结果相一致，Western blotting结果表明纯化后获得的CRM197重组蛋白具有良好的免疫反应性。

图 7 纯化后CRM197的Western blotting鉴定及免疫反应性分析 Fig. 7 Western blotting identification and immunoreactivity analysis of CRM197 after purification. (A) Western blotting of CRM197 reacting with anti-His monoclonal antibody. 1:protein pre-stained marker; 2: purified CRM197 recombinant protein; 3: negative control. (B) Detection of immunoreactivity between CRM97 and mouse serum containing CRM197 polyclonal antibody. 1: negative control; 2: protein pre-stained marker; 3: purified CRM197 recombinant protein.

图选项

3 讨论目前，CRM197的用途虽然很广泛，但是由于其在生产过程中容易形成包涵体，对后续的分离纯化有一定的影响，故CRM197的大量获得和生产仍然是一个难题。为了提高CRM197的可溶性表达，经查阅文献以及一定的实验探究，决定在实验中加入一种分子伴侣来提高其可溶性表达。
大肠杆菌原核表达系统虽然可以快速实现异源蛋白的高效表达，但同时存在目的蛋白容易形成包涵体的问题^[22]。形成包涵体的主要原因有以下几种：1) 蛋白的表达速度过快、浓度过高，导致生成的蛋白质没有足够时间和空间折叠正确的结构^[23]；2) 表达时，细菌所处环境还原性过高，从而不能有效地完成二硫键的氧化折叠；3) 诱导温度过高，胞内pH接近目的蛋白的等电点等因素影响了包涵体动力学的稳定；4) 培养环境缺乏一些促折叠的辅助因子。各种研究表明，添加促溶标签^[24]、密码子优化^[25]、载体表达原件的优化^[26]及改变诱导温度、时间、pH等，可以有效地减少包涵体的生成，从而提高可溶性表达。
该实验通过将分子伴侣pG-KJE8质粒与重组质粒pET28a-BMP2共转化至表达菌株BL21 (DE3) 中使其共表达。加入分子伴侣后，可明显发现包涵体有所减少，超声破碎后，可溶性蛋白显著增多。在诱导表达的过程中，通过改变诱导温度、诱导时间等条件来确定最佳的诱导环境，最终发现诱导温度为20 ℃，诱导16 h，蛋白的得率较高，且活性较好。
CRM197不仅可以被用作疫苗佐剂，还具有一定的抗肿瘤作用^[27]。因此，CRM197蛋白有望成为一种新的抗肿瘤药物。本研究旨在探讨如何增加CRM197蛋白的可溶性。通过加入分子伴侣与目的质粒共转化达到促进目的蛋白正确折叠，减少包涵体的生成，从而增加其可溶性表达；随后将纯化的目的蛋白与含有CRM197鼠源的阳性血清进行Western blotting反应，鉴定重组蛋白CRM197的反应原性。因条件有限，纯化后的蛋白没有进行后续的探讨。本研究为CRM197可溶性蛋白的工业化生产和后续的研究应用奠定了一定的基础，同时也为CRM197靶向抗肿瘤提供了一个新的思路。
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