, 张延平1, 李寅1 1. 中国科学院微生物研究所 微生物生理与代谢工程重点实验室，北京 100101;
2. 中国科学院大学，北京 100049
收稿日期：2020-05-29；接收日期：2020-08-19；网络出版时间：2020-09-10
基金项目：中国科学院重点部署项目(No. KFZD-SW-215) 资助
摘要：质子泵型视紫红质是一种在自然界广泛存在的简单光合系统，它可以结合视黄醛，在光照下将质子由胞内泵向胞外，形成质子梯度势，在一定程度上促进ATP的合成。在非光合工程菌中引入视紫红质将光能转化为化学能有助于促进微生物生长、生产以及提高细胞耐受性。文中在大肠杆菌Escherichia coli中异源表达了来自Gloeobacter violaceus PCC 7421的质子泵型视紫红质Gloeorhodopsin (GR)，并验证了它的功能活性。在大肠杆菌中表达时，GR可以正确行使光驱质子泵功能，最大吸收波长位于539 nm。GR分布在细胞膜表面，没有在胞内形成包涵体。在通过核糖体结合位点(Ribosome binding site，RBS) 优化的手段提升GR的表达水平之后，观察到了胞内ATP水平的提高，证实在特定的条件下，GR可以为异源宿主带来额外的能量补充。
关键词：视紫红质质子泵ATP表达优化膜定位大肠杆菌
Heterologous expression and function evaluation of Gloeobacter violaceus rhodopsin in Escherichia coli
Jiayu Fang1,2, Taicheng Zhu1
, Yanping Zhang1, Yin Li1 1. Key Laboratory of Microbial Physiological and Metabolic Engineering, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Received: May 29, 2020; Accepted: August 19, 2020; Published: September 10, 2020
Supported by: Key Program of the Chinese Academy of Sciences (No. KFZD-SW-215)
Corresponding author: Taicheng Zhu. Tel: +86-10-64807351; E-mail: zhutc@im.ac.cn;
Yanping Zhang. Tel: +86-10-64807351; E-mail: zhangyp@im.ac.cn.
Abstract: Proton-pumping rhodopsin (PPR) is a simple photosystem widely distributed in nature. By binding to retinal, PPR can transfer protons from the cytoplasmic to the extracellular side of the membrane under illumination, creating a proton motive force (PMF) to synthesize ATP. The conversion of light into chemical energy by introducing rhodopsin into nonphotosynthetic engineered strains could contribute to promoting growth, increasing production and improving cell tolerance of microbial hosts. Gloeorhodopsin (GR) is a PPR from Gloeobacter violaceus PCC 7421. We expressed GR heterologously in Escherichia coli and verified its functional activity. GR could properly function as a light-driven proton pump and its absorption maximum was at 539 nm. We observed that GR was mainly located on the cell membrane and no inclusion body could be found. After increasing expression level by ribosome binding site optimization, intracellular ATP increased, suggesting that GR could supply additional energy to heterologous hosts under given conditions.
Keywords: rhodopsinproton pumpATPoptimized expressionmembrane localizationEscherichia coli
自然界中光能营养型生物可以依靠光能利用系统将光能转化为化学能，从而为自身生理代谢供能。叶绿素光系统是最为熟知的光能利用系统，是高等植物、藻类、蓝细菌等进行光合作用的基础。除此之外，自然界中还存在另一种结构相对简单但广泛存在的光能利用系统——视紫红质(Rhodopsin)。
视紫红质是一种7次跨膜蛋白，因其蛋白质中的赖氨酸残基共价结合发色团视黄醛显紫色而得名。自然界中已发现的视紫红质，可根据蛋白序列的相似程度区分为TypeⅠ和TypeⅡ两类[1]。TypeⅡ即动物视网膜型，又称作视蛋白(Opsin)，存在于高等的真核生物中，主要发现于动物的视网膜上，是一类G蛋白偶联受体，可感受光信号并触发信号通路。TypeⅠ即微生物型(或称古菌类似型)，首先发现于细菌中，随后在古菌、真核生物中陆续发现。在TypeⅠ视紫红质中，有一类质子泵型视紫红质(Proton-pumping rhodopsin，PPR)[2]，它结合的视黄醛分子在吸收光子后产生构象的改变，引起整体蛋白的变构，从而促进质子外流，产生膜内外的质子梯度形成质子驱动力(Proton motive force，PMF) 推动ATP合酶合成ATP (图 1)，将光能转化为化学能[3-4]。
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| 图 1 质子泵型视紫红质的作用原理(改自Claassens等[4]) Fig. 1 Proton-pumping mechanism of PPR. Modified from reference Claassens et al[4]. |
| 图选项 |
PPR广泛存在于海洋、河流和湖泊等水体以及植物表面[5]。在许多天然宿主中，PPR已经被证实具备利用光能提高细胞能量水平的功能。海洋黄杆菌Dokdonia sp. MED134在较低有机质浓度的条件下，可以借助PPR在光照下促进细胞生物量的积累[6]。海洋弧菌Vibrio sp. AND4在生长环境缺乏营养时，会促进自身PPR的表达，并利用其延续自身的生存[7-8]。海冰嗜冷菌Psychroflexus torquis的PPR可以帮助其在高盐胁迫的条件下，促进细胞的生长[9]。
此外，PPR也在许多异源宿主中成功表达。来自海洋γ-变形菌SAR86分支的PPR第一个在大肠杆菌中成功表达，并且观察到了它的光驱质子泵功能[2]。Walter等发现该PPR在大肠杆菌中表达后，可以在细胞呼吸受到抑制的情况下促进鞭毛的运动[10]。Kuniyoshi等将该PPR和氢酶在大肠杆菌中共表达，显著提高了氢气产量[11]。Chen等在集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803中表达该PPR后，在合适的对照下，也可以观察到对细胞生长的促进作用[12]。Johnson等将该PPR表达在希瓦氏菌中后，发现细胞的乳酸摄取能力和发电能力都得到了显著的提升[13]。这些异源表达的成功案例，初步显示出PPR作为光能功能元件，在促进工业微生物生长、生产以及提高耐胁迫能力方面的应用潜力。
Gloeobacter violaceus PCC 7421是一种从瑞士石灰质岩中分离出来的蓝藻[14]。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析，它与多种蓝藻的分化时间较早[15-16]。与典型的蓝藻相比，它没有类囊体，光合系统和呼吸系统均位于细胞质膜上，这两个系统可能会共享一些电子传递链上的载体蛋白[17]。通过基因组测序，发现这种蓝藻中含有与质子泵型视紫红质高度同源的一种新视紫红质[18]，被命名为Gloeorhodopsin (GR)。由于没有类囊体，所以这种蓝藻基于叶绿素光系统的光合作用较弱，而GR可以补偿因此带来的能量短缺[19]。在本研究中，我们尝试在大肠杆菌中异源表达GR，测试在异源表达的GR是否具有光驱质子泵活性。在此基础上，研究了GR在细胞中的定位，系统优化了GR在大肠杆菌中的表达水平，并考察了GR在光照下对胞内ATP水平的影响，为探索能否利用PPR为工业微生物供能奠定基础。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 菌株和质粒大肠杆菌BW25113，实验室保存；大肠杆菌Trans1-T1，购自北京全式金生物技术有限公司。表达质粒pED31，实验室保存。
1.1.2 主要试剂和仪器PCR相关试剂，购自北京擎科新业生物技术有限公司；限制性内切酶和T4 DNA连接酶，购自Thermo Fisher Scientific公司；细菌质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自杭州爱思进生物技术有限公司；全反式视黄醛，购自Sigma-Aldrich公司；ATP检测试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；其余常见药品与试剂均购自北京化工厂和国药集团化学试剂有限公司。
光照培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；pH计，Mettler Toledo公司；多功能酶标仪，Tecan公司。
1.1.3 培养基LB培养基：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，加蒸馏水定容至1 L。121 ℃，0.1 MPa，高压蒸汽灭菌15 min。固体培养基额外添加15 g/L琼脂粉。
M9无机盐培养基：17.1 g Na2HPO4·12H2O，3.0 g KH2PO4，0.5 g NaCl，1.0 g NH4Cl，加蒸馏水定容至1 L，另配制2 mol/L MgSO4，0.1 mol/L CaCl2，分开单独灭菌，121 ℃，0.1 MPa，15 min。灭菌后MgSO4和CaCl2稀释1 000倍加入培养基中，再添加10 g/L葡萄糖。
1.2 实验方法1.2.1 表达载体和菌株构建GR基因序列(登录号NP_923144) 委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，基因经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切后，连接至pED31质粒载体上，热激转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB固体平板，挑取单菌落进行PCR验证筛选，委托北京擎科新业生物技术有限公司测序，正确克隆电击转化大肠杆菌BW25113感受态细胞，最终得到表达菌株BW25113 (pED31-GR)。
1.2.2 RBS优化通过在线RBS优化工具(https://www.denovodna.com/software/design_rbs_calculator)，针对GR的表达预测设计了4个不同强度的RBS，设计GR基因的上下游引物(表 1)，将这4段RBS序列分别加在上游引物的5′端，然后用这些对引物以之前构建好的pED31-GR质粒为模板扩增GR基因，然后连入原载体，得到一系列不同表达强度的GR表达菌株，将它们简称为GR-5、GR-10、GR-20、GR-50。
表 1 RBS优化所用引物Table 1 Primers for RBS optimization
| Primer name | Primer sequence (5′–3′) | Size (bp) |
| GR-5-F | ATCGGAATTCCGCTCCACCCCTAAGGAGGTTTATTATGCTGATGACCGTGTTTTCTTC | 58 |
| GR-10-F | ATCGGAATTCGATATTAAGGAGGTTTTTTTATGCTGATGACCGTGTTTTCTTC | 53 |
| GR-20-F | ATCGGAATTCCGCTGGAAACGTAAGGAGGTATTATTATGCTGATGACCGTGTTTTCTTC | 59 |
| GR-50-F | ATCGGAATTCCCGCTCTAACTTATAACTAAGGAGGTATTTATGCTGATGACCGTGTTTT | 59 |
| GR-R | ATCGGAGCTCTTAGGAGATCAGGCTACCAC | 30 |
表选项
1.2.3 荧光显微成像利用Overlap PCR的方法，将绿色荧光蛋白EGFP的编码序列接在GR序列的C端，Linker为GGGGSGGGGS，之后同上述载体与菌株构建过程，得到带绿色荧光蛋白标签的GR表达菌株。
融合蛋白表达菌株在LB培养基中过夜培养后，取样离心，使用PBS缓冲液洗3遍(5 000 r/min，2 min)，制片，使用Nikon N-SIM超分辨率显微镜进行观察，得到重构图像。
1.2.4 吸收光谱检测将GR表达菌株在LB培养基中过夜培养后，取样离心(5 000 r/min，2 min)，重悬在缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.0)中，冰浴超声破碎(25%功率，工作3 s，停歇4 s，共15 min)，离心(4 ℃，8 000×g，20 min) 取上清，超速离心(4 ℃，120 000×g，90 min)，弃上清，将沉淀用150 mmol/L NaCl溶液重悬，置于石英比色皿中，加入终浓度10 μmol/L的视黄醛后，分别在0 min和30 min测量450–650 nm的吸收光谱，相减即得到GR的吸收光谱。
1.2.5 质子泵功能检测将GR表达菌株在LB培养基中过夜培养(实验组添加视黄醛，对照组不添加)后，取样离心，使用生理盐水洗3遍(5 000 r/min，2 min)，重悬在生理盐水中，将pH计探头伸入。实验在暗室中进行，通过开关LED灯控制光照(100 μE/(m2·s)) 和黑暗，先保持黑暗稳定溶液pH，之后以5 min为一个阶段交替光照和黑暗，每分钟记录溶液pH。
1.2.6 胞内ATP检测将GR表达菌株在LB培养基中过夜培养后，转接至M9无机盐培养基中(实验组添加视黄醛，对照组不添加)，调整OD600为0.1，在黑暗中培养约12 h，到达对数生长末期，然后加入5 g/L乙酸，并转移至光照培养箱(100 μE/(m2·s)) 中，处理3 h。
分别取处理前和处理后的菌体样品，先测定OD600并调整各样品一致，离心(5 000 r/min，2 min)，重悬在缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)中，冰浴超声破碎(25%功率，工作3 s，停歇3 s，共5 min)，离心(4 ℃，12 000×g，5 min)，取上清。按照ATP检测试剂盒，在黑色96孔板中，先加入100 μL检测试剂，再加入20 μL细胞破碎上清，混匀后孵育15 min，利用酶标仪检测各孔化学发光强度，然后根据标准曲线换算得到ATP浓度。
2 结果与分析2.1 GR的系统发育分析将GR与其他一些典型的视紫红质[20]根据氨基酸序列进行系统发育分析，利用邻接法建树，得到系统发育树(图 2)。结果显示，与GR最为相近的是两种xanthorhodopsin，这一类视紫红质还另含有类胡萝卜素的生色团[21]。已有研究报道GR除了可以结合视黄醛，还可以结合salinixanthin和echinenone，而这两种色素都含有4-keto基团[22-23]，所以GR很可能含有类似xanthorhodopsin的类胡萝卜素捕光天线。
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| 图 2 GR与几种典型视紫红质的系统发育树 Fig. 2 Pylogenetic tree of GR and several typical rhodopsins. XR: xanthorhodopsin; ClR: chloride-transporting rhodopsin; NaR: sodium-transporting rhodopsin; PR: proteorhodopsin; VR: viral rhodopsin; SRⅠ: sensory rhodopsin Ⅰ; SR Ⅱ: sensory rhodopsin Ⅱ; BR: bacteriorhodopsin. |
| 图选项 |
从上述视紫红质中挑选出质子泵功能的xanthorhodopsin、proteorhodopsin、bacteriorhodopsin，进一步与GR进行氨基酸序列分析(图 3) 发现，在光驱动的质子运输过程中，残基D121可以成为质子受体，E132可以成为质子供体，而K257可以成为视黄醛结合位点[2]。因此，可以从序列上预测，GR具有完整的质子泵功能。
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| 图 3 GR与几种质子泵型视紫红质的序列比对 Fig. 3 Sequence alignment of GR and several proton-pumping rhodopsins. XR: xanthorhodopsin from Salinibacter ruber; PR: proteorhodopsin from uncultured marine γ-proteobacterium EBAC31A08; BR: bacteriorhodopsin from Halobacterium salinarum. Helical segments are numbered and marked by arrow. Residues for proton transport are marked with yellow boxes. |
| 图选项 |
2.2 GR在大肠杆菌中的异源表达为了实现在大肠杆菌中表达GR，构建了表达GR的大肠杆菌载体。将按大肠杆菌密码子偏好性优化的GR基因序列，用酶切连接的方法，克隆至实验室之前构建的诱导型表达载体pED31上，获得重组载体pED31-GR。该载体使用tac启动子，需要IPTG诱导表达。将重组载体转化大肠杆菌宿主BW25113，构建获得表达GR的重组菌株BW25113/pED31-GR。
将空质粒菌株BW25113/pED31 (对照) 和BW25113/pED31-GR在含0.5 mmol/L IPTG和10 μmol/L视黄醛的LB培养基中诱导培养过夜，离心收集菌体。由于视紫红质多肽链与视黄醛结合后形成的活性视紫红质会显红色，可以重组菌是否变红来判断GR是否获得了活性表达。图 4显示，与对照相比，BW25113/ pED31-GR菌体颜色明显变红，初步证明GR成功表达。
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| 图 4 表达GR的大肠杆菌在含视黄醛培养基中的颜色变化 Fig. 4 Color change of GR-expressing strain in the medium with retinal. Left: control strain; right: GR-expressing strain. |
| 图选项 |
2.3 重组GR的表征为进一步表征重组GR的性质和功能，首先检测了GR的吸收光谱。提取重组菌BW25113/ pED31-GR的细胞膜组分，溶解在150 mmol/L NaCl溶液中，并添加10 μmol/L视黄醛，在添加后0 min和30 min分别对溶液进行波长扫描，以0 min时的吸光度为基底值，相减得到的即为GR的吸收光谱(图 5)。结果显示，在加入视黄醛之后，膜组分在539 nm处有明显的吸收峰值，而以相同的方法对空质粒对照菌株BW25113/pED31进行测定，则没有观察到明显的吸光度变化。说明GR存在这样一个特征吸收峰。同时这也再次证明了GR的成功表达且可与视黄醛正确结合。
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| 图 5 GR的吸收光谱 Fig. 5 Absorption spectrum of GR. Relative absorbance is the absorbance change of crude membrane after adding retinal. Control: empty plasmid strain. |
| 图选项 |
为了表征GR的光驱质子泵功能，将重组菌BW25113/pED31-GR细胞悬浮于150 mmol/L NaCl溶液中，记零时刻的溶液pH为0，以每5 min为一个阶段，不断交换黑暗和光照条件，记录每分钟溶液的pH变化(图 6)。实验组细胞培养时添加视黄醛，并以未添加视黄醛的细胞作为对照组。结果显示，在5–10 min和15–20 min的光照阶段时，实验组的溶液pH值明显下降(约0.08)，说明细胞在接受光照时向胞外泵出质子，而在10–15 min和20–25 min的无光阶段，溶液的pH值又恢复到初始水平。与此同时，对照组溶液的pH值无论光照与否一直无明显变化。同样的，对空质粒对照菌株BW25113/pED31也采取上述测试，并没有观察到pH值随光暗周期有明显的变化。以上结果验证了重组GR在大肠杆菌中发挥了光驱质子泵的功能。
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| 图 6 GR的质子泵活性 Fig. 6 Proton pump activity of GR. pH was recorded every one minute after an equilibration period of 5 min, followed by illumination (white area) for 5 min, and darkness (grey area) for 5 min. Data was normalized by the difference respecting to the data at 0 min. Left: GR expressed strain; Right: empty plasmid strain. |
| 图选项 |
2.4 RBS优化提高GR表达量Kirchman等研究表明，单位细胞的视紫红质数量显著影响其对细胞的供能效果[24]。为了进一步加强GR的供能效果，我们采用RBS优化策略，以提高大肠杆菌中GR的表达量。
通过生物信息学预测[25]，得到了4段针对GR的不同强度的RBS序列，将其替换掉原始的RBS序列，得到的新序列分别命名为GR-5、GR-10、GR-20、GR-50。将构建获得的新重组菌株用相同的培养条件诱导培养。如图 7所示，相比于原始GR，GR-10与GR-20颜色显著加深，其中以GR-10菌株的菌体颜色最深(完全显示红色)。
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| 图 7 不同RBS的GR菌株的菌体颜色 Fig. 7 Color of GR strains with different RBS. From left to right: original GR, GR-5, GR-10, GR-20, GR-50. |
| 图选项 |
为了定量鉴定各组GR的表达量，我们使用一种半定量的方法来初步定量。采用国际照明委员会(International Commission on Illumination) 制定的CIEL*a*b*表色系统对各菌株的菌体颜色进行颜色深浅分析。利用PhotoShop软件对图 7进行分析，在Lab模式下读取各菌株的菌体部分区域的色相a*值和色相b*值(图 8)。a*值由负到正表示绿色减弱，红色增强；b*值由负到正表示蓝色减弱，黄色增强。
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| 图 8 各GR菌株菌体颜色的CIEL*a*b*表色 Fig. 8 CIEL*a*b* coordinates of the color of each GR strain. |
| 图选项 |
可以观察到GR-10的a*值最大，且高于原始GR，说明它的红色最深，GR蛋白含量最高。这在一定程度上可以判断GR-10的表达量最高。表明了含GR-10序列的重组菌中GR的表达量得到了显著的提升。
2.5 GR在大肠杆菌中的细胞定位为了更直观地检测GR在大肠杆菌内的表达以及GR在细胞内的具体定位，将GR与绿色荧光蛋白标签EGFP在大肠杆菌中融合表达，采用荧光成像的方法观察GR在细胞中的定位。为了更清晰地观察到GR在细胞中的分布情况，采用了高分辨的结构照明显微成像技术(Structure illumination microscopy，SIM)，理论上它可以达到普通荧光显微镜两倍的分辨率。
运用SIM技术，可以较为清晰地观测到GR在细胞中的定位(图 9)，根据图象，可以判断绝大多数的GR都是分布在大肠杆菌的细胞膜上，在胞质中没有形成明显的过表达或者包涵体等情况。可以说明GR在大肠杆菌中表达良好，且成功定位至细胞膜表面。
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| 图 9 融合蛋白GR-EGFP在大肠杆菌细胞中的SIM成像 Fig. 9 SIM images of GR-expressing cells. The fusion protein of GR and EGFP was expressed in E. coli. GR localization was determined by EGFP (green) using SIM. The right image is a magnification of the red box in the left image. Image magnification: left: 1 200×; right: 7 500×. Objective magnification: 100×. |
| 图选项 |
2.6 GR表达对大肠杆菌胞内ATP水平的影响为了验证GR是否能够利用光能为重组大肠杆菌供能，我们对重组菌BW25113/pED31-GR-10胞内ATP水平进行了检测。前人的研究表明，由于视紫红质产生的PMF与细胞自身异化代谢所产生的PMF相比相对较弱[10]，故其对细胞能量水平的影响一般需要细胞处在较为贫乏的营养条件下才能显现出来。于是我们选择通过乙酸处理的方式来降低胞内本底的ATP水平[26]，然后在此基础上测试GR-10对ATP生产的促进作用。
按是否添加视黄醛分为实验组和对照组，先将重组菌BW25113/pED31-GR-10细胞在黑暗中培养至对数生长末期，然后加入5 g/L乙酸处理3 h，同时给予光照。分别在处理开始和结束时检测胞内ATP水平(图 10)。可以观察到在酸处理过后，细胞胞内ATP水平急剧下降，但实验组的胞内ATP水平显著高于对照组，说明正确行使功能的GR产生的PMF可以有效提高细胞的胞内ATP水平。
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| 图 10 酸胁迫下GR-10对细胞ATP水平的影响 Fig. 10 Effect of GR-10 on cellular ATP level under acid stress. Left: cellular ATP level before treatment. Right: cellular ATP level after treatment. The data are presented as x±s (n=3). *: P < 0.05. |
| 图选项 |
3 讨论能量是微生物生长发酵的核心问题之一。在微生物异养生长过程中，ATP主要来源于氧化磷酸化和底物水平磷酸化，而引入基于质子泵型视紫红质的光能转化模块，将为工业微生物解决能量限制问题提供新的解决思路。例如，厌氧发酵与好氧发酵相比，虽然碳损低，但也同样会面临能量短缺、生长差、细胞耐受性差等问题，而引入质子泵型视紫红质进行额外的能量补充，则可以有效缓解这些问题[27]。此外，在近几年兴起的人工固碳领域，固碳途径的重构和创建已取得了许多进展，但能量供应仍然是限制固碳效率的一大重要因素[28-29]，而基于PPR的光能转化模块将为该问题的解决提供重要思路。
本研究在大肠杆菌中表达了来源于Gloeobacter violaceus PCC 7421的质子泵型视紫红质GR。在吸收光谱测定中，我们发现GR的吸收峰位于539 nm处，与变形菌视紫红质相近，处于叶绿素a、藻红蛋白、藻蓝蛋白等典型光合色素的吸收光谱覆盖范围之外，可能具有补充拓宽某些天然光合宿主改造的工程菌捕光光谱的潜力[30-32]。在细胞定位实验中，我们直观地观察到GR均分布在膜上，没有出现积聚在胞内的现象。Karnik等研究表明，在大肠杆菌中过表达视紫红质，未嵌入膜中的视紫红质无法行使功能，并且会被快速降解[33]。
针对质子泵型视紫红质普遍存在的表达量低导致的效果不显著问题，我们采用了RBS优化的策略提升GR的表达水平，以期在一个合适的较高表达水平上放大GR的作用。
我们建立了一种计算机软件辅助的视紫红质含量简单鉴定方法，对不同RBS的GR菌株进行含量的分析。这一方法得到的结果与肉眼观察到的结果具有较为良好的一致性，可以作为一种大批量初筛的方法，但不能用于精确定量。
筛选得到的高表达GR-10菌株，在酸胁迫的环境下可以依靠光为细胞补充ATP，将胞内ATP水平维持在一个相对较高的水平，这是低表达水平的原始GR所没有表现出来的。这初步显示出了GR对细胞耐受酸胁迫方面的应用潜力。另一方面，结合目前文献结果来看，PPR可产生的能量水平相对较弱，通常需要在极端贫乏的环境下才能显现[10, 12, 34-35]，而且其对于自然宿主生长的促进作用报道也不一致[36-37]。因此，仍需要对PPR这一重要的光转化模块进行更为系统的研究、评价以及设计。
综上，本研究通过GR在大肠杆菌中的功能性表达，证实了将基于质子泵型视紫红质的光能转化模块引入工程菌供能是可行的，对提高工业微生物生产及耐胁迫能力等做出了有益的尝试。
参考文献
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