, 龚建森3 1. 农业农村部渔用药物创制重点实验室 广东省水产动物免疫技术重点实验室 中国水产科学研究院珠江水产研究所, 广东 广州 510380;
2. 扬州大学 动物科学与技术学院, 江苏 扬州 225009;
3. 中国农业科学院家禽研究所, 江苏 扬州 225125;
4. 中国农业科学院上海兽医研究所, 上海 200241
收稿日期：2020-05-09；接收日期：2020-07-03；网络出版时间：2020-08-13
基金项目：国家重点研发计划(No. 2019YFD0900103)，国家自然科学基金(No. 31772758)，农业农村部渔用药物创制重点实验室和广东省水产动物免疫技术重点实验室项目(No. 201801)，广东省科技计划项目(No. 2016B020234003)资助
摘要：为构建一种具有广泛适用性的原核启动子报告系统，以质粒pFLX107为骨架，通过多克隆位点替换和序列改造，构建出基于lacZ基因和pUC复制子的pFGH系列报告载体，然后以lacZ基因缺失株MC4100为宿主菌筛选背景活性最低的质粒作为最终的报告系统，并利用诱导型启动子araBAD和组成型启动子rpsM分别对其进行测试。结果显示，在所构建的pFGH系列质粒中，pFGH06的背景活性显著低于同系列其他质粒，在28 ℃培养条件下甚至显著低于低拷贝参考质粒pRCL的活性(P < 0.01)。进一步的评估测试显示，质粒pFGH06可用于诱导型启动子或组成型启动子的克隆及活性测定，且在模拟应用于启动子筛选时，通过蓝白斑筛选即可实现对目标启动子的完全识别。与已报道的原核启动子报告系统相比，pFGH06具有体积小、克隆位点多、背景活性可调、对启动子筛选识别效率高等优点，具有广泛的应用前景。
关键词：报告基因β-半乳糖苷酶定点突变启动子报告系统pUC复制子阿拉伯糖启动子
Construction and evaluation of a pUC-type prokaryotic promoter reporter system based on lacZ gene
Lixia Fu1,2, Jingxiao Xu3, Xian'gan Han4, Hui Yang2, Yingtiao Lai1, Zhibin Huang1
, Jiansen Gong3 1. Key Laboratory of Fishery Drug Development, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Key Laboratory of Aquatic Animal Immune Technology, Guangdong Province, Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, Guangdong, China;
2. College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China;
3. Poultry Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Yangzhou 225125, Jiangsu, China;
4. Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 200241, China
Received: May 9, 2020; Accepted: July 3, 2020; Published: August 13, 2020
Supported by: National Key Research and Development Program of China (No. 2019YFD0900103), National Natural Science Foundation of China (No. 31772758), the Open Project Program of Key Laboratory of Fishery Drug Development, Ministry of Agriculture and Rural Affairs and Key Laboratory of Aquatic Animal Immune Technology, Guangdong Province (No. 201801), the Science and Technology Planning Project of Guangdong Province (No. 2016B020234003)
Corresponding author: Zhibin Huang. Tel: +86-20-81334212; E-mail: hzb1393@163.com;
Jiansen Gong. Tel: +86-514-85599282; E-mail: jjsensen@163.com.
Abstract: To construct a prokaryotic promoter report system with wide applicability, a series of pFGH reporter vectors based on lacZ gene and pUC replicon were constructed from plasmid pFLX107 through the replacement of multiple cloning sites and sequence modifications. The plasmid with the lowest background activity was selected as the final report system with the lacZ gene deletion strain MC4100 as the host bacterium, following by testing with inducible promoter araBAD and the constitutive promoter rpsM. The background activity of pFGH06 was significantly lower than that of other plasmids of the same series, and even lower than that of reference plasmid pRCL at 28 ℃ (P < 0.01). Further evaluation tests show that the plasmid pFGH06 could be used to clone and determine the activity of inducible promoter or constitutive promoter, and the complete recognition of the target promoter could be achieved through blue-white selection in the simulation test of promoter screening. Compared with the reported prokaryotic promoter report systems, pFGH06 has the advantages of smaller size, more multiple clone sites, adjustable background activity, high efficiency of promoter screening and recognition, thus with a wide application prospect.
Keywords: reporter geneβ-galactosidasesite-directed mutagenesispromoter reporter systempUC repliconarabinose promoter
原核启动子是位于基因上游的一段能被RNA聚合酶识别、结合并起始转录的特定DNA序列，其主要功能是控制基因表达的强度及模式，是基因转录水平调控的中心[1-2]，因此对启动子进行准确识别与鉴定是研究分析基因功能及其调控机制的前提和基础，对于实现特定实验目的而进行的相关基因工程载体构建和突变菌株改造亦具有十分重要的意义[3-4]。
随着越来越多细菌和病毒基因组序列被测定并发布，以及生物信息学的发展，对启动子的识别可借助于各种基于不同算法的软件模型进行预测[5-6]，但最终的验证或鉴定仍需通过报告基因系统来完成。迄今，已报道的可用于启动子筛选及活性测定的报告基因有氯霉素乙酰基转移酶、绿色荧光蛋白、荧光素酶和β-半乳糖苷酶等[7-10]，其中由lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶具有良好的稳定性，在多种生物体中均能正确表达和折叠，且能比较方便地进行定量检测等优点，使得其目前仍是基因工程中最常用、最成熟的一种报告基因[11-13]。
然而，当前基于lacZ基因的原核启动子报告系统多为低拷贝的穿梭载体，体积较大，不便于启动子克隆时重组质粒的构建，通常还会降低对弱启动子的检测灵敏度。此外，这些载体中紧邻lacZ基因上游的克隆位点普遍偏少，也不便于序列中含有相同酶切位点的启动子克隆；最后，部分报告系统所用宿主菌并非lacZ基因缺失突变株，潜在的背景活性也会干扰测定结果[10, 14-16]。鉴于此，本研究以质粒pFLX107为基础，通过多克隆位点置换和序列改造构建出一系列基于lacZ基因和pUC复制子的启动子报告载体，然后以lacZ基因缺失株MC4100为宿主菌筛选背景活性最低的质粒作为最终的报告系统，并利用诱导型启动子araBAD和组成型启动子rpsM分别对其进行测试，以期获得具有广泛适用性的原核启动子报告或检测体系。
1 材料与方法1.1 菌株、质粒及试剂大肠杆菌DH5α化学感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技有限公司；大肠杆菌lacZ基因突变菌株MC4100源自日本生物资源项目(National Bioresource Project，NBRP)。质粒pRCL和pKD46由中国农业科学院上海兽医研究所王少辉博士惠赠[16-17]；pFLX107为本实验构建保存[18]；pFPV25.1源自于南京农业大学动物医学院刘永杰教授课题组[19]。
限制性内切酶Bgl Ⅱ、SphⅠ、XbaⅠ，T4 DNA连接酶，PrimeSTAR HS (Premix)，Premix Taq，DNA Marker DL5000，X-gal，ONPG等均购自TaKaRa公司；氯霉素和SDS购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Na2HPO4·7H2O、NaH2PO4·H2O、MgSO4、Na2CO3和氯仿等试剂购自国药集团化学试剂有限公司。β-巯基乙醇和L-阿拉伯糖为Sigma公司产品；DNA Mini Kit、Presto Mini Plasmid Kit和Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit等为Geneaid产品，所有操作均按产品说明书进行。
1.2 引物设计为便于后续实验设计，需将lacZ基因中的ClaⅠ、SacⅠ、NdeⅠ酶切位点消除。为此，基于同义密码子原理并根据已知lacZ基因设计定点突变引物，其中lacZ-M1-F/lacZ-M1-R、lacZ-M2-F/ lacZ-M2-R、lacZ-M3-F/lacZ-M3-R反向互补，可对ClaⅠ、SacⅠ、NdeⅠ识别序列第3位碱基分别实现C→T、G→A、T→C的定点突变。lacZ-F1及lacZ-R为针对lacZ基因两端的扩增引物，引物lacZ-F2和lacZ-F3则为在lacZ-F1引物基础上依次引入所需序列和酶切位点(表 1)。设计用于置换质粒中紧邻lacZ基因上游启动子的多克隆位点序列时，利用启动子分析预测数据库(www.softberry.com)进行分析，以确保序列中不含有潜在的启动子元件。所有引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
表 1 本研究中所用引物序列Table 1 Primer sequence used in this study
| Primer name | Primer sequence (5′–3′) | Restriction site |
| lacZ-F1 | AGGTATACATATGACCATGATTACGGATTC | NdeⅠ |
| lacZ-F2 | ACTTTATTAAGGAGGTATACATATGACCATGA | NdeⅠ |
| lacZ-F3 | AGTAGATCTTTTAACTTTATTAAGGAGGTATACA | Bgl Ⅱ |
| lacZ-M1-F | GTGAAATTATTGATGAGCGTGG | |
| lacZ-M1-R | CCACGCTCATCAATAATTTCAC | |
| lacZ-M2-F | AGCGATAACGAACTCCTGCAC | |
| lacZ-M2-R | GTGCAGGAGTTCGTTATCGCT | |
| lacZ-M3-F | ACGGTTTCCACATGGGGATTG | |
| lacZ-M3-R | CAATCCCCATGTGGAAACCGT | |
| lacZ-R | ACGTCTAGATTATTTTTGACACCAGACCA | |
| MCS1-F | GGATCCTCGAGCATGCCTGCAGGTACCAATTGAGCTCAAGCTTGAATTCGTCGACTAGTA | |
| MCS1-R | GATCTACTAGTCGACGAATTCAAGCTTGAGCTCAATTGGTACCTGCAGGCATGCTCGAGGATCCGC | |
| MCS2-F | CGAGCTCGAATTCACTAGTAGATCTTAACTTTAAGGAGGTATACA | |
| MCS2-R | TATGTATACCTCCTTAAAGTTAAGATCTACTAGTGAATTCGAGCTCGGTAC | |
| t0-F | TTACCGCGGGATTCTCACCAATAAAAAAC | |
| t0-R | TAAGCATGCGACTCCTGTTGATAGATCCA | |
| MCS5-F | GAATTCTCGAGGTACCGAGCTCACTAGTA | |
| MCS5-R | GATCTACTAGTGAGCTCGGTACCTCGAGAATTCTGCA | |
| MCS6-F | GATCTTTAAGAAGGAGATTGTCA | |
| MCS6-R | TATGACAATCTCCTTCTTAAA | |
| DSeq-F | ATGGAAAAACGCCAGCAACG | |
| DSeq-R | TTCGCTATTACGCCAGCTGG | |
| araBAD-F | AGCGCATGCTTATGACAACTTGACGGCTA | SphⅠ |
| araBAD-R | GTCAGATCTCCCAAAAAAACGGGTATGGA | BglⅡ |
| rpsM-F | GAGGCATGCCTGATTTTTTCGCATATTTT | SphⅠ |
| rpsM-R | GCGAGATCTAATATGTACGTACCATGCTG | Bgl Ⅱ |
| Bold: mutated base; italic: restriction endonuclease site. | ||
表选项
1.3 lacZ基因的定点突变及克隆lacZ基因的定点突变通过重叠PCR进行。以质粒pRCL为模板，各自加入引物对lacZ-F1/lacZ- M1-R、lacZ-M1-F/lacZ-M2-R、lacZ-M2-F/lacZ-M3-R、lacZ-M3-F/lacZ-R，用PrimeSTAR HS (Premix)高保真酶进行PCR扩增，反应体系为50 μL，其中模板和正反向引物各1 μL，PrimeSTAR HS (Premix) 25 μL，灭菌双蒸水22 μL。PCR扩增条件为：98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环。
PCR反应结束后，产物于1%琼脂糖凝胶中电泳后在紫外分析仪中切下目的片段，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后以回收的片段为混合模板，lacZ-F2、lacZ-F3和lacZ-R为扩增引物，进行第二轮PCR，再次进行电泳并切胶回收，用Bgl Ⅱ和XbaⅠ对回收目的片段进行双酶切，连入同样经Bgl Ⅱ/XbaⅠ双酶切的pFLX107质粒中，最终构建成功的质粒命名为pFLX107-lacZ (图 1)。
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| 图 1 质粒pFLX107-lacZ物理图谱 Fig. 1 Physical map of plasmid pFLX107-lacZ. Cat: chloramphenicol acetyltransferase gene; Ori: origins of replication; pR: the rightward lambda promoter; cI857: a temperature sensitive repressor cI857; lacZ: β-galactosidase gene; rrnBT1T2: ribosomal RNA operon T1T2 terminator; t0: lambda t0 terminator. |
| 图选项 |
1.4 启动子报告载体的构建在质粒pFLX107-lacZ的基础上，通过多克隆位点置换和序列改造构建出一系列基于lacZ基因的启动子报告载体，用于后续筛选。首先，参照Fu等所述方法[20]将寡聚核苷酸片段MCS1-F/ MCS1-R和MCS2-F/MCS2-R溶于STE缓冲液中(10 mmol/L Tris–HCl，pH 8.0，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA)，取等体积混合后于94 ℃水浴5 min，预冷至室温。变性退火后的引物形成可与Sac Ⅱ/Bgl Ⅱ酶切产物互补的粘性末端，将其分别连入经Sac Ⅱ/Bgl Ⅱ酶切的pFLX107-lacZ中即构建成质粒pFGH01和pFGH02。在此基础上，以质粒pFLX107-lacZ为模板，利用引物对t0-F/t0-R扩增终止子t0并将其分别克隆至质粒pFGH01和pFGH02的Sac Ⅱ和Sph Ⅰ位点之间，即构建成质粒pFGH03和pFGH04。质粒pFGH05则是通过将质粒pFGH04中PstⅠ和Bgl Ⅱ间的酶切序列以变性退火的引物对MCS5-F/MCS5-R置换而成，而质粒pFGH06则又是将质粒pFGH05中Bgl Ⅱ和NdeⅠ间的酶切序列以变性退火的寡聚核苷酸片段MCS6-F/MCS6-R置换构建而成(图 2)。
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| 图 2 启动子报告质粒图谱 Fig. 2 Maps of promoter reporter plasmids. Cat: chloramphenicol acetyltransferase gene; Ori: origins of replication; lacZ:β-galactosidase gene; rrnBT1T2: ribosomal RNA operon T1T2 terminator; t0: lambda t0 terminator. |
| 图选项 |
1.5 大肠杆菌MC4100感受态细胞的制备大肠杆菌MC4100感受态细胞的制备参照Sambrook等所述方法进行适应性修改[21]，具体操作为：用接种环从冻存的大肠杆菌MC4100甘油保存液中沾取少量菌液划线于LB平板，置生化培养箱中37 ℃培养16–24 h，然后用无菌牙签挑取单个菌落，接种于装有5 mL LB液体培养基的试管中，于37 ℃恒温振荡器培养过夜。次日取100 μL细菌培养液于10 mL的LB液体培养基中振荡培养3–4 h，待OD600值达到0.3–0.4时取出培养瓶，分装于1.5 mL离心管中，8 000 r/min离心30 s，弃去上清液，向沉淀中加入500 μL预冷的0.1 mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L CaCl2，20 mmol/L MgCl2)重悬每份细胞沉淀，置碎冰上冰浴30 min，10 000 r/min离心15 s，向沉淀中加入100 μL预冷的含15%甘油的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬菌体，置?40 ℃冰箱保存备用。
1.6 启动子报告载体的背景活性测定将上述构建成功的系列启动子报告质粒pFGH01-pFGH06和参考质粒pRCL通过热激转化至大肠杆菌MC4100，再接种至100 mL含氯霉素(35 μg/mL)的LB液体培养基中，分别于28 ℃和37 ℃培养至对数生长期，参照Thongaram等所述方法并略有修改进行β-半乳糖苷酶活性测定[22]。具体为：取至少2 mL培养液，6 000 r/min离心10 min，弃上清，用等体积预冷Z缓冲液(0.06 mol/L Na2HPO4·7H2O，0.04 mol/L NaH2PO4·H2O，0.01 mol/L KCl，0.001 mol/L MgSO4，0.05 mol/L β-巯基乙醇)中重悬后测定其OD600，然后用Z缓冲液将重悬菌液等比例或10倍稀释至1 mL，向稀释菌液中加入100 μL氯仿和50 μL 0.1% SDS，涡旋混匀后于28 ℃水浴5 min。水浴结束后向管中加入0.2 mL ONPG (4 mg/mL)，同时准确记录加入时间，然后置于28 ℃孵育观察，待呈现足够黄色后，加入0.5 mL 1 mol/L Na2CO3溶液停止反应，再次准确记录加入时间。转移1 mL液体至EP离心管，以最大转速离心5 min以去除细菌残骸和氯仿，测定每管在420 nm和550 nm处的OD值。β-半乳糖苷酶活性以Miller Units (MU)表示，根据下列公式计算：
MU=1 000×[(OD420–1.75×OD550)]/(T×V×OD600)
式中，T为反应时间(min)；V为用于检测的培养物体积(mL)。
1.7 启动子araBAD和rpsM的克隆及活性测定分别以质粒pKD46和pFPV25.1为模板，各自加入引物对araBAD-F/araBAD-R和rpsM-F/ rpsM-R，用PrimeSTAR HS(Premix)高保真酶进行PCR扩增，然后电泳回收，经SphⅠ和Bgl Ⅱ酶切后，连入同样经SphⅠ/Bgl Ⅱ双酶切的pFGH06质粒中，最终构建成功的质粒分别命名为pFGH06-araBAD和pFGH06-rpsM。对启动子araBAD和rpsM的活性测定参照1.6所述方法于28 ℃培养条件下进行，其中araBAD的活性测定需在细菌培养至对数生长期时加入0.2%的阿拉伯糖进行诱导。
1.8 启动子筛选测试将含有质粒pFGH06-rpsM、pFGH06-araBAD和pFGH06的大肠杆菌MC4100分别接种至含氯霉素的LB液体培养基中振荡培养过夜，然后稀释调整其OD600至0.5左右，按1︰1的比例将大肠杆菌MC4100 (pFGH06-rpsM)和MC4100 (pFGH06-araBAD)分别与MC4100 (pFGH06)混合并作适当稀释后，分别涂布于仅含有X-gal的LB抗性平板和同时加有X-gal/阿拉伯糖的LB抗性平板，置于28 ℃培养。待长出菌落后，每组用无菌牙签随机挑取10个蓝色菌落，用引物DSeq-F/DSeq-R进行菌液PCR鉴定，并随机送3株阳性克隆至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
1.9 统计分析采用软件SPSS22.0对所得数据进行统计分析，数据差异采用t检验，P < 0.05和P < 0.01分别作为差异显著和极显著的判定标准。
2 结果与分析2.1 lacZ基因的定点突变及克隆以质粒pRCL为模板，引物对lacZ-F1/lacZ- M1-R、lacZ-M1-F/lacZ-M2-R、lacZ-M2-F/lacZ-M3-R、lacZ-M3-F/lacZ-R成功扩增出大小分别为861 bp、1 133 bp、1 042 bp、122 bp的预期目的片段。然后以回收的片段为混合模板，lacZ-F2、lacZ-F3和lacZ-R为扩增引物，进行第二轮重叠PCR，成功获得3 119 bp含突变位点的lacZ基因及附加序列的全长片段(图 3)。最终的测序结果亦显示原lacZ基因中的ClaⅠ、SacⅠ、NdeⅠ酶切位点被成功消除，并且突变序列符合预期。
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| 图 3 lacZ基因的重叠PCR定点突变 Fig. 3 Site-directed mutagenesis of gene lacZ by overlapping PCR. M: DNA marker DL5 000; 1: lacZ-F1/ lacZ-M1-R; 2: lacZ-M1-F/lacZ-M2-R; 3: lacZ-M2-F/ lacZ-M3-R; 4: lacZ-M3-F/lacZ-R; 5: lacZ-F2+lacZ-F3/ lacZ-R. |
| 图选项 |
2.2 启动子报告载体的构建对构建而成的系列启动子报告质粒pFGH01-pFGH06，以DSeq-F和DSeq-R引物进行PCR鉴定，可分别扩增出大小约为328 bp、309 bp、416 bp、397 bp、401 bp和399 bp的预期目的片段，而作为参照的pRCL质粒则未能扩增出片段(图 4)。
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| 图 4 启动子报告质粒的PCR鉴定 Fig. 4 PCR identification of promoter reporter plasmids. M: DNA marker DL5 000; 1–6: pFGH01-pFGH06; 7: pRCL. |
| 图选项 |
为消除质粒超螺旋结构对其电泳体积大小的判断，用限制性内切酶Bgl Ⅱ对质粒pFGH01-pFGH06进行单酶切，同时用PstⅠ对质粒pRCL进行单酶切，然后进行电泳，结果显示经Bgl Ⅱ单酶切的线性质粒pFGH01-pFGH06均位于5 000 bp附近，与预期大小(分别为4 878 bp、4 859 bp、4 966 bp、4 947 bp、4 951 bp和4 949 bp，见图 2)相符(图 5)。最终所构建质粒的测序结果也均与设计序列一致。
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| 图 5 启动子报告质粒的酶切鉴定 Fig. 5 Electrophoresis of promoter reporter plasmids digested by restriction enzyme. M: DNA marker DL5 000; 1–6: pFGH01-pFGH06 digested by BglⅡ; 7: pRCL digested by PstⅠ. |
| 图选项 |
2.3 质粒pFGH06-araBAD和pFGH06-rpsM的构建分别以质粒pKD46和pFPV25.1为模板，用引物对araBAD-F/araBAD-R和rpsM-F/rpsM-R成功扩增出大小约为1 217 bp和150 bp (含限制性酶切位点和保护碱基)的预期目的片段(图 6)。以引物DSeq-F/DSeq-R对构建质粒进行PCR鉴定，可分别扩增出大小约为1 571 bp和498 bp的预期目的片段，而对照则未见扩增出片段(图 7)。最终的测序结果也表明，成功构建质粒pFGH06- araBAD和pFGH06-rpsM。
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| 图 6 启动子araBAD和rpsM的PCR扩增 Fig. 6 PCR amplification of promoter araBAD and rpsM. M: DNA marker DL5 000; 1–2: araBAD; 3: negative control for araBAD; 4–5: rpsM; 6: negative control for rpsM. |
| 图选项 |
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| 图 7 质粒pFGH06-araBAD和pFGH06-rpsM的PCR鉴定 Fig. 7 PCR identification of plasmids pFGH06-araBAD and pFGH06-rpsM. M: DNA marker DL5 000; 1: pFGH06-araBAD; 2: pFGH06-rpsM; 3: negative control. |
| 图选项 |
2.4 启动子报告载体的背景活性测定在28 ℃培养条件下，pFGH01-pFGH06的背景活性分别为(31.4±2.2) MU、(74.8±3.3) MU、(18.2±2.0) MU、(32.7±1.8) MU、(18.7±1.3) MU和(12.2±0.6) MU，而在37 ℃培养条件下的背景活性则分别为(147.8±8.1) MU、(203.6±6.5) MU、(57.0±4.1) MU、(98.3±4.7) MU、(62.4±3.9) MU和(42.7±3.7) MU (图 8)。统计分析显示，pFGH01- pFGH06系列质粒在28 ℃培养条件下的背景活性均极显著低于其在37 ℃培养条件下的背景活性(P < 0.01)；在两种温度下，质粒pFGH06的背景活性均显著低于同系列其他质粒(P < 0.01)，而质粒pFGH01和pFGH02的背景活性则显著高于其衍生质粒pFGH03和pFGH04 (P < 0.01)。作为对照的启动子报告质粒pRCL在两种温度下的背景活性分别为(21.3±1.7) MU和(20.6±1.2) MU (图 8)，无显著差异(P > 0.05)，但均显著高于质粒pFGH06在28 ℃培养条件下的背景活性(P < 0.01)。
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| 图 8 启动子报告质粒的背景活性 Fig. 8 The background activity of promoter reporter plasmids. |
| 图选项 |
2.5 启动子araBAD和rpsM的活性测定重组菌株β-半乳糖苷酶活性测定结果显示，诱导前(0 h)启动子araBAD的活性仅为(5.3±0.2) MU，加入阿拉伯糖诱导1 h、2 h和3 h后的启动子活性分别为(2 276.4±52.2) MU、(4 407.8±91.3) MU、(9 160.5±163.0) MU，较诱导前上调了429.5倍、831.7倍和1 728.4倍；与之相应的是，组成型启动子rpsM在0 h的活性即为(6 423.7±138.4) MU，1 h、2 h和3 h的活性分别为(8 670.3±310.8) MU、(1 0245.0±154.3) MU、(12 081.7±253.6) MU，仅为0 h活性的1.3倍、1.6倍和1.9倍(图 9)。
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| 图 9 启动子araBAD和rpsM活性 Fig. 9 The activity of promoter araBAD and rpsM. |
| 图选项 |
2.6 启动子筛选测试在含有X-gal的LB抗性平板上大肠杆菌MC4100 (pFGH06-rpsM)菌落呈蓝色(图 10A)，在含有X-gal/阿拉伯糖的LB抗性平板上大肠杆菌MC4100 (pFGH06-araBAD)菌落也呈蓝色(图 10B)，而大肠杆菌MC4100 (pFGH06)在这两种平板上的菌落则均为白色。以引物DSeq-F/ DSeq-R对随机挑取培养的目的克隆进行菌液PCR鉴定，所有克隆均可扩增出预期目的条带，大小分别约为498 bp和1 571 bp (图 10C)，随机送样测序结果也均符合预期。
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| 图 10 大肠杆菌MC4100 (pFGH06-rpsM) (A)和MC4100 (pFGH06-araBAD) (B)的菌落形态和PCR鉴定(C) Fig. 10 Colony morphology of E. coli MC4100(pFGH06-rpsM) (A) and MC4100(pFGH06-araBAD) (B) and PCR identification (C). M: DNA marker DL5 000; 1–10: pFGH06-rpsM; 11–20: pFGH06-araBAD. |
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3 讨论β-半乳糖苷酶广泛存在于多种生物中，能水解乳糖为半乳糖和葡萄糖，也具有转移半乳糖苷的作用，可将乳糖转变为异乳糖，而后者是乳糖操纵子的诱导物，在细菌的代谢过程中有着非常重要的作用[23]。此外，β-半乳糖苷酶性质稳定，能使多种底物显色，具有多样化的读出过程，且在厌氧环境下仍能发挥功能，这些优点使得其编码基因lacZ自20世纪60年代末被分离以来就成为基因工程实验中的一个常用报告基因[11-13, 24]，其中用于启动子的筛选、验证或效能测定等便是其众多应用中非常重要的一个方面。
在实际应用中，为了降低潜在的背景活性干扰，基于lacZ基因的原核启动子报告系统多以低拷贝质粒为骨架构建而成，但由于体积较大，会导致实验操作成本增加并降低对弱启动子的检测灵敏度。为解决上述问题，本研究将pUC型质粒复制子引入到启动子报告系统之中。作为质粒pBR322的衍生体，pUC型质粒的复制子缺乏控制拷贝数的rop基因，同时在复制引物RNAⅡ区域存在点突变，这使得其在大肠杆菌内的拷贝数数倍于亲本质粒，不过降低培养温度可抑制这一表型效应[25]，这一结论也在本次研究中再次得到证实，以高拷贝质粒pFLX107 (pUC型质粒)为基础构建而成的系列质粒pFGH01-pFGH06在28 ℃培养条件下的背景活性均极显著低于其在37 ℃培养条件下的背景活性。而基于p15A复制子的参考质粒pRCL在这两种温度下的活性大小相近，没有显著差异。值得注意的是，在两种温度下，质粒pFGH01和pFGH02的背景活性均显著高于其衍生质粒pFGH03和pFGH04。鉴于两者在结构上仅相差一个终止子t0，因此对这一现象的可能解释便是，t0的加入有效阻止了多克隆位点前序列中潜在的启动子泄露。
在所构建的pFGH系列质粒中，pFGH06的背景活性显著低于同系列其他质粒，在28 ℃培养条件下甚至显著低于低拷贝参考质粒pRCL的活性。进一步的评估测试显示，质粒pFGH06可用于诱导型启动子和组成型启动子的克隆及活性测定，而且在模拟应用于启动子筛选时，仅通过蓝白斑筛选即可实现对于目标启动子的完全识别。这一切也表明，只要进行合理的序列结构设计，同时改进和完善相关实验方法，pUC型高拷贝质粒亦可用作启动子报告系统。
与已报道的研究相比，本研究中所构建的原核启动子报告系统pFGH06具有以下优点：①pUC型质粒为高拷贝质粒，但由于pUC型质粒复制子的温度相关性，使得其在具体应用时具有一定的灵活性，可根据实验目的进行相应培养温度的调整，从而调节其背景活性；②更小的体积(仅4 949 bp)，有利于提高质粒的稳定性和转化效率；③在紧邻报告基因前无启动子区域具有更多的克隆位点，便于序列中含有酶切位点启动子的克隆或筛选；④对原核启动子具有高效的识别效率。这些特点使得其在用于原核启动子的筛选和鉴定时具有更大的适应性，预期具有广泛的应用前景。
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