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小鼠生长过程中肝、肺、肾胶原蛋白与MMP-1含量变化

本站小编 Free考研考试/2021-12-26

高建萍1,2, 张扬1, 邢芳毓1, 孔英俊1,2, 张贵锋1,2
1. 中国科学院 过程工程研究所 生化工程国家重点实验室,北京 100190;
2. 中国科学院大学 化学工程学院,北京 100049
收稿日期:2020-03-18;接收日期:2020-08-13
基金项目:国家重点研发计划(Nos. 2018YFA0108200, 2018YFC1106400), 广州市科技计划项目(No. 201803010086) 资助

摘要:利用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC) 和酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunoassay,ELISA) 对小鼠生长过程中肝、肺、肾胶原蛋白与基质金属蛋白酶-1 (Matrix metalloproteinase-1,MMP-1) 含量变化规律进行研究。以0–18周的小鼠肝、肺、肾为研究对象,通过HPLC法对不同周龄小鼠肝、肺、肾中羟脯胺酸(Hydroxyproline,Hyp) 含量及比例进行测定,并换算得到胶原蛋白的含量;利用ELISA检测不同周龄小鼠肝、肺、肾中MMP-1的含量和活性。结果表明,小鼠肝、肺、肾中胶原含量各不相同(肺(COL) > 肾(COL) > 肝(COL)),且随着周龄的增加胶原蛋白含量变化均呈先增加后降低的趋势。其中肝、肺、肾中胶原蛋白含量分别在第9、6、9周达到最高值,分别为5.52 ng/mg、54.10 ng/mg、19.20 ng/mg;9–18周呈缓慢降低趋势。ELISA检测结果表明,小鼠肝、肺、肾中MMP-1的含量随周龄增加呈先降低后增加的趋势,MMP-1活性的变化趋势与之相反。这表明组织内胶原蛋白含量的增加会抑制MMP-1的分泌。
关键词:生长过程肝脏肺脏肾脏胶原蛋白含量基质金属蛋白酶-1
Changes of collagen and MMP-1 in liver, lung and kidney during growth of mice
Jianping Gao1,2, Yang Zhang1, Fangyu Xing1, Yingjun Kong1,2, Guifeng Zhang1,2
1. National Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China;
2. School of Chemical and Engineering, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Received: March 18, 2020; Accepted: August 13, 2020
Supported by: National Key Technology Research and Development Programs of China (Nos. 2018YFA0108200, 2018YFC1106400), Science and Technology Program of Guangzhou, China (No. 201803010086)
Corresponding author: Guifeng Zhang. Tel/Fax: +86-10-82613421; E-mail: gfzhang@ipe.ac.cn.

Abstract: The high performance liquid chromatography (HPLC) and enzyme-linked immunoassay (ELISA) were used to investigate the changes of collagen and matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) in liver, lung and kidney during growth process of mice. The mice from 0 to 18 weeks were used as the research objects. The contents and proportions of hydroxyproline (Hyp), which were used to calculate the collagen contents, in liver, lung and kidney of different weeks were analyzed with HPLC. The contents and activity of MMP-1 in liver, lung and kidney of different weeks were analyzed with ELISA. The results showed that the collagen contents in liver, lung, and kidney were different (Lung(COL) > Kidney(COL) > Liver(COL)), and they all increased first and then decreased with weeks. The collagen contents in liver, lung, and kidney reached the highest level in the ninth (5.52 ng/mg), sixth (54.10 ng/mg) and ninth (19.20 ng/mg) week, respectively. Then it declined slowly from 9 to 18 weeks. The result of ELISA showed that the MMP-1 contents in liver, lung and kidney decreased first and then increased with weeks, and the trend of MMP-1 activity was opposite. It indicated that the increase of collagen contents in the tissues will inhibit the secretion of MMP-1.
Keywords: growth processliverlungkidneycollagen contentmatrix metalloproteinase-1
胶原蛋白是哺乳动物细胞外基质的主要成分,约占总蛋白含量的25%–30%[1-2]。目前文献中报道的胶原蛋白有28种[3],主要分布于皮肤、骨骼、肌腱、血管壁和牙齿等部位[4-5],并广泛分布于结缔组织的间质中,是一些重要脏器如肝脏、肺脏和肾脏间质组织中的重要成分[6-9]。胶原蛋白分子都是由3条左手螺旋的α肽链构成的呈右手旋转的超三螺旋结构,其一级结构均为(Gly-X-Y)n的重复序列(其中X多为Pro,Y多为Hyp)[10-12],其中羟脯胺酸(Hydroxyproline,Hyp) 为胶原蛋白中特有的氨基酸,其含量与动物来源、组织类型及年龄等密切相关[13-14]。正常组织中胶原蛋白的稳态由合成和降解途径共同调控,基质金属蛋白酶-1 (Matrix metalloproteinase-1,MMP-1) 是调节胶原蛋白降解的关键酶[15-16],它对胶原蛋白的降解是发育、组织重塑和肿瘤增殖等的关键步骤[17-18]
胶原蛋白作为细胞外基质的主要成分,其含量与动物组织的年龄和功能性质密切相关。Rotter等利用Hyp检测法研究了鼻软骨中胶原蛋白含量与年龄的变化关系,研究结果表明,30岁以前人鼻软骨的机械性能与胶原蛋白含量密切相关[19];Bailey等研究了人类骨头中骨胶原的含量与年龄的关系,结果表明,随着年龄的增加人骨中胶原含量呈降低趋势[20];Mays等研究老鼠骨骼、心脏、皮肤中胶原的合成和降解随年龄的变化,结果表明,随着年龄的增加,小鼠体内胶原蛋白的合成速率显著降低[15]。有文献报道,胶原蛋白的含量与某些疾病的发生密切相关,Rojkind等研究表明,肝硬化组织中胶原含量是正常肝组织中胶原含量的4–7倍[21];聂丽等研究表明,肺纤维化与Ⅰ型胶原的过度沉积有关[22];Omireeni等研究表明,胶原蛋白的含量和胶原纤维的分布与肾脏疾病的发生相关[23]。因此,系统地分析动物生长过程中肝、肺、肾中胶原蛋白与MMP-1的含量变化规律对于相关疾病和生理状态的判断具有重要的意义。
本研究拟以小鼠肝、肺、肾为研究对象,通过高效液相色谱法,研究不同周龄的小鼠肝、肺、肾中Hyp的比例及含量,换算得到生长过程中小鼠肝、肺、肾中胶原蛋白含量的变化规律。通过ELISA法测定各周龄小鼠肝、肺、肾中MMP-1的含量,明确MMP-1与胶原蛋白含量变化的关系。
1 材料与方法1.1 材料小鼠(C57BL/6N,雄性) 购自北京维通利华实验动物技术有限公司;氨基酸标准品、2, 4-二硝基氟苯(DNFB) 购自美国Sigma公司;小鼠MMP-1试剂盒购自武汉Cloud-clone公司;色谱纯乙腈(ACN) 及甲酸(FA) 购自Merck公司;其他试剂均为市售分析纯。
1.2 仪器U3000液相色谱,美国赛默飞世尔科技有限公司,采集软件为Xcalibur 3.1;LGJ-100F真空冷冻干燥机,北京松源华兴科技发展有限公司;HC-2518R高速冷冻离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司;MYP19-2磁力搅拌器,上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司。
1.3 Hyp含量分析1.3.1 小鼠内脏预处理分别取0、1、3、6、9、12、15、18周小鼠,分为8组,每组设置6只小鼠,进行平行试验。脱颈处死小鼠,取出肝、肺、肾,用生理盐水清洗表面血渍,用滤纸吸干表面水分,称重,冷冻干燥,粉碎;每个样品用10倍体积的Tris-HCl (0.1 mol/L,pH 7.5,含5%曲拉通-100) 于4 ℃搅拌处理48 h,除去杂质,每隔12 h换液一次;再用超纯水于4 ℃搅拌处理24 h,每隔12 h换液一次,去除样本中残留的试剂;冷冻干燥,称重,保存待用[24]
1.3.2 水解准确称取10 mg肝、肺、肾冻干样本分别置于安剖瓶中,各加入2 mL HCl (6 mol/L),封口,110 ℃条件下水解12 h,取出,冷却至室温,用6 mol/L NaOH调至中性,转移至容量瓶中并用超纯水分别定容至10 mL。
1.3.3 氨基酸衍生取样品、氨基酸标准品、超纯水(空白对照) 各200 μL,分别加入100 μL 0.5 mol/L NaHCO3、20 μL DNFB (1%),于60 ℃避光衍生1 h,冷却至室温,各组分别加入680 μL 0.1 mol/L KH2PO4,10 000 r/min离心10 min。
1.3.4 HPLC分析氨基酸高效液相色谱分离条件,色谱柱:Zorbax C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:A为0.05 mol/L乙酸钠水溶液,B为50%乙腈水溶液(V/V);梯度:0–15 min,30%–55% B,15–25 min,55%–100% B,25–35 min,100%–30% B,35–45 min,30% B保持10 min;流速:0.5 mL/min;检测波长:360 nm;柱温:30 ℃;上样量5.0 μL[25]
1.3.5 胶原含量计算公式胶原蛋白含量按以下3个公式计算:
(公式 1)
(公式 2)
(公式 3)
其中:C为Hyp占总胶原蛋白的质量分数;m为经过液相检测的样品中Hyp的质量;M为样品中胶原蛋白的质量。
1.4 MMP-1含量检测1.4.1 样品预处理将冻干的肝、肺、肾样本充分研磨成粉末,每个样品各取5 mg,加入2 mL磷酸盐缓冲液(pH 7.4),4 ℃搅拌提取12 h,取出,10 000 r/min离心10 min,取上清,待用。
1.4.2 ELISA检测MMP-1的检测采用双抗夹心ELISA法[26],具体方法参照试剂盒说明书进行,操作步骤如下:(1) 加样:分别设置标准孔、待测样品孔、空白孔。依次加入100 μL不同浓度的标准品、空白孔加100 μL标准品稀释液、余孔加100 μL待测样品,酶标板上覆膜,37 ℃温浴1 h,弃去液体后甩干。(2) 每孔加100 μL检测溶液A工作液,酶标板覆膜,37 ℃温浴1 h。每孔加350 μL洗涤液,浸泡1–2 min,甩干,该过程重复3次。(3) 每孔加100 μL检测溶液B工作液,酶标板覆膜,37 ℃温浴30 min。每孔加350 μL洗涤液,浸泡1–2 min,甩干,该过程重复5次。(4) 每孔加90 μL TMB底物溶液,酶标板覆膜,37 ℃避光显色,反应10–20 min,每孔加50 μL终止液,终止反应,轻轻摇匀。(5) 立即用酶标仪在450 nm测量各孔的光密度值(OD450)。(6) 根据标准品建立标准曲线,代入公式得到样品中活性生长因子含量,再换算成其在肝、肺、肾中样品干重中的含量。
MMP-1活性检测采用双抗夹心ELISA法,具体方法参照试剂盒说明书进行,操作步骤如下:(1) 加样:分别设置标准孔、待测样品孔、空白孔。依次加入50 μL不同浓度的标准品、空白孔加50 μL标准品稀释液、余孔加50 μL待测样品。(2) 温浴:酶标板上覆膜,37 ℃温浴0.5 h。(3) 配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。(4) 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干。每孔加满洗涤液,静置30 s后弃去,如此重复5次,拍干。(5) 加酶:每孔加入50 μL酶标试剂,空白孔除外。(6) 温浴:操作同(2)。(7) 洗涤:操作同(4)。(8) 显色:每孔先加入50 μL显色剂A,再加入50 μL显色剂B,37 ℃避光显色10 min。(9) 终止:每孔加50 μL终止液,终止反应。(10) 测定:以空白孔调零,450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD450)值。
1.5 统计学方法采用SAS 9.3统计软件处理数据,数据用x±s表示,对各组数据进行单因素方差分析,组间比较采用SNK-q检验,P≤0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析2.1 小鼠肝、肺、肾中Hyp含量变化分析实验通过HPLC法检测了0–18周小鼠肝、肺、肾中的Hyp含量。图 1为19种氨基酸标准品色谱图,其中保留时间为7.29 min的色谱峰为Hyp。表 1为不同周龄小鼠肝、肺、肾中每1 000个氨基酸中Hyp数量。结果表明,在0–15周时,肝脏胶原中Hyp数量随着年龄的增加而增加。其中,0周小鼠肝脏胶原中每1 000个氨基酸中Hyp平均数量为45.67,15周时增加至74.19;15–18周,肝脏胶原中Hyp数量基本保持不变;肺脏和肾脏中Hyp含量变化表现为,0–12周内,每1 000个氨基酸中Hyp平均数量分别由43.59和35.47增加至88.20和79.74;12–18周内,Hyp数量均随周龄的增加反而呈降低趋势,分别降至76.75和55.65。
图 1 19种氨基酸标准品液相色谱图 Fig. 1 Liquid chromatogram of 19 amino acid standards.
图选项




表 1 不同周龄小鼠肝、肺、肾中每1 000个氨基酸中Hyp数量Table 1 Number of hydroxyproline in every 1 000 amino acids in liver, lung and kidney of mice of different weeks
Weeks Liver Lung Kidney
0 45.67±2.15 43.59±1.99 35.47±0.87
1 49.52±2.72 48.24±3.04 37.17±1.15
3 47.56±1.93 53.35±2.19 42.24±1.32
6 42.48±2.01 67.17±3.27 47.47±2.15
9 57.71±2.14 77.00±2.94 48.00±3.01
12 66.50±1.87 88.20±3.33 79.74±2.72
15 74.19±2.96 75.38±1.57 66.29±2.68
18 73.76±3.05 76.75±4.02 55.65±2.12

表选项


综上,小鼠肝、肺、肾中羟脯胺酸羟基化修饰的比例与其生长发育程度相关,即在小鼠的快速生长发育时期,其胶原蛋白的Hyp比例会随着年龄的增加而增加,当生长发育成熟之后,Hyp比例呈缓慢降低趋势。
2.2 小鼠肝、肺、肾中胶原蛋白含量变化分析取不同浓度的Hyp标准溶液,从低浓度到高浓度分别进样10 μL,按照1.4中列举的方法进行分析。图 2为不同浓度的Hyp标准品的液相色谱图,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归。回归方程及线性范围为y=9 470.7x+5 488.2 (R2=0.999 9),在4–400 μg/mL范围内线性良好。
图 2 不同浓度Hyp标准品液相色谱图 Fig. 2 Liquid chromatograms of different concentrations of hydroxyproline standard.
图选项




各称取10 mg冻干后的内脏样品,经盐酸水解、中和、衍生后根据上述方法分析,图 3为9周龄小鼠肝、肺、肾的氨基酸液相色谱图,根据Hyp标准曲线和1.3.5公式计算得到各脏器中胶原蛋白的含量,图 4为小鼠肝、肺、肾中胶原蛋白含量随周龄的变化趋势。结果表明,在0–3周范围内小鼠肝脏中胶原蛋白含量随周龄的增加而显著增加(P < 0.01),由2.23 μg/mg增加至5.36 μg/mg;3–12周肝脏中胶原含量保持稳定,在5.31–5.52 μg/mg之间;在12–18周范围内,小鼠肝脏中胶原含量随着周龄的增加而降低,其中12–15周降低显著(P < 0.05),由5.42 μg/mg降低至3.95 μg/mg,第18周时降低至3.63 μg/mg,且低于1周龄的含量。与9周龄的最高含量相比,第18周的胶原含量降低34.29%。
图 3 9周龄的小鼠肝、肺、肾氨基酸液相色谱图 Fig. 3 Amino acid liquid chromatogram of liver, lung and kidney of 9-week-old mice.
图选项




图 4 小鼠肝、肺、肾中胶原蛋白含量随周龄的变化 Fig. 4 Changes of collagen content in liver, lung and kidney of mouse with weeks.
图选项




小鼠肺脏中胶原蛋白含量在0–3周范围内随周龄的增加显著增加(P < 0.005),由6.62 μg/mg增加至50.25 μg/mg,6周时达到最高值54.10 μg/mg;9–15周肺脏中胶原含量显著降低(P < 0.005),第15–18周缓慢降低。与第6周的最高含量相比,第18周时肺部胶原含量降低25.97%。
小鼠肾脏中的胶原蛋白含量在0–3周范围内随周龄的增加显著增加(P < 0.005),由3.80 μg/mg增加至12.86 μg/mg,第3–9周增加速度缓慢,第9周时达到最高值19.20 μg/mg;9–12周肾脏中胶原含量随周龄的增加而显著降低(P < 0.005),第18周降低至10.04 μg/mg,且低于第1周龄的含量。与第9周的最高含量相比,第18周时肾脏胶原含量降低47.71%。
综上,小鼠肺脏中的胶原蛋白含量最高,肾脏其次,肝脏最低。小鼠肝、肺、肾中总胶原蛋白含量均随周龄增加呈现先增加后降低的趋势。三种脏器中胶原蛋白含量均在第6–9周达到最高值;在第12–18周呈降低趋势。其中在第18周时,肝脏和肾脏胶原蛋白含量均低于第1周的含量,肺脏中胶原蛋白含量低于第3周的含量。
2.3 小鼠肝、肺、肾中MMP-1含量变化分析通过ELISA的方法对不同周龄小鼠肝、肺、肾中MMP-1的含量进行分析,结果如图 5所示,小鼠肝、肺、肾中MMP-1的含量均随周龄的增加呈先降低后增加的趋势。肝脏中MMP-1的含量在0–1周和3–6周范围内呈明显降低趋势(P < 0.05),9–12周范围降低最明显(P < 0.005),12周迅速降低至最低(40 pg/mg),12周的含量为0周的5.9%;12–18周呈显著增加趋势(P < 0.005),18周时达到230 pg/mg,为0周的33.82%;小鼠肺脏中MMP-1变化趋势与肝脏相似,其中0–9周肺脏中MMP-1的含量呈显著降低趋势(P < 0.05),9–12周降低趋势最显著(P < 0.005),12周时降低至190 pg/mg,为0周的31.67%,12–18周显著增加(P < 0.005),第18周MMP-1的含量高于0周含量;小鼠肾脏中的MMP-1含量变化除3–6周之外,其余相邻两组之间变化均比较显著(P < 0.005),第12周时为最低值,降低至170 pg/mg,为0周的13.18%,18周时增加至770 pg/mg,为0周的59.69%。
图 5 小鼠肝、肺、肾中MMP-1含量随周龄的变化 Fig. 5 Changes of MMP-1 content in liver, lung and kidney of mouse with weeks.
图选项




综上,小鼠肝、肺、肾中MMP-1的含量均随周龄的增加呈先降低后增加的趋势,肝脏和肺脏中MMP-1含量相当,肾脏中MMP-1含量最高。三种脏器中MMP-1含量均在第12周时达到最低值。
2.4 小鼠肝、肺、肾中MMP-1活性变化分析利用ELISA对不同周龄的小鼠肝、肺、肾中MMP-1活性进行检测,结果如图 6所示,小鼠肝、肺、肾中MMP-1的活性随周龄的增加呈先增加后降低的趋势。肝脏中MMP-1的活性在0–3周范围内呈明显增加趋势(P < 0.005),3周后开始呈降低趋势,3–9周降低趋势明显(P < 0.005),9–12周呈缓慢降低趋势,18周达到最低值,18周的活性为0周的3.06%;肺脏中MMP-1的活性与肾脏和肝脏相比最高,在0–1周和6–9周之间基本无变化,1–3周呈快速增加趋势(P < 0.005),6周达到最高值,6–18周呈快速降低趋势(P < 0.005),18周MMP-1的活性为0周的30.90%;肾脏中MMP-1的活性在0–3周内呈快速增加趋势(P < 0.005),3–9周缓慢降低(P < 0.01),9–15周呈快速降低趋势(P < 0.005),18周降至最低值,为0周的11.84%。
图 6 小鼠肝、肺、肾中MMP-1活性随周龄的变化 Fig. 6 Changes of MMP-1 activity in liver, lung and kidney of mouse with weeks.
图选项




综上,小鼠肝、肺、肾中MMP-1的活性均随周龄的增加呈先增加后降低的趋势,肝脏和肾脏中MMP-1活性相当,肺脏中MMP-1活性最高。三种脏器中MMP-1活性均在第3–6周时达到最高值。
3 讨论胶原蛋白作为细胞外基质的主要成分,在动物生长发育过程中发挥重要作用。研究表明在成年之前,动物体内胶原蛋白合成活跃,与年龄呈正相关;然而随着个体年龄增长,各组织中胶原的代谢速率大于合成速率,表现为随年龄呈负相关的增加趋势[15]。而且肝硬化、肺纤维化、肾炎等相关疾病都与胶原蛋白的含量相关,但目前关于肝、肺、肾中胶原蛋白含量在生长过程中的变化尚未有报道。
本实验选择0–18周小鼠作为研究对象,研究了不同周龄小鼠肝、肺、肾中Hyp含量及比例的变化。Hyp作为胶原蛋白的特征氨基酸,可根据其比例及含量换算得到胶原蛋白含量。本研究结果显示,在小鼠肝、肺、肾中,胶原蛋白的含量均随周龄的增加呈先增加后降低的趋势,在6–9周达到最高值。由于肝、肺、肾等组织中Ⅰ型胶原最丰富,还含有少量的Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原,而MMP-1是Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的降解酶,是控制体内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在体内降解的主要因素,MMP-1的活性在多个水平上受调节,包括合成、激活、活性抑制和降解。因此,本研究利用ELISA测定了不同周龄的肝、肺、肾中MMP-1的含量和活性。结果显示,MMP-1的含量均随年龄的增加先降低后增加,在12周达到最低值;而MMP-1的活性随周龄的增加呈现先增加后降低的趋势,在3–6周达到最高值。胶原蛋白和MMP-1变化呈相反的趋势,而与MMP-1的活性呈相似趋势。这可能是由于从出生到成年阶段体内胶原蛋白的合成速率在逐渐增加,胶原蛋白的大量合成可能会抑制MMP-1的合成,因此,体内MMP-1的含量从出生到成年期逐渐降低,而MMP-1的活性会随着小鼠的生长发育逐渐增加,发育到3–6周时达到最大活性。虽然MMP-1活性的增加会加速胶原蛋白的降解,但由于在幼年阶段小鼠体内胶原蛋白的合成速率较高,因此,在这个阶段,胶原蛋白的含量仍呈现增加趋势,这就使合成的胶原蛋白主要用于组织的正常生长发育。在6–9周胶原蛋白含量达到最高值,而MMP-1的含量均在12周时达到最低值,12周之后开始逐渐增加,这可能是由于成年期之后虽然胶原蛋白的含量开始降低,但MMP-1的合成需要一定的时间。这就使得体内MMP-1的含量从12周之后开始逐渐增加。而MMP-1的活性在3周或6周之后均呈现快速降低趋势,但8–9周为小鼠的成年期,在成年期之后胶原蛋白的合成速率会大大降低,因此,在9–12周,即使MMP-1含量和活性均较低的情况下,小鼠肝、肺、肾中的胶原蛋白含量也开始降低。其中肺和肾中在18周时MMP-1含量均增加至0周的50%以上,这与肺和肾中胶原蛋白含量在9–18周时均呈显著降低(P < 0.005) 相对应;而肝脏中的MMP-1在18周时仅增加至0周的33%,而肝脏中胶原蛋白含量仅在12–15周范围内显著降低(P < 0.05)。这表明,在成年期之后胶原蛋白的降低量与MMP-1的增加量相关。
本研究表明,小鼠生长过程中肝、肺、肾中胶原蛋白含量变化呈先增加后降低的趋势,均在成年期达到最高值,且胶原蛋白与MMP-1的含量和活性变化分别呈相反和相似的趋势,胶原含量受MMP-1含量和活性两个方面的控制。
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