1. 天津科技大学 生物工程学院，天津 300457;
2. 中国科学院系统微生物工程重点实验室，天津 300308;
3. 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308
收稿日期：2019-05-14；接收日期：2019-08-13；网络出版时间：2019-09-10
基金项目：中国科学院前沿科学重点研究项目(No. QYZDB-SSW-SMC012)，中国科学院战略生物资源计划(No. KFJ-BRP-009)，中国科学院重点部署项目(No. KFZD-SW-215)，中国科学院国际合作局对外合作重点项目(No. 153D31KYSB20170121)，国家自然科学基金(Nos. 31700044, 31870044)资助
摘要：近年来，基于CRISPR/Cas9的碱基编辑技术因其具有不产生DNA双链断裂、无需外源DNA模板、不依赖宿主同源重组修复的优势，已经逐渐发展成为一种强大的基因组编辑工具，在动物、植物、酵母和细菌中得到了开发和应用。研究团队前期已在重要的工业模式菌株谷氨酸棒杆菌中开发了一种多元自动化的碱基编辑技术MACBETH，为进一步优化该方法，提高碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中的应用效率，本研究首先在谷氨酸棒杆菌中构建了基于绿色荧光蛋白(GFP)的检测系统：将GFP基因的起始密码子ATG人工突变为ACG，GFP无法正常表达，当该密码子的C经编辑后恢复为T，即实现GFP蛋白的复活，结合流式细胞仪分析技术，可快速衡量编辑效率。然后，构建针对靶标位点的碱基编辑工具，经测试，该位点可成功被编辑，在初始编辑条件下碱基编辑效率为(13.11±0.21)%。在此基础上，通过对不同培养基类型、诱导初始OD600、诱导时间、诱导物浓度进行优化，确定最优编辑条件是：培养基为CGXII，初始OD600为0.05，诱导时间为20 h，IPTG浓度为0.01 mmol/L。经过优化，编辑效率达到(30.35±0.75)%，较初始条件提高了1.3倍。最后，选取原编辑条件下编辑效率较低的位点，进行了优化后编辑条件下的编辑效率评估，结果显示，不同的位点在最优编辑条件下的编辑效率提高了1.7–2.5倍，进一步证实该优化条件的有效性及通用性。研究结果为碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中更好的应用提供了重要的参考价值。
关键词：碱基编辑谷氨酸棒杆菌CRISPR/Cas系统编辑条件
Optimization of base editing in Corynebacterium glutamicum
Junwei Li1,2*, Ye Liu2,3*, Yu Wang2,3, Peng Yu1, Ping Zheng2,3, Meng Wang2,3
1. School of Biological Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China;
2. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China;
3. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China
Received: May 14, 2019; Accepted: August 13, 2019; Published: September 10, 2019
Supported by: Key Project of Chinese Academy of Sciences (No. QYZDB-SSW-SMC012), Biological Resources Programme of Chinese Academy of Sciences (No. KFJ-BRP-009), Key Research Program of the Chinese Academy of Sciences (No. KFZD-SW-215), International Partnership Program of Chinese Academy of Sciences (No. 153D31KYSB20170121), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31700044, 31870044)
Corresponding author: Meng Wang. Tel: +86-22-24828791; E-mail: wangmeng@tib.cas.cn.
*These authors contributed equally to this study.
Abstract: In recent years, CRISPR/Cas9-mediated base editing has been developed to a powerful genome editing tool, providing advantages such as without introducing double-stranded DNA break, a donor template and relying on host homologous recombination repair pathway, and has been widely applied in animals, plants, yeast and bacteria. In previous study, our group developed a multiplex automated base editing method (MACBETH) in the important industrial model strain Corynebacterium glutamicum. In this study, to further optimize the method and improve the base editing efficiency in C. glutamicum, we first constructed a green fluorescent protein (GFP) reporter-based detection system. The point mutation in the inactivated GFP protein can be edited to restore the GFP fluorescence. By combining with flow cytometry analysis, the base-editing efficiency can be quickly calculated. Then, the base editor with the target gRNA was constructed, and the editing efficiency with the initial editing condition was (13.11±0.21)%. Based on this result, the editing conditions were optimized and the result indicated that the best medium is CGXII, the best initial OD600 of induction is 0.05, the best induction time is 20 h, and the best IPTG concentration is 0.01 mmol/L. After optimization, the editing efficiency was improved to (30.35±0.75)%, which was 1.3-fold of that in initial condition. Finally, endogenous genomic loci of C. glutamicum were selected to assess if the optimized condition can improve genome editing in other loci. Editing efficiency of different loci in optimized condition were improved to 1.7–2.5 fold of that in original condition, indicating the effectiveness and versatility of the optimized condition. Our research will promote the better application of base editing technology in C. glutamicum.
Keywords: base editingCorynebacterium glutamicumCRISPR/Cas systemediting condition
碱基编辑技术是近两年发展起来的新型基因组编辑技术，它结合了CRISPR/Cas系统的定位功能与碱基脱氨酶的编辑功能，可以实现在特定位点的碱基替换。相比较于CRISPR/Cas介导的基因组编辑，碱基编辑技术不产生双链DNA断裂(Double-stranded DNA break，DSB)，不需要外源模板且不依赖于宿主的同源重组修复，能够实现原核生物多位点编辑，极大地丰富了原核生物的基因组编辑[1]。David Liu研究团队率先将鼠源胞嘧啶脱氨酶APOBEC1与d/nCas9蛋白进行融合，开发了碱基编辑工具BE (Base editor)，实现了在哺乳动物细胞中胞嘧啶(Cytosine，C)到胸腺嘧啶(Thymine，T)的单碱基转换[2]；与此同时，Akihiko Kondo研究团队则采用七鳃鳗来源的胞嘧啶脱氨酶PmCDA1与d/nCas9蛋白进行结合，开发了适用于酵母与哺乳动物细胞的碱基编辑工具Target-AID (Activation-induced cytidine deaminase)[3]。随后多个实验室分别在不同的动植物和微生物中进行了碱基编辑系统的开发与优化[4-7]。之前的研究工作中，本研究团队已在重要的工业模式菌株谷氨酸棒杆菌中首次开发了一种多元自动化的碱基编辑方法MACBETH (Multiplex automated Corynebacterium glutamicum base editing method)，实现在C. glutamicum基因组靶标位点C到T的转化[8]。MACBETH技术与谷氨酸棒杆菌中已建立的基于CRISPR/Cas9或Cpf1的基因组编辑技术[9-10]相比，具有诸多优势(表 1)，不仅高效、简便、易于高通量操作，还可以实现2个或3个靶基因的同时编辑，同时，MACBETH技术实现了从质粒构建、基因组编辑、获取正确突变株和表型验证的全流程自动化操作。
表 1 谷氨酸棒杆菌中CRISPR/Cas编辑技术与MACBETH技术的比较Table 1 Comparison between CRISPR/Cas system and MACBETH in C. glutamicum
| Property | CRISPR/Cas | MACBETH (base editing) |
| Double-stranded DNA break (DSB) | Yes | No |
| Gene editing | Depends on donor DNA templates and host homologous recombination repair pathway | Point mutations (without donor DNA templates and host homologous recombination repair pathway) |
| Efficiency | Low to Moderate | Moderate to high |
| Target sites | Depends on PAM motif | Depends on PAM motif and editing window |
| Multiplex editing | Achieves single-, double-locus editing | Achieves single-, double-, and triple-locus editing |
| Library construction | Difficult | Easy |
| Iterative operation | Yes (plasmid curing firstly) | Yes (plasmid curing firstly) |
| Operation time for one round editing | About two weeks | About two weeks |
表选项
目前，碱基编辑工具的开发与优化仅侧重于基因层面的改造[11-13]，而编辑过程中的培养条件、诱导条件、编辑时间等因素的研究对于优化融合蛋白的表达、提高编辑效率同样至关重要。因此，为进一步提高MACBETH技术在谷氨酸棒杆菌中的编辑效率，本研究首先在谷氨酸棒杆菌中构建了基于绿色荧光蛋白(GFP)的检测系统，通过碱基编辑工具编辑，人工沉默的GFP蛋白可以重新被激活，通过流式细胞仪分析表达GFP蛋白的细胞的比例，以此快速衡量编辑效率；在此基础上，通过对培养基种类、诱导时初始OD600、编辑时间、诱导剂浓度进行优化，得到碱基编辑工具最优编辑条件；最后，选取基因组中其他位点进行编辑，进一步对该最优编辑条件进行验证。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种和质粒本研究所用菌株和质粒均为笔者实验室购买和保存，详见表 2。
表 2 本文所用的质粒与菌株Table 2 Plasmids and strains used in this study
| Name | Source |
| Plasmids | |
| pK18mobsacB-ΔldhA::gfp | Lab stock |
| pK18mobsacB-gfpoff | This study |
| pK18mobsacB-gfpon | This study |
| pXMJ19TS-nCas9(D10A)-AID-gRNA::ccdB | Lab stock |
| pXMJ19TS-nCas9(D10A)-AID-gRNA(gfp) | This study |
| Strains | |
| Escherichia coli DH5α | Lab stock |
| C. glutamicum 13032 | Lab stock |
| C. glutamicum 13032ΔldhA::gfpoff | This study |
| C. glutamicum 13032ΔldhA::gfpon | This study |
| C. glutamicum 13032/nCas9(D10A)-AID-Cgl0025 gRNA | Lab stock |
| C. glutamicum 13032/nCas9(D10A)-AID-Cgl0369 gRNA | Lab stock |
| C. glutamicum 13032/nCas9(D10A)-AID-Cgl1314 gRNA | Lab stock |
表选项
1.1.2 酶、引物及相关试剂盒Q5高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司，大肠杆菌感受态细胞制备试剂盒购自TaKaRa (大连)；各种限制性内切酶购自Thermo公司；多片段同源重组试剂盒购自诺唯赞(南京)；PCR引物(表 3)由擎科生物(北京)有限公司合成；质粒小量抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
表 3 本文使用到的引物Table 3 Primers used in this study
| Primer name | Sequences (5′–3′) | Size (bp) |
| GFP-ACG-TGG-F | ACGAGTAAAGGAGAAGAACTTTGGACTGGAGTTG | 34 |
| GFP-ATG-TGG-F | ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTGGACTGGAGTTG | 34 |
| GFP-ACG-TGG-R | AAGTTCTTCTCCTTTACTCGTTCTC | 25 |
| GFP-ATG-TGG-R | AAGTTCTTCTCCTTTACTCATTCTC | 25 |
| SacB-R | CAAATTCAGAAACTTGATATTTT | 23 |
| SacB-F | AAAATATCAAGTTTCTGAATTTG | 23 |
| GFP-C-F | TTCTCCACATAAGCTGGCAATG | 22 |
| GFP-C-R | ATGTGCTGCAAGGCGATT | 18 |
| GFP2C-R | ATCTCGCAAAGCATTGAAGACC | 22 |
| GFPCX-F | GTCCGGTTAGGGAAATCAGGAA | 22 |
| GFP-gF | TTCACGAGTAAAGGAGAAGAACTT | 24 |
| GFP-gR | AAACAAGTTCTTCTCCTTTACTCG | 24 |
| 9sgCX-F | AGACTATTCTTCGCACCCAC | 20 |
表选项
1.1.3 培养基LB培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5。制备固体培养基时添加2%的琼脂。
LBG培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，葡萄糖5。制备固体培养基时添加2%的琼脂。
LAS培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，蔗糖150。制备固体培养基时添加2%的琼脂。
BHI培养基(g/L)：BHI 37，(NH4)2SO4 10，K2HPO4 0.2，NaH2PO4 0.3，MgSO4·7H2O终浓度0.5 g/L，pH 7.2。
MgSO4·7H2O为50 g/L的100×储液，于使用前稀释加入。
LBHIS培养基(g/L)：蛋白胨5，氯化钠10，酵母粉2.5，BHI 18.5，山梨醇91。
CGXII[14]培养基(g/L)：(NH4)2SO4 20，尿素5，MOPS 42，KH2PO4 1，K2HPO4·3H2O 1.3，上述成分配成水溶液，调pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。
MgSO4·7H2O 0.25，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.001，CuSO4 0.2 mg/L，NiCl2·6H2O 0.02 mg/L，上述成分配成100×混合母液，过滤除菌，于使用前稀释加入。
CaCl2 0.01，原儿茶酸0.03，生物素0.2 mg/L，VB1 0.1 mg/L，上述4种成分单独配成100×母液，过滤除菌，于使用前稀释加入。
葡萄糖5，配成100×母液，115 ℃灭菌15 min，于使用前稀释加入。
1.2 方法1.2.1 谷氨酸棒杆菌GFP基因的整合质粒pK18mobsacB-ldhA::gfp为模板，利用引物对GFP-ACG-TGG-F/SacB-R和GFP-ATG-TGG-F/ SacB-R分别扩增含M1T、F8W双位点突变和F8W单位点突变的gfp基因，利用引物对SacB-F/GFP-ACG-TGG-R和SacB-F/GFP-ATG-TGG-R扩增对应的含sacB蔗糖致死基因的pK18mobsacB质粒载体。通过多片段同源重组获得pK18mobsacB-gfpoff和pK18mobsacB-gfpon质粒。
将以上两质粒分别电转化至谷氨酸棒杆菌13032中，利用蔗糖致死筛选迫使质粒上下游同源臂和基因组ldhA基因对应位置发生双交换(图 1A)，从而使gfpoff和gfpon基因整合到谷氨酸棒杆菌基因组中。具体双交换筛选方法可参见文献[15]。
 |
| 图 1 谷氨酸棒杆菌GFP荧光检测系统示意图 Fig. 1 Schematic representation of GFP reporter-based detection system in C. glutamicum. |
| 图选项 |
因pK18mobsacB质粒无法在谷氨酸棒杆菌13032中复制，电转后将复苏时间延长至6 h，提高质粒上的同源臂与基因组重组的概率。转化子进行菌落PCR验证质粒与基因组在上游同源臂处发生单交换。单交换验证的上游引物在基因组上游同源臂的上游，下游引物在质粒下游同源臂的下游。挑取验证正确的单交换菌株至LBG液体培养基中，30 ℃、220 r/min过夜培养。移取100 μL至5 mL LAS液体培养基中，25 ℃培养16 h，适当稀释后涂布LAS平板，25 ℃培养。挑取LAS平板上的单菌落，分别接种于LBG平板和补充有25 μg/mL Kan抗性的LBG平板。挑选无法在抗性平板上生长的单菌落，进行菌落PCR验证获得正确的gfp插入菌株C. glutamicum 13032ΔldhA::gfpoff和C. glutamicum 13032ΔldhA::gfpon。
1.2.2 靶标GFP基因的碱基编辑工具的构建含GFP gRNA的质粒pXMJ19TS-nCas9 (D10A)-AID-gRNA(gfp)，下文简称pXMJ19-CAG，具体构建方法可参见文献[8]，以互补上下游引物形式合成含有GFP gRNA的N20靶标序列，通过95 ℃高温2 min，并缓慢降至室温，使上下游引物退火结合，使用BsaⅠ和T4 DNA连接酶将其与pXMJ19TS-nCas9(D10A)-AID-gRNA::ccdB质粒通过Golden Gate方法进行组装，构建得到该质粒。
1.2.3 谷氨酸棒杆菌的转化取0.5 μg pXMJ19-CAG质粒电转化至80 μL C. glutamicum 13032ΔldhA::gfpoff感受态细胞中，具体电转化参数参见文献[16]报道。转化后细胞经30 ℃后培养1 h后，涂布于含5 μg/mL Cm抗性的LBHIS固体培养基平板上，30 ℃静置培养2–3 d，直至长出单菌落。
1.2.4 谷氨酸棒杆菌的培养及碱基编辑1)种子培养
挑取生长良好的单菌落接种于每孔装有0.35 mL LBG液体培养基(含有5 μg/mL Cm)的96孔深孔板中，30 ℃、800 r/min培养24 h。
2)诱导培养
将种子培养液按初始OD600为0.2的接种量转接至新的每孔装有0.35 mL含IPTG (0.05 mmol/L)及Cm (5 μg/mL)的LBG液体培养基的96深孔板中，30 ℃、800 r/min培养16 h。单因素条件优化后应用最优条件。诱导后的菌体经流式细胞仪分析GFP复活比例。
1.2.5 流式细胞仪分析GFP蛋白复活比例将收集到的菌体，用PBS缓冲液洗2–3次，然后重悬至PBS缓冲液中，并将样品进行稀释，使得菌体OD600为0.1左右，为防止菌体黏连，将样品超声5 min。采用MoFlo XDP流式细胞仪(Beckman Coulter，德国)进行分析。采用488 nm激发通道，利用带通530/40检测GFP荧光信号。检测编辑后菌体的荧光强度，记录有荧光的细胞占所有细胞的比例，即编辑效率。单个样品检测细胞总数为100 000个。
1.2.6 碱基编辑条件的优化种子培养条件同1.2.3部分，诱导培养时，分别优化以下条件。
最优培养基的确定：分别测试LBG、BHI、CGXII、LBHIS四种培养基对编辑效率的影响。种子培养后以初始OD600 0.2转接至相应培养基中，Cm终浓度为5 μg/mL，加入终浓度0.05 mmol/L的IPTG，30 ℃、800 r/min诱导培养16 h。收集菌体，通过流式细胞仪分析编辑比例。
最优初始OD600的确定：种子培养后，分别以初始OD600为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1转接至最优培养基中，Cm终浓度为5 μg/mL，加入终浓度0.05 mmol/L的IPTG，30 ℃、800 r/min诱导培养16 h。收集菌体，通过流式细胞仪分析GFP复活比例。
最优诱导时间的确定：种子培养后，以最优初始OD600转接至最优培养基中，Cm终浓度为5 μg/mL，加入终浓度0.05 mmol/L的IPTG，30 ℃、800 r/min诱导8、12、16、20、24 h。收集菌体，通过流式细胞仪分析GFP复活比例。
IPTG最优诱导浓度的确定：种子培养后，以最优初始OD600转接至最优培养基中，Cm终浓度为5 μg/mL，分别加入终浓度0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 mmol/L的IPTG，30 ℃、800 r/min，诱导时间为最优时间。收集菌体，通过流式细胞仪分析GFP复活比例。
2 结果与分析2.1 谷氨酸棒杆菌GFP荧光检测系统的构建为方便谷氨酸棒杆菌中碱基编辑效率的快速测定与比较，本实验选择绿色荧光蛋白(GFP)作为报告蛋白，通过编辑失活GFP蛋白中的靶标位点，实现GFP蛋白的复活，结合流式细胞仪分析技术，快速衡量编辑效率。为实现上述目标，本实验首先突变原始gfp基因，通过突变起始密码子，使得GFP蛋白无法正常表达；然后引入F8W突变，人为创造PAM位点，使得ACG中的碱基C位于碱基编辑工具的编辑框内，成为靶标编辑位点，该基因命名为gfpoff。若靶标位点C被编辑为T，则恢复ATG的起始密码子功能，但F8W突变仍存在，该基因命名为gfpon (图 1B)。将gfpoff基因通过自杀式质粒等位基因交换的方法(图 1A)，整合到谷氨酸棒杆菌13032基因组中，得到C. glutamicum 13032ΔldhA::gfpoff菌株；作为对照，同时将gfpon基因整合至13032基因组中，得到C.glutamicum 13032ΔldhA::gfpon菌株。经测试，C. glutamicum 13032ΔldhA::gfpoff检测不到荧光，成功失活GFP蛋白；而C.glutamicum 13032ΔldhA::gfpon则未受F8W突变点影响，可以检测到荧光。该结果表明若gfpoff基因中的靶标位点C被成功编辑，则失活GFP蛋白将重新复活，该检测系统可以应用于后序的实验。
2.2 碱基编辑工具复活GFP荧光蛋白如图 2A所示，构建靶标gfpoff基因目标位点的质粒pXMJ19-CAG，该质粒包括含Tac诱导型启动子的nCas9(D10A)-AID融合蛋白表达框和含组成型启动子P11F的gRNA表达框，将该质粒转化到菌株C. glutamicum 13032ΔldhA::gfpoff中，得到重组菌株C. glutamicum 13032 gfpoff/CAG。将重组菌种子培养24 h后，以初始OD600为0.2转接至新的含5 μg/mL Cm抗性及0.05 mmol/L IPTG的LBG培养基中，诱导16 h，收集菌体。以菌株13032ΔldhA::gfpon作为阳性对照，13032ΔldhA::gfpoff作为阴性对照(图 2B)，通过流式细胞仪分析诱导后菌体GFP复活比例。如图 2C所示，经nCas9(D10A)-AID-gRNA碱基编辑系统编辑后，部分C. glutamicum 13032 gfpoff/CAG菌株成功获得荧光，即gfpoff中靶标位点ACG成功被编辑为ATG。经分析，初始编辑条件下，平均编辑效率为(13.11±0.21)%。
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| 图 2 pXMJ19-CAG质粒示意图以及流式细胞仪分析碱基编辑结果 Fig. 2 pXMJ19-CAG plasmid schematic representation (A) and base editing results by flow cytometry analysis (B, C). |
| 图选项 |
2.3 碱基编辑条件优化为进一步优化碱基编辑条件、提高碱基编辑效率，本研究采用上述基于GFP荧光蛋白的检测系统，分别对培养基类型、诱导时初始OD600、诱导时间、诱导剂浓度进行了优化。
2.3.1 培养基类型的优化不同类型的培养基因其营养物质的组分不同，对细胞生长及蛋白表达的影响也不尽相同。分别测试LBG、BHI、CGXII、LBHIS四种培养基对编辑效率的影响。结果如图 3所示：相比于其他3种培养基，CGXII培养基中编辑效率最高，达到(17.63±0.25)%。相比其他几种培养基，CGXII培养基为无机盐培养基，所含无机盐成分复杂，推测原因可能为某种无机盐成分对于nCas9(D10A)-AID融合蛋白的转录表达机制有影响，从而导致编辑效果最好。
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| 图 3 不同培养基对编辑效率的影响 Fig. 3 Effect of different medium on editing efficiency. |
| 图选项 |
2.3.2 诱导时初始OD600的优化在不同初始OD600的条件下，添加诱导剂会影响融合蛋白nCas9(D10A)-AID的表达量，从而影响碱基编辑效率。种子培养后，采用上述最优培养基CGXII，分别以初始OD600为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1转接，经诱导后。检测编辑效率如图 4所示，当初始OD600在0.01–0.05之间时，编辑效率随着初始OD600增长而增加；当初始OD600为0.05时编辑效率最高，达到(28.28±3.01)%；当初始OD600高于0.05时编辑效率呈现下降趋势。因此，将0.05作为最佳诱导时初始OD600。
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| 图 4 不同初始OD600对编辑效率的影响 Fig. 4 The effect of different initial OD600 on editing efficiency. |
| 图选项 |
2.3.3 诱导时间的优化种子培养后，采用上述最优培养基CGXII，并以最优初始OD600为0.05转接，分别于诱导后8、12、16、20、24 h取样。测得编辑效率如图 5所示。随着诱导时间的增长，编辑效率不断提高。当诱导时间20 h后编辑效率达到最大且之后趋于稳定，编辑效率为(29.28±0.27)%。因此，最优诱导时间确定为20 h。一般情况下，诱导时间过短，蛋白表达量较少，随着诱导时间的延长，蛋白表达量提高，导致编辑效率提高，但是诱导时间过长时(> 20 h)，菌体生长已处于稳定期，菌体不再分裂复制，蛋白的表达量也不再提高，所以导致编辑效率趋于平稳。
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| 图 5 诱导时间对编辑效率的影响 Fig. 5 Effect of induction time on editing efficiency. |
| 图选项 |
2.3.4 诱导剂浓度的优化不同浓度的诱导剂IPTG会对融合蛋白nCas9(D10A)-AID的表达量产生影响，从而影响编辑效率。分别测试终浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 mmol/L的IPTG对编辑效率的影响。流式分析编辑效率如图 6所示，当IPTG浓度为0.001–0.01 mmol/L时，编辑效率随着IPTG浓度的增加而增加，IPTG浓度为0.01 mmol/L编辑效率最高，达(30.35±0.75)%。当IPTG浓度继续增大时，编辑效率呈现降低趋势，因此，将0.01 mmol/L作为IPTG的最优诱导浓度。
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| 图 6 诱导剂浓度对编辑效率的影响 Fig. 6 Effect of inducer concentration on editing efficiency. |
| 图选项 |
2.4 最优碱基编辑条件的进一步验证为了进一步验证上述最优碱基编辑条件适用于谷氨酸棒杆菌基因组其他位点，选取实验室前期已构建、含nCas9(D10A)-AID融合蛋白且gRNA靶标不同基因(Cgl0025、Cgl0369、Cgl1314)的3株菌，分别在初始编辑条件与最优编辑条件下对靶标位点进行编辑。编辑结束后，两种不同编辑条件下，每种菌株各挑取10个单克隆，对靶标位点进行测序。gRNA序列中任意一个靶标C位点被编辑即视为该单克隆得到编辑，以编辑的单克隆数所占比例来衡量编辑效率。如表 4所示，通过比较，3株菌在最优碱基编辑条件下的编辑比例提高了1.7–2.5倍，证明了上述优化结果的有效性及通用性。
表 4 不同编辑条件下基因组位点编辑比例比较Table 4 Editing ratio comparison of genomic loci in different conditions
| Gene | Protospacer sequence | PAM | Editing ratio (original condition) | Editing ratio (optimized condition) |
| Cgl0025 | ACCAGTTATCGTCTGTTCCA | AGG | 3/10 | 5/10 |
| Cgl0369 | CCAAGACGTCATGCTGGACC | GGG | 2/10 | 5/10 |
| Cgl1314 | GGGACAGCAAGAAATTATCG | AGG | 4/10 | 8/10 |
| The underlined Cs in protospacer sequences indicate the target editing sites. | ||||
表选项
3 讨论碱基编辑技术由于具有简单、高效、高特异性以及低脱靶率等优势，在原核生物中的应用越来越广泛。为进一步提高谷氨酸棒杆菌中碱基编辑工具的编辑效率，优化碱基编辑条件，本研究在谷氨酸棒杆菌中成功构建了基于GFP荧光蛋白的快速检测系统，并成功编辑靶标位点，将失活的GFP蛋白重新复活，初始编辑条件下编辑效率为(13.11±0.21)%。通过单因素条件优化，确定了最优碱基编辑条件：初始OD600为0.05，IPTG浓度为0.01 mmol/L，培养基为CGXII，诱导时间为20 h。经过优化，编辑效率提高到了(30.35±0.75)%，相较于初始条件，提高了约1.3倍。选取原编辑条件下编辑效率较低的位点，进行了优化后编辑条件下的编辑效率评估，不同的位点在最优编辑条件下的编辑效率提高了1.7–2.5倍，证明了该优化结果的有效性及通用性。该实验的成功进行，为碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中更广泛高效的应用奠定了基础。为进一步扩展碱基编辑技术的应用，今后的研究重点将集中于扩展靶标位点以及降低脱靶效率等方面。
参考文献
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