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基于近红外光谱实时监测乙醇发酵过程多组分参数

本站小编 Free考研考试/2021-12-26

王旭东1, 刘涛1, 薛闯2, 王子璇2, 孙旭东1
1. 大连理工大学 控制科学与工程学院,辽宁 大连 116024;
2. 大连理工大学 生命科学与技术学院,辽宁 大连 116024
收稿日期:2019-01-06;接收日期:2019-03-07
基金项目:国家自然科学基金(No. 61633006),大连理工大学重点培育基金项目(No. DUT18ZD201)资助

摘要:生物量、葡萄糖浓度和乙醇浓度是乙醇发酵过程的重要参数,传统的方法通常对发酵液取样作离线测量,不仅需要采用多种仪器进行测试分析,而且耗时耗力,成为实时过程调控和优化的障碍。文中针对这些重要过程参数提出了一个基于近红外光谱技术的原位实时检测方法。通过采用浸入式近红外光谱仪对发酵溶液进行原位测量,基于多输出最小二乘支持向量机回归(MLS-SVR)方法建立了利用近红外光谱同时分析葡萄糖浓度、生物量和乙醇浓度的多输出预测模型。实验结果表明,该方法能实时准确地检测乙醇发酵过程中的葡萄糖浓度、生物量和乙醇浓度,而且相对于现有的偏最小二乘法(PLS)分别对各组分建模和预测,能明显提高测量准确性和可靠性。
关键词:乙醇发酵过程近红外光谱技术乙醇浓度在线监测多组分检测
On-line monitoring of multiple component parameters during ethanol fermentation by near-infrared spectroscopy
Xudong Wang1, Tao Liu1, Chuang Xue2, Zixuan Wang2, Xudong Sun1
1. School of Control Science and Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China;
2. School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China
Received: January 6, 2019; Accepted: March 7, 2019
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 61633006), the Fundamental Research Funds for the Central Universities of China (No. DUT18ZD201)
Corresponding author: Tao Liu. Tel: +86-411-84706465; Fax: +86-411-84706706; E-mail: tliu@dlut.edu.cn.

Abstract: The quantity of biomass, glucose concentration and ethanol concentration are important parameters in ethanol fermentation. Traditional methods are usually based on samples for off-line measurement, which not only requires multiple instruments for test and analysis but also consumes notable time and effort, and therefore is inconvenient for real-time process control and optimization. In this study, an in-situ detection method based on the near-infrared (NIR) spectroscopy is proposed for measuring the above process parameters in real time. The in-situ measurement is carried out by using an immersion type NIR spectroscopy. A multi-output prediction model for simultaneously estimating the quantity of glucose, biomass and ethanol is established based on a multi-output least-squares support vector regression algorithm. The experimental results show that the proposed method can precisely measure the quantity of glucose, biomass and ethanol during the ethanol fermentation process. Compared to the existing partial-least-squares method for modeling and prediction of individual components, the proposed method could evidently improve the measurement accuracy and reliability.
Keywords: ethanol fermentation processnear-infrared (NIR) spectroscopyethanol concentrationon-line monitoringdetection of multiple components
发酵工程广泛用于生物质转化、食品、医药等生物制造行业[1-2]。发酵过程的参数主要分为化学参数(如pH值、溶解氧浓度等)、物理参数(如发酵温度、搅拌转速等)和生物参数(基质浓度、生物质浓度和产物浓度等)。工程应用中主要通过调控这些参数对发酵过程进行控制和优化。目前多数发酵过程主要对一些化学参数和物理参数可以实现在线测量,然而对于生物参数仍主要采用离线的测量技术,耗时较长,难以进行实时调控优化[3-4]
近红外光谱技术具有对不同物质组分的敏感性较好、非侵入检测等优点,近年来越来越多地用于发酵过程不同组分和生物量的检测[5-6]。目前,少量文献介绍了利用近红外光谱技术对发酵过程的生物参数进行检测,但基本上是采用离线的方法对单一生物参数进行检测,如文献[7]基于近红外光谱技术离线检测乳酸链球菌发酵过程的还原糖浓度、乳酸链球菌效价、细胞浓度和pH。文献[8]采用近红外光谱仪对1, 3-丙二醇发酵过程的生物量给出了一个实时测量方法,但不能同时对发酵底物和产物的含量进行检测。文献[9]针对丝状真菌发酵过程给出了基于近红外光谱技术实时检测生物量的方法,亦不能同时对其他组分进行测量。
在乙醇发酵过程中,葡萄糖、生物量和乙醇分别为发酵过程的基质、生物质和产物。现已发展了一些对这些参数的离线检测方法[10-12],如采用葡萄糖氧化酶法和高效液相色谱法对葡萄糖浓度进行测量,使用气相色谱仪法和酶学方法等测量乙醇浓度,以及使用酶标仪等测量光密度(Optical density, OD)表示生物量。葡萄糖在酿酒酵母菌的作用下发生糖酵解过程[13],一分子葡萄糖产生两分子丙酮酸,然后丙酮酸转化成乙醇。乙醇发酵过程为生长偶联型发酵过程,发酵过程中的基质浓度和生物量变化都会对产物浓度带来影响,因此需要对乙醇发酵过程中葡萄糖浓度、生物量和乙醇浓度建立联合标定同时进行实时检测。然而目前对乙醇发酵过程各组分同时在线测量的研究成果很少。现有研究[7-9]主要采用偏最小二乘法(PLS)对发酵过程各种组分分别建立近红外光谱标定模型,以用于离线或实时检测,未考虑采用近红外光谱同时对多种组分进行建模和预测。然而近期研究[14]指出,采用多输出支持向量机回归(MLS-SVR)方法对多变量输出建立联合标定模型,能有效利用多变量输出之间的相关性,达到更好的检测可靠性和测量精度。
文中针对乙醇发酵过程,建立基于近红外光谱仪对葡萄糖浓度、生物量及乙醇浓度原位在线测量的实验平台,基于MLS-SVR算法对乙醇发酵过程中生葡萄糖浓度、生物量以及乙醇浓度建立联合标定定量分析模型。通过实验测试,验证说明针对近红外光谱基于MLS-SVR建立的多变量标定模型能够有效地对乙醇发酵过程葡萄糖浓度、生物量以及乙醇浓度进行实时测量。
1 材料与方法1.1 乙醇发酵过程在线监测实验平台与数据采集为本文研究工作建立的乙醇发酵过程在线监测实验平台如图 1所示。其中发酵罐容量为2.5 L,罐中的温度、pH值、搅拌桨转速等由发酵控制设备控制。利用铂金温度计PT100测量发酵罐中温度,通过加热装置及循环冷却水进行控温。通过NaOH溶液调节发酵液酸碱度,由pH计实时检测发酵罐内pH值。通过电动搅拌桨对发酵罐中溶液进行均匀搅拌。考虑到在发酵初期和发酵末期中产气量较少,直接使用尾气分析仪测量尾气可能会造成测量不准确,因此如图所示进行循环通气检测发酵过程中O2和CO2浓度,以保证实时尾气检测的可靠性。将近红外光谱分析仪的浸入式探头采用酒精清洁除菌后插入发酵罐中,进行实时采集发酵罐中溶液组分对近红外光谱的吸光度,所有检测信号由监控电脑进行实时显示。
图 1 乙醇发酵过程在线监测实验平台 Fig. 1 On-line monitoring experimental platform for ethanol fermentation process.
图选项




本研究采用ABB公司制造的TALYS-AS531傅里叶近红外光谱分析仪以及配套的浸入式漫反射探头采集近红外光谱,并由Horizon MB软件进行光谱参数设置和数据预处理。光谱采集设置:测量波数范围为4 000-12 000 cm-1,仪器分辨率为16 cm-1,光谱扫描次数为64次,检测器增益为237.84,采集近红外光谱以空气为参考背景。发酵过程控制设备型号为(KoBioTech KBT-2.5L)。采用液相色谱仪(Waters)测量发酵液葡萄糖浓度,采用气相色谱仪(Agilent 6890 Series GC System)测量发酵液的乙醇浓度,采用Multiskan Ascent酶标仪测量发酵液的生物量(采用OD表示)。使用西安智琦公司制造的尾气分析仪检测发酵过程产生的尾气,其中IRME-M红外气体分析仪可对CO2浓度进行检测,电化学式氧分析仪可对O2浓度进行检测。通过监控计算机监视对发酵液实时采集的近红外光谱数据。
1.2 实验材料配置本实验所用的菌种为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 4126菌种,由大连理工大学生命科学与技术学院提供及保藏。发酵实验前需要对种子进行培养。在种子活化培养阶段,接种100 μL菌种到活化培养基中,然后将培养基放入摇床中,于30 ℃、150 r/min条件下进行24 h的活化。将活化后的菌种接入种子培养基,同样在上述摇床条件下进行12 h的培养。种子培养基和活化培养基由葡萄糖(20 g/L)、蛋白胨(20 g/L)和酵母菌提取粉(10 g/L)组成。
菌种经过活化培养后,接种到发酵培养基中进行发酵实验。发酵开始前使用空气泵对发酵罐通入空气,直到尾气分析仪中显示发酵罐中气体组分浓度和空气一致时,停止空气泵。发酵过程中发酵罐内温度设置为30 ℃,pH值维持在5,电动搅拌桨的转速设置为150 r/min,以保证发酵液为均相状态。发酵培养基由葡萄糖(60 g/L)、蛋白胨(3 g/L)和酵母菌提取粉(5 g/L)组成。
1.3 参考数据与光谱数据分析利用上述实验平台采集5批发酵过程数据用于建立近红外光谱标定模型,每个取样时间点采集3次光谱数据和3组样本做离线检测参考数据。按照3:1的比例分为校正集和验证集,如表 1所示,这里将离线检测参考数据的最大值和最小值归入校正集中,用于建立模型,以保证用于建立光谱标定模型的参考数据范围大于验证集,从而确保以模型内插方式实现可靠的预测。
表 1 校正集与验证集数据分析Table 1 Analysis on the calibration data set and validation data set
Sample set Number of samples Analyte Minimum Maxmum
Calibration set Glucose 0 66.000 0
279 Ethanol 0 28.760 0
OD 0.051 0 4.806 7
Validation set Glucose 0 60.000 0
90 Ethanol 0 26.380 0
OD 0.550 4.556 7

表选项


图 2示例给出了对其中一个批次乙醇发酵过程采集的近红外光谱吸光度数据。由图 2可以看出,在波数段5 500-6 500 cm-1及8 000- 12 000 cm-1范围内的近红外光谱相较于其他波段具有明显的变化特征。需要说明,生物反应器的结构差异(例如搅拌桨和挡板的尺寸和方向等)会改变培养基中的物理特性,从而会影响光谱吸收特性[15]。随着发酵过程的进行,生物量的增加不仅会影响发酵罐中各物质成分含量,还会影响罐中颜色、密度和粘度等物理特性,当然也会影响细胞的生理代谢特性。图 2中最明显的变化为基线漂移,造成基线漂移是由于发酵过程的物理特性变化(例如气泡)使光源散射。通气、搅拌速度、温度、pH等都会造成一定程度的光谱变化。为了消除环境条件变化对光谱测量带来的扰动,文中采用了一阶导数的光谱预处理方法,用于消除基线和背景漂移对光谱造成的影响,增强光谱的差异,从而提高检测精度和可靠性[16-17]
图 2 乙醇发酵过程近红外光谱图 Fig. 2 The spectra of ethanol fermentation process.
图选项




1.4 建模方法考虑到乙醇发酵过程属于生长偶联型发酵过程的特性,葡萄糖浓度、生物量以及乙醇浓度之间存在相互关联性,因此这里采用多变量MLS-SVR方法对它们建立联合标定模型。为了建立标定模型输入——近红外光谱向量(记为xRp)与多变量输出——生物参数(记为yRm)之间的联合映射关系,其中p为光谱变量个数,这里取为选定波段中的936个波数;m为需要监测的生物参数的个数,这些生物参数为葡萄糖浓度、生物量和乙醇浓度,所以m取为3。设校正集为{(x1y1),(x2y2),…,(xnyn)},n为采集的光谱数据个数(也即对应的离线检测参考数据个数),根据前述采集数据划分取建模集个数为n=279。令wi=w0+vi,其中w0表示各个生物参数的共性信息,vi表示各个生物参数的个性信息。基于MLS-SVR的光谱标定建模算法如下:
构建如下形式的映射函数:
(1)
其中φ(·)为低维空间到高维空间的映射,W=(w0+v1w0+v2,…,w0+vm),b为常值偏差向量。
为求解上式中w0V=(v1v2,…,vm)和b=(b1b2,…,bm),建立如下约束优化目标:
(2)
其中E=(e1e2,…,em)∈Rn×mem为待优化的第m个生物参数的松弛因子,Z=(φ(x1),φ(x2),…,φ(xn)),B=(bT;…;bT)∈Rn×mγλ为两个惩罚参数。
取对应的Lagrange函数为
(3)
由KKT条件[18]可建立下列线性方程组进行求解:
(4)
其中A=(α1α2,…,αm)∈Rm×n为拉格朗日乘子矩阵。记上述方程组的解为α*={(α1*Tα2*T,…,αn*T)T}和b*
根据上述方程组的求解,确定多输出的拟合函数为
(5)
其中k(·,·)为核函数。根据上面求得的拟合函数建立联合标定模型,可以对实时测量的光谱数据进行内插求解来预测葡萄糖浓度、生物量和乙醇浓度。
需要说明,上式(5)中的核函数选取为常用的径向基核(RBF)函数[19-20]
(6)
其中核函数参数p和前述两个惩罚参数γ λ采用网格搜索、5折交叉验证方法确定[21-22]
1.5 模型评价指标为了评估近红外光谱标定模型对葡萄糖浓度、生物量和乙醇浓度的预测性能,这里采用预测集均方根误差RMSEP (Root-mean-square error of prediction)、相关系数R2 (Correlation coefficient)和范围误差比RPD (Ration of performance to standard deviate)评价指标[23-24],其计算公式分别为:
(7)
(8)
(9)
其中yi为验证集的第i个样本参考值,为验证集的第i个样本预测值,ym是待预测样本均值。其中SD为校正集样本分布标准差,反映样本分布范围。RMSEP用于评价预测值和参考值的偏差。R2表示预测值和参考值之间的相关性。有关文献指出[25],如果满足RPD > 5的定量标准,模型可应用于可靠的质量预测;如果RPD > 10,则可以应用于实时过程控制和优化。
2 结果与分析2.1 模型预测性能分析分别用多输出MLS-SVR算法和单输出PLS算法建立光谱标定模型,然后使用已知的验证集数据对这两种标定模型进行验证。图 3图 4分别表示了这两种标定模型的预测效果,其中横坐标为离线仪器检测的参考值,纵坐标为基于近红外光谱数据的预测值。可以看出,多输出MLS-SVR光谱标定模型对葡萄糖浓度、生物量和乙醇浓度的预测比较准确地拟合验证集数据,建模样本和验证集数据在参考线附近分布比较紧致。相较之下,单输出PLS光谱标定模型的预测结果和校正集数据拟合较为松散。
图 3 PLS标定模型预测值与参考值相关关系 Fig. 3 Correlation between predicted values and reference values of PLS model. (A) Glucose. (B) OD. (C) Ethanol.
图选项




图 4 MLS-SVR标定模型预测值与参考值相关关系 Fig. 4 Correlation between predicted values and reference values of MLS-SVR model. (A) Glucose. (B) OD. (C) Ethanol.
图选项




两种光谱标定模型的预测性能评价如表 2所示。可以看到,多输出MLS-SVR光谱标定模型对于葡萄糖浓度、生物量和乙醇浓度预测的RMSEP都较小,由此验证说明联合标定模型的预测准确性相对于PLS建立的独立标定模型有明显提高。而且该联合标定模型对应的R2亦相对较大,说明模型对于验证集的预测值同测量参考值相关性更高。尤其指出,对于生物量(OD)预测,联合标定模型对应的RPD为18.593 3,相较于PLS独立标定模型有显著提高,可用于过程实时控制和优化。同时,联合标定模型对于葡萄糖浓度和乙醇浓度的RPD亦都大于5,说明由此建立的定量分析模型能可靠地用于质量预测。
表 2 PLS与MLS-SVR模型性能指标Table 2 Performance index of PLS model and MLS-SVR model
Method Analyte RMSEP R2 RPD
PLS Glucose 4.137 6 0.954 1 4.692 1
OD 0.150 9 0.989 6 9.869 3
Ethanol 1.349 8 0.975 6 6.434 1
MLS-SVR Glucose 3.309 1 0.991 9 5.866 9
OD 0.080 1 0.998 9 18.593 3
Ethanol 1.346 9 0.991 3 6.447 8

表选项


2.2 实验验证通过另外一个单独批次的乙醇发酵实验对于上述联合标定模型进行验证。采用PLS独立标定模型和MLS-SVR联合标定模型的监测结果如图 56所示,其中线条数据为基于近红外光谱采集数据实时预测结果,散点数据为采样离线检测参考值。可以看出,联合标定模型的实时预测结果同离线检测参考值更为贴近,然而PLS独立标定模型的预测结果相对偏差较大,进一步验证了联合标定模型具有更好的预测准确性。需要说明,上述实验中基于近红外光谱技术建立的在线监测联合标定模型可以对葡萄糖浓度、生物量和乙醇浓度进行实时监测,定时1 min给出一次测量结果,然而传统的离线检测方法需要取样,并且使用多个仪器对3种生物参数分别进行测量,耗时约30-60 min。
图 5 PLS模型预测值与实测值对比 Fig. 5 Comparison between PLS model prediction and the real measurement. (A) Glucose. (B) OD. (C) Ethanol.
图选项




图 6 MLS-SVR模型预测值与实测值对比 Fig. 6 Comparison between MLS-SVR model prediction and the real measurement. (A) Glucose. (B) OD. (C) Ethanol.
图选项




3 结论文中提出了一个基于近红外光谱技术原位实时检测乙醇发酵过程葡萄糖浓度、生物量以及乙醇浓度的方法。考虑到乙醇发酵过程为生长偶联型发酵过程,文中采用多变量输出预测的MLS-SVR方法来建立上述关键过程参数的联合标定模型。通过对乙醇发酵过程葡萄糖浓度、生物量和乙醇浓度进行在线监测的实验,并且与现有的PLS独立标定建模方法进行实验对比,验证了联合标定模型相对于独立标定模型有更好的预测精度和可靠性,且相较于传统的离线检测方法具有更好的实时性。由于近红外光谱对发酵过程中存在含氢基团的物质(如丙酮、丁酮、乙醇、蛋白、油脂等)具有较好的敏感性,因此文中方法对这类生物质发酵过程在线检测多组分参数具有很好的应用优势。当然,对于更为复杂的发酵过程,有待于进一步探讨如何基于近红外光谱分析有效和准确地同时检测相近组分的含量及其实时变化率,以及发酵过程质量预测和异常检测。
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    陈政霖1,2,马春玄1,2,邢新会1,2,3,张翀1,2,31.清华大学化学工程系生物化工研究所,北京100084;2.工业生物催化教育部重点实验室,北京100084;3.清华大学合成与系统生物学中心,北京100084收稿日期:2019-03-13;接收日期:2019-05-14基金项目:国家重大科 ...
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  • 微生物法合成红景天苷
    薛飞燕,杨明峰,马兰青北京农学院生物与资源环境学院农业部华北都市农业重点实验室,北京102206收稿日期:2018-11-01;接收日期:2019-02-27基金项目:国家自然科学基金(Nos.21606020,31370674)资助摘要:红景天苷是红景天属植物的主要有效成分之一,具有耐缺氧、抗辐射 ...
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  • 滚环扩增信号放大技术在生物检测中应用的研究进展
    占忠旭,刘巨,陈博璐,汤奕舟,陈官华,许恒毅南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌330047收稿日期:2018-11-17;接收日期:2019-01-16;网络出版时间:2019-02-19基金项目:南昌大学食品科学与技术国家重点实验室研究基金(No.SKLF-ZZB-201720)资助摘 ...
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  • 微生物1, 3-1, 4-β-葡聚糖酶蛋白质改造及工业应用研究进展
    钮成拓1,2,李昕玥2,许鑫1,2,包敏1,2,李永仙1,2,刘春凤1,2,郑飞云1,2,王金晶1,2,李崎1,2,31.江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;2.江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;3.江南大学食品安全与营养协同创新中心,江苏无锡21412 ...
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  • 基于TCGA数据预测肿瘤代表性新抗原的一种生物信息学新方案
    黄传玺1,3,马洁2,3,吴琛1,朱云平2,31.河北大学生命科学学院,河北保定071002;2.军事科学院军事医学研究院生命组学研究所,北京102206;3.蛋白质组学国家重点实验室国家蛋白质科学中心(北京)北京蛋白质组研究中心蛋白质药物国家工程研究中心,北京102206收稿日期:2019-01- ...
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  • 基因工程功能化丝蛋白生物材料及其在生物医学中的应用
    张蕾1,2,3,向仲怀1,2,3,赵盖超1,2,3,吴宗辉4,崔红娟1,2,31.西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室,重庆400716;2.重庆市蚕丝生物材料与再生医学工程研究中心,重庆400716;3.西南大学肿瘤生物医学与转化工程研究中心,重庆400716;4.西南大学西南大学医院,重庆40 ...
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  • 靶向炎性细胞因子的生物制剂及其临床应用
    陈锦1,2,谢冕1,2,李路军1,2,刘东旭1,2,刘梦元1,21.湖北大学生命科学学院感染与免疫研究中心,湖北武汉430062;2.湖北绿色生物资源转换协同创新中心,湖北武汉430062收稿日期:2019-01-10;接收日期:2019-03-14;网络出版时间:2019-05-10基金项目:国家 ...
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  • β-防御素130在大肠杆菌中的串联表达、纯化及生物活性分析
    蔺艳君1,2,董彬11.滨州学院生物与环境工程学院山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心,山东滨州256603;2.滨州学院艺术学院,山东滨州256603收稿日期:2018-11-28;接收日期:2019-04-18基金项目:山东省自然科学基金(No.ZR2018PC010),滨州学院 ...
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  • 丝状真菌液体深层发酵过程菌丝聚集的调控机制
    刘瑞桑1,2,汤亚杰2,白凤武1,31.大连理工大学环境与生命学院,辽宁大连116024;2.湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室工业微生物湖北省重点实验室工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068;3.上海交通大学生命科学技术学院,上海200240收稿日期:2018-09-25;接收日期:2 ...
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  • KaiA调控蓝藻生物钟的分子机制研究进展
    李金奎1,2,曹春雨1,喻玲玲1,刘森1,21.三峡大学医学院肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室,湖北宜昌443002;2.湖北工业大学教育部发酵工程重点实验室/工业微生物湖北省重点实验室,湖北武汉430068收稿日期:2019-01-09;接收日期:2019-03-13;网络出版时间:2019- ...
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