江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013
收稿日期：2017-12-25;接收日期：2018-02-28; 网络出版时间：2018-03-26 基金项目：国家自然科学基金(No. 31571806)，国家重点研发计划(No. 2017YFC1600806)，中国博士后基金(No. 2017M621657)，江苏省“六大人才高峰”项目(No. SWYY-018)资助
摘要：粗甘油是生物柴油生产中的主要副产物，一些微生物可将甘油转化为重要化工原料1, 3-丙二醇(1, 3-PD)，而利用这些微生物野生菌株生物合成1, 3-PD会存在一些局限性，如底物抑制、产物抑制等。文中从1, 3-丙二醇的甘油生物转化途径与这些局限性出发，总结了生物合成中存在的问题，并针对这些问题提出了一些基于基因敲除或基因过表达等基因工程技术的改造方法，综述了利用基因工程菌生物转化甘油生成1, 3-丙二醇的最新研究进展。
关键词：甘油 1, 3-丙二醇 生物转化 生物合成 基因工程
Bottlenecks and modification strategies of 1, 3-propanediol biosynthesis from glycerol
Miaomiao Yang*, Junhua Yun*, Huanhuan Zhang, Guoyan Zhang, Zabed Hossain, Xianghui Qi
School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu, China
Received: December 25, 2017; Accepted: February 28, 2018; Published: March 26, 2018
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31571806), National Key Research and Development Program (No.2017YFC1600806), China Postdoctoral Science Foundation (No. 2017M621657), High-level Talents Project of Six Talent Peaks in Jiangsu Province(No. SWYY-018)
Corresponding author:Xianghui Qi. Tel: +86-511-88797059; Fax: +86-511-88780201; E-mail: qxh@ujs.edu.cn
*These authors contributed equally to this work
Abstract: Crude glycerol is the main by-product of biodiesel production. A few microorganisms can transfer crude glycerol to 1, 3-propanediol (1, 3-PD) that is an important chemical material. There exist many limitations such as substrate inhibition, product inhibition when wild strains are used in 1, 3-PD biosynthesis. In this review, based on the microbial transformation of 1, 3-propanediol from glycerol and its limitations, some strategies using genetic engineering such as knockout or gene overexpression were summarized. The latest research progresses in biosynthesis of 1, 3-propanediol from glycerol by genetically engineered strains are discussed.
Key words: glycerol 1, 3-propanediol bioconversion biosynthesis genetic engineering
1, 3-丙二醇(1, 3-propanediol，1, 3-PD)是一种无色物质，味道微甜，具有粘性，易溶于水和乙醇，在化工、食品、医学、化妆品等领域具有十分广泛的应用[1-5]。1, 3-PD可以通过化学途径合成，但合成工艺条件苛刻、能耗高、释放有毒中间体且产品精制难度较大，这些都增加了1, 3-PD的生产成本[6]。因此，寻找一种低成本、低能耗的代替方法，将为1, 3-PD的生产带来巨大效益。粗甘油是生物柴油生产中的一种主要副产物[7-9]，自然条件下一些微生物可以直接利用甘油作为底物，高效地合成1, 3-PD，这不仅解决了1, 3-PD化学法生产成本较高的问题，又有效地回收利用了生物柴油生产中的副产品。这些1, 3-PD生产菌株包括短乳杆菌Lactobacillus brevis、肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae、巴氏梭状芽孢杆菌Clostridium pasteuianu、丁酸梭菌Clostridium butyricum和弗氏柠檬菌Citrobacter freundii等[10-16]。尽管上述自然界中分离的野生菌用于生产1, 3-PD具有较高的效率，但这些菌本身的某些性质限制了其产率的继续提高，利用基因工程的技术对这些野生菌进行定向改造[17]，可以打破这些限制，甚至可以对本身不能进行甘油转化生成1, 3-PD的菌株进行基因工程手段的改造，引入1, 3-PD代谢途径来生产1, 3-PD。例如，美国杜邦公司利用利用玉米中的糖分为底物，将dhaB、dhaT和可转化糖为甘油的基因GPPl/2克隆到工程菌中，实现了以葡萄糖为底物生产1, 3-PD，并用于工业化生产，被公认为是利用基因工程方法使代谢物产业化的典范。基因工程方法如敲除和相关基因的过表达均可被用来构建高效或高产的1, 3-PD工程菌株。
1 1, 3-PD的生物合成1.1 生物合成途径在自然条件中，甘油歧化是1, 3-PD的唯一生成途径，一般在厌氧条件下进行[18-21]。在这些微生物中，甘油可以通过简单扩散或促进扩散两种不同方式渗透到膜中[22]，当甘油跨过细胞膜后，会进入两个平行的代谢途径：氧化代谢途径和还原代谢途径(图 1)。
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| 图 1 甘油的代谢通路图[26] Figure 1 Metabolic pathways of glycerol catabolism[26]. |
| 图选项 |
在氧化途径分支中，甘油在甘油脱氢酶(Glycerol dehydrogenase，GDH)的催化下，生成二羟丙酮(Dihydroxyacetone，DHA)，这步反应需要NAD+作为辅酶；之后，DHA在ATP的参与下，经磷酸二羟丙酮激酶(Dihydroxyacetone kinase，DHAK)催化生成磷酸二羟丙酮(Dihydroxyacetone phosphate，DHAP)，再在NAD+辅酶参与下，生成磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)，之后进入碳代谢如糖酵解、三羧酸循环等主流代谢途径和其他代谢途径[23-24]。由PEP转化产生的丙酮酸会进一步产生次级代谢产物，如乙酸、琥珀酸、乳酸、丁酸、正丁醇、乙醇、2, 3-丁二醇(2, 3-butanediol，2, 3-BD)等，这些代谢产物构成了利用微生物生产1, 3-PD的主要副产物。
另一分支是还原途径分支。甘油首先在甘油脱水酶(GDHt，glycerol dehydratase)的作用下生成3-羟基丙醛(3-hydroxypropanaldehyde，3- HPA)，GDHt是控制甘油分解的限速酶，对甘油转化起着至关重要的作用。随后，经1, 3-丙二醇氧化还原酶(1, 3-propanediol oxidoreductase，PDOR)催化，3-HPA转化为1, 3-PD[25]。在从甘油到1, 3-PD厌氧转化的过程中，当所有的乙酰CoA均进入TCA循环，未经氧化磷酸化生成乙酸，其最大理论产量为0.875 mol/mol甘油。然而，在大多数情况下，为了产生更多的ATP，乙酸大量生成，此时以乙酸为唯一副产物的最大理论收率为0.72 mol/mol[17]。鉴于通过生物合成1, 3-PD的诸多优点，利用甘油合成1, 3-PD是目前的研究热点。然而，生物转化甘油生成1, 3-PD亦存在着一些局限性，利用基因工程的方法来改造微生物菌株，可以有效改善这些问题，表 1列出了这些工程菌生产1, 3-PD的情况。
表 1 不同基因工程菌株生产1, 3-PD情况比较表Table 1 Comparison of 1, 3-PD production using various mutants by genetic engineering
| Strains | Fermentation | titer (g/L) | Yield (g/g) | Productivity g/(L·h) | Reference |
| 1. Gene knockout | |||||
| K. pneumoniae J2B ΔldhA | Batch | 58.0 | 0.35 | 1.30 | [1] |
| K. pneumoniae KG5 ΔpoxB Δpta ΔackA | Fed-batch | 76.8 | 0.54 | 2.56 | [54] |
| K. pneumoniae 2-1 ΔldhA Δald | Fed-batch | 87.5 | 0.70 | 3.60 | [55] |
| C. werkmanii DSM17579 ΔdhaD | Batch | 97.6 | 0.50 | 4.07 | [48] |
| 2. Gene overexpression | |||||
| K. pneumoniae KG1 dhaT overexpressed | Fed-batch | 55.8 | 0.50 | 2.23 | [12] |
| K. pneumoniae ME-308 yqhD from E. coli overexpressed | Fed-batch | 67.6 | 0.513 | 1.69 | [41] |
| K. pneumoniae DSM 2026 puuC overexpressed | Fed-batch | 16.8 | 0.42 | – | [44] |
| 3. Coenzyme regeneration | |||||
| K. pneumoniae fdh overexpressed | Batch | 78.6 | – | 1.33 | [42] |
表选项
1.2 转化途径中的关键酶及其基因由上述甘油的还原途径可见，GDHt (EC 4.2.1.30)和PDOR (EC 1.1.1.202)是生物法生产1, 3-PD的两种关键酶，而编码该关键酶的基因存在于dha调节子上，该调节子包括GDHt的编码基因(dhaB)、PDOR的编码基因(dhaT)、GDH的编码基因(dhaD)、DHAK的编码基因(dhaK)和调节基因(dhaR)，不同1, 3-PD生产菌的dha调节子构成亦不同。
GDHt是甘油歧化途径中的关键功能性分子，是1, 3-PD生物转化中的限速酶。在K. pneumoniae、C. pasteurianum的dha调节子中，编码GDHt的基因是dhaB，由3个阅读框(dhaB1、dhaB2、dhaB3)分别编码该酶的3个功能亚基，即α、β和γ亚基，它们共用一个启动子，以α2β2γ2二聚体的形式存在。而C. freundii的GDHt是由dhaB、dhaC和dhaE编码的，其结构与K. pneumoniae中的GDHt同源，具有较高的相似性，这两种GDHt均以辅酶维生素B12为辅基，在1, 3-PD发酵过程中微量流加B12，可以满足微生物转化的需要。而在C. butyricum中，GDHt的编码基因由dhaB1、dhaB2组成，dhaB1编码dhaB2的激活蛋白，该菌中的GDHt对氧气极其敏感，与细胞膜的通透性有关，但C. butyricum中的GDHt并不是辅酶维生素B12依赖型，由于辅酶B12成本较高，这也使得工业上利用C. butyricum生物转化1, 3-PD具有独特的优势。
PDOR由dhaT基因编码，是甘油与1, 3-PD代谢途径中的另一关键性酶，直接将甘油还原途径中的中间产物3-HPA还原为1, 3-PD，同时消耗NADH生产NAD+，微生物通过该反应步骤消耗还原力NADH，使微生物细胞内的还原力达到平衡。在K. pneumoniae中由连续基因dhaT编码，转录方向与甘油脱水酶基因相反，由另一启动子控制；而在C. butyricum调节子中，两种酶的编码基因在同一方向转录。在1, 3-PD生产途径中，PDOR酶的活性会受到许多抑制，导致1, 3-PD产量降低，因此，为实现dhaB、dhaT基因的高效表达，构建载体时须借鉴自然菌中基因簇的排布模式。表 2列出了应用不同的蛋白改造方法对以上两种酶的改造策略。
表 2 不同方法改造K. pneumoniae来源关键酶的酶学数据Table 2 Comparison of properties of engineered key enzymes from K. pneumoniae in 1, 3-PD production
| Enzyme | Methods | Activity (U/mg) | Km (mmol/L) | Vmax (U/mg) | Enhanced fold | Reference |
| GDHt KpG525 | Rational design | 125.00 | 0.60 | 270.00 | 1.45 | [32] |
| GDHt KpG60 | Rational design | 90.00 | 0.70 | 140.00 | 1.05 | [32] |
| GDHt Q42F | Error-prone PCR and saturation-mutagenesis | 2 500.00 | 2.61 | – | 8.30 | [31] |
| 1, 3-PDOR-D41G | Rational design | 277.35 | 0.48 | 303.03 | 1.56 | [56] |
| 1, 3-PDOR’-24 | Error-prone PCR | 48.00 | – | – | 4.90 | [57] |
表选项
2 甘油转化生成1, 3-PD过程中的底物抑制与产物抑制甘油以及1, 3-PD产物的积累都对细胞的生长具有抑制作用，且导致了GDHt不可逆的失活，降低了1, 3-PD的产率。Colin等[27]研究了C. butyricum CNCM1211中甘油和1, 3-PD对细菌的抑制作用，结果表明，细菌的生长速率与甘油的浓度成反比，当甘油初始添加浓度达到150 g/L时菌体的生长受到明显抑制，浓度达到160 g/L时，细菌几乎不生长；当1, 3-PD的初始添加量达到65 g/L时，细菌的生长率达到最大值，由于甘油的代谢产生1, 3-PD，1, 3-PD在培养基中的终浓度为70 g/L。Daria等[28]也研究了1, 3-PD对C. butyricum DSP1生产性能的影响，在接种之前将1, 3-PD添加到培养基中，得出了相近的结果，当外源添加的1, 3-PD浓度达到60 g/L时，菌株的活性相对较高，添加的初始浓度达到80 g/L时，对菌体来说是致命的。
由于GDHt是1, 3-PD发酵过程中的关键酶，尤其是在甘油浓度较高时，提高酶的浓度或活性可以有效提高1, 3-PD的产率[29]。首先，利用基因工程的技术对GDHt编码基因dhaB进行过表达是一个有效的解决方案。Oh等[30]首先获得了一株不产生副产物的K. pneumoniae突变株，命名为AK-VOT，通过去除甘油氧化途径，阻断除乙酸外其他副产物的生成，获得了1, 3-PD高产菌株，之后，过表达dhaB和/或dhaT基因，进一步研究以期提高1, 3-PD产量。结果表明，相比于dhaB和dhaT基因同时过表达，单独过表达dhaB的突变株1, 3-PD的产量较高。其次，采用定向进化、理性设计或非理性设计的方法对酶分子进行改造，获得活性更高、稳定性更好的新型GDHt，也可将甘油底物尽快转化。Qi等[31-32]采用生物信息学的方法对GDHt进行理性设计和非理性设计，并研究了重组酶在不同pH值下的酶活力及稳定性，酶学性质的分析表明，相比于原始酶，经过定点突变理性设计的酶的活力提高到1.5–2.0倍，对pH的稳定性也提高到原始酶的1.5–2.0倍；采用易错PCR的非理性改造和定点饱和突变理性改造相结合的方法得到的改造GDHt酶活力提高到8.3倍。利用这种改造后的酶进行1, 3-PD的发酵，也可以促进底物的尽快转化，减少抑制。一些对1, 3-PD具有较高耐受性的菌种也被分离获得，例如，Papanikolaou等[33]选用的是从死水池中分离得到的C. butyricum F2b，该菌株表现出良好的1, 3-PD耐受性，耐受水平达到80 g/L。C. butyricum VPI 3266和C. butyricum DSM 5431也具有较高的1, 3-PD耐受性[23]，其1, 3-PD产量确有提高。利用诱变育种的方式对菌株进行定向进化，经过高通量筛选也可能获得1, 3-PD的高耐受菌株，同时这也是解决底物抑制的方法之一。另外，采用连续发酵的方式将代谢产物移除，对于提高产量也有一定的益处。
3 中间产物3-HPA的及时转化3-HPA能够阻止细菌细胞生长，广泛应用于生物杀菌剂和抗感染治疗剂。其确切机制目前尚不十分清楚[34]。在甘油还原生成1, 3-PD时，3-HPA是其中间产物，它不仅会延缓细菌的生长，而且GDHt和PDOR都对高浓度的3-HPA极其敏感，培养基中3-HPA的积累会导致微生物中的反馈机制的触发，降低GDHt的合成以降低3-HPA的生成水平，减少对菌体的毒害作用[35]，从而导致1, 3-PD的生成水平也相应降低，这个过程会导致代谢活动中不可逆转的后果，成为1, 3-PD生产中的一个严重缺陷，也是1, 3-PD生产中一个主要的影响因素[36]。因此，PDOR的浓度或活性是代谢中的关键影响因子，在保证GDHt一定活力的情况下，研究者们主要采取以下方法来降低3-HPA的影响。
3.1 提高PDOR活力PDOR是一种氧化还原酶，许多****研究了其氧化与还原活性。Qi等[37]从C. freundii中克隆出PDOR编码基因dhaT，转化E. coli获得高效表达的PDOR，研究了其酶学性质，发现相比于其氧化活力，PDOR的还原活力的作用条件更温和，最适反应pH为7.0，温度为37 ℃。Qi等[38]还从L. brevis中克隆到dhaT，获得新型重组PDOR，最适反应pH为7.5，温度为37 ℃，这对于1, 3-PD的最终生成是有利的，对酶的3D结构分析表明，不同来源的两种PDOR均属于Ⅲ型乙醇脱氢酶。
将dhaT进行原始菌株中的过表达是提高PDOR活力的最直接的一种方法。由于PDOR的酶促反应依赖于辅酶NADH[39]，当副产物途径被阻断时，这些突变体内细胞的氧化还原力NADH/NAD+较高，因此，进一步研究过表达基因dhaB和dhaT，使用这些多余的NADH，以提高1, 3-PD产量。Cui等[12]在两株K. pneumoniae KG1-3 (只阻断2, 3-丁二醇途径的突变株)和KG1-5 (阻断2, 3-BD和乳酸途径的突变株)中将基因dhaT过表达。结果表明，在菌株KG1-5中，氧化还原平衡力恢复正常，产量提高明显，甘油1, 3-PD的产量也恢复到正常水平的60%。
还有****将PDOR编码基因转化大肠杆菌，采用共转化的方法，达到提高酶浓度与活力的目的。Yun等[40]从C. butyricum中克隆得到dhaT基因，使其在E. coli BL21中高效表达，将转化E. coli与C. butyricum混合，采用全细胞生物催化的方法进行甘油到1, 3-PD的转化，由于PDOR的催化需要辅酶NADH，因此额外添加了NADH来实现还原力的平衡。结果表明，PDOR的全细胞生物催化有效提高了1, 3-PD的产量，相比于单独利用C. butyricum发酵提高了2倍，1, 3-PD的产量为25.88 g/L，转化率为0.54 g/g甘油。
许多研究人员还在寻找生产1, 3-PD自然菌株中原始酶以外的方法来转化3-HPA。其中一种方法是从其他的菌株中寻找可以催化3-HPA为1, 3-PD的酶，通过代谢工程构建异源重组菌株。例如，大肠杆菌中存在一种PDOR的同工酶，被命名为PDORI，由yqhD基因编码，该酶被证实是与K. pneumoniae中的PDOR有相同功能的氧化还原酶。许多研究人员研究了该基因，并构建了含有该基因的工程菌来增加1, 3-PD的产量。Zhu等[41]构建了K. pneumoniae的重组菌体，将原始菌株中导入yqhD基因来提高酶的浓度。重组K. pneumoniae突变体最终的1, 3-PD浓度达到67.6 g/L，与原始株相比，产量提高了125.33%，摩尔转化率达到了0.62 mol / mol。重组酶活性检测表明，相比原始菌株，酶活力提高了10倍。此外，3-HPA浓度与原始菌株相比降低了22.4%。因此，利用基因的过表达相关基因是解决1, 3-PD生物生产中中间代谢产物3-HPA对细菌的抑制问题的一种有效方法。
3.2 构建辅酶再生系统如上所述，NADH/NAD+比较高时，NADH作为还原当量对1, 3-PD的生物合成起着关键的作用，构建辅酶再生系统，将有利于1, 3-PD的生产。黄志华等[42-43]选取NAD+依赖型的甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase，FDH)为研究对象，利用基因工程的手段构建了含有该基因的重组质粒，在K. pneumoniae中表达了Candida boidinii的甲酸脱氢酶的基因fdh，构建了NADH再生系统，对甘油代谢过程进行调控。结果表明，通过分批补料发酵，1, 3-PD的产量达到78.6 g/L，与原始菌株相比，产量提高了12.5 %。
3.3 3-HPA流向其他途径减少1, 3-PD发酵中3-HPA浓度的另一种方法是将其部分转化为其他代谢物。例如，K. pneumoniae中存在一种NAD+依赖型的γ-谷氨酰-γ-氨基丁酸醛脱氢酶(PuuC)，由puuC基因编码，可以将3-HPA氧化为3-羟基丙酸(3-HP)，3-HP也是一种重要的化工产品[10]。由于原始菌中的puuC表达量较少，Ashok等[44]将K. pneumoniae DSM 2026中的puuC基因过表达，PuuC催化3-HPA生成3-HP时，会产生较多的NADH，这些NADH也可以用于1, 3-PD的合成，达到了还原当量的充分利用。分批补料发酵中，重组K. pneumonia (puuC)菌株产生16.0 g/L 3-HP和16.8 g/L 1, 3-PD，经过24 h转化，甘油到1, 3-PD的转化率可达0.51 mol/mol，转化率较高。这种将3-HPA流向其他途径的方式不仅降低了3-HPA对细胞的毒性，使细菌代谢正常有序地进行，而且为3-HP和1, 3-PD的联产提供了参考。
4 生物转化中的副产物与应对策略副产物的形成和维持氧化还原平衡是1, 3-PD生产中的又一个瓶颈。如图 1所示，在甘油的歧化过程中，除1, 3-PD外可产生多种代谢产物如乙酸、琥珀酸、乳酸、丁酸等，这些物质成为1, 3-PD生产中的主要副产物。在甘油氧化分支，甘油经几个ATP依赖的氧化还原酶催化，转化为磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。同时，在糖酵解代谢途径中，葡萄糖也会转化为PEP。以上生成的PEP可由丙酮酸激酶转化为丙酮酸，生成一系列副产物。许多因素可以影响这一过程，如外部条件和遗传条件等[45]。因此，改变其中的任何一个环节，这些副产品的质量和数量都将受到影响。这些副产物的形成会消耗甘油或葡萄糖中的碳，从而导致流向其他产物的碳减少，使1, 3-PD的产量下降[46]。另外，这些副产物对细胞的生长也有抑制作用。因此，利用基因工程的手段，通过敲除相关基因来降低这些副产物的生成是一个较好的应对策略。然而，这些途径可以调节细胞内氧化还原力的平衡，因此，在敲除这些相关基因时，应保持氧化还原电位以满足目标代谢反应的正常运转。要避免不必要的代谢产物的产生，同时需保持氧化还原力的平衡，这对提高1, 3-PD产量也是一个挑战。在保证其氧化还原力的前提下，研究者们主要采取以下方法来降低副产物的形成。
4.1 与DHA或DHAP相关的基因敲除GDH是由dhaD基因编码的，需要辅酶NAD+的参与，可将甘油氧化为DHA；DHAK是由dhaK基因编码的，参与催化DHA的磷酸化，生成DHAP。这是甘油氧化分支的第一步。阻断1, 3-PD的生物生产中副产物生成的途径，最直接的是敲除与DHA和DHAP合成相关基因。Horng等[47]利用同源重组将K. pneumoniae中的dhaD和dhaK基因敲除，命名为TC100，采用的方法是将dha操纵子中的dhaD-dhaK基因中插入一段链霉素抗性基因，以便后续重组子的筛选。利用重组的TC100在50 mL三角瓶进行1, 3-PD的摇瓶发酵，实验表明，在37 ℃下孵育48 h后，相比于野生菌株，TC100的产量增加了1.06倍；副产物如乳酸、2, 3-丁二醇、乙醇均未检出。然而，这一突变菌株与野生菌株相比细胞的生长状况较差，生物量少，生产1, 3-PD的生产强度低，他们通过dhaT基因的过表达对其进行了优化，并调整了培养条件来解决这个问题，获得了较高的1, 3-PD生产强度。
完全敲除甘油歧化的氧化分支来降低副产物形成方法使还原力NADH降低，导致生物量降低，反过来影响了甘油的还原分支，会对1, 3-PD的生产造成一定影响。这一问题可通过割裂1, 3-PD生成途径和生物量增长途径的方式来解决。Maervoet等[48]研究了C. werkmanii的1, 3-PD生产过程，利用基因工程的手段来构建C. werkmanii DSM17579 ?dhaD，即敲除dhaD基因，同时，利用葡萄糖作为共发酵底物，保证细菌主流代谢途径的正常运作，以增加生物量。最终使1, 3-PD产量提高了1.5倍。
4.2 与丙酮酸还原相关基因的敲除乳酸是丙酮酸的还原产物之一，每生成一个单位的乳酸，需要一个单位的NADH。它是在甘油歧化途径中从丙酮酸出发碳分流的主要产物，属于1, 3-PD生产中的副产物。在细胞生长过程中，乳酸在指数期后期累积，抑制细胞生长。因此，许多研究人员通过敲除乳酸脱氢酶ldhA基因，获得乳酸缺陷突变体以抑制乳酸的合成，对1, 3-PD发酵具有重要意义。Durgapal等[1]对K. pneumoniae J2B利用甘油产1, 3-PD的能力进行了研究，他们构建了一个ldhA基因缺失突变体，比较野生型菌株和?ldhA突变株在不同培养条件、不同培养模式下(分批或补料培养)的生长状况以及1, 3-PD生成水平。当K. pneumoniae ?ldhA以补料培养方式发酵甘油时，1, 3-PD的产量为58 g/L，产率为0.35 g/g，生产强度为1.3 g/(L·h)。碳流分析表明，?ldhA突变株产生极其微量的乳酸，2, 3-丁二醇(2, 3-BD)比野生株产量高，产量为26.6 g/L，成为主要副产物。
2, 3-BD也是从丙酮酸出发生成的另一个产物，成为甘油发酵生产1, 3-PD中的又一个主要副产品。2, 3-BD也是二醇，与1, 3-PD有相似的沸点，且都与水互溶。因此，2, 3-PD的这一性质导致了1, 3-PD生产与纯化中一个棘手的问题[49]，使获得纯度较高的1, 3-PD成本大大增加[49-50]。通过敲除合成2, 3-丁二醇的编码基因，阻断其合成途径，可以有效解决这一问题。Kumar等[2]在得到K. pneumoniae J2B ?ldhA突变株后，为了改善2, 3-BD的问题，进一步敲除了2, 3-BD代谢相关的基因，包括整个bud操纵子上的budA、budB、budC和budD基因。结果表明，这种敲除完全阻断了2, 3-BD的合成，不过1, 3-PD的产量也下降了。他们认为，丙酮酸的大量积累是导致其产量下降的主要原因，细胞生长减慢。由于丙酮酸的积累，触发负反馈机制，导致上游产物如二羟基丙酮、3-磷酸甘油醛等的积累。GDHt活力测定表明，3-磷酸甘油醛抑制了该酶活力从而降低了1, 3-PD的产量。也有其他****研究了其他2, 3-BD相关基因的敲除，如als基因，该基因编码乙酰乳酸合酶，如图 1所示，α-乙酰乳酸是2, 3-BD的中间产物之一。Lee等[51]将K. pneumoniae中的als基因敲除后，将异源的pdc (编码丙酮酸脱羧化酶)和aldB (编码乙醛脱氢酶)基因导入，减少了2, 3-BD的积累，1, 3-PD的产量也有一定提高。
4.3 与乙酰CoA还原相关的基因敲除丙酮酸还原后，除了一部分流向生成乳酸和丙酮酸，还有大部分流入乙酰CoA，乙酰CoA是丙酮酸代谢过程中的重要中间产物，由丙酮酸脱氢酶催化，之后生成了更多的次级代谢物，如乙酸、乙醇和丁酸等。这些代谢物或多或少都对细菌的生长具有抑制作用，成为1, 3-PD生物合成工业中的副产品[52]。目前，很多****采取基因敲除的方法构建缺失菌株以减少这些副产物的产生，取得了较好的结果。
乙酸是抑制细胞生长的代谢产物之一。在乙酰CoA的代谢物中，乙酸对细菌的毒性最强[53]。因此，乙酸合成途径的阻断是基因工程改造的最重要的目标。Lin等[54]敲除了K. pneumoniae中乙酸合成两条途径中相关酶的编码基因poxB、pta和ackA，这些基因分别编码丙酮酸氧化酶、磷酸转乙酰化酶和乙酸激酶，并研究基因缺失菌株对细胞生长和1, 3-PD生产的影响。分批发酵生产1, 3-PD的最终产量达到76.8 g/L，与相同发酵条件下野生株的产量提高了15%。这些基因的缺失极大降低了乙酸的合成，使更多的碳流向TCA等代谢途径，不但增加了生物量，也提高了1, 3-PD的产量。乙醇是1, 3-PD形成的另一种主要产物，乙酰CoA在乙醛脱氢酶(由aldH基因编码)催化下生成乙醛；之后在乙醇脱氢酶(由adhE基因编码)催化下，乙醛还原成乙醇。这一过程需要消耗甘油还原途径中产生的NADH，因此许多****同时阻断乳酸和乙醇的合成途径来提高1, 3-PD产量。Chen等[55]采用λ Red重组技术对K. pneumonia进行改造，获得K. pneumonia 2-1 ?ldhA、K. pneumonia 2-1 ?aldH和K. pneumonia 2-1 ?ldhA ?aldH突变株。分批发酵结果表明，以上3株重组菌的副产物浓度与原始菌株相比显著降低，1, 3-PD的产量也分别提高至85.7、82.5、87.5 g/L，而原始菌株提高至78.8 g/L。
5 展望利用生物柴油的副产物粗甘油进行1, 3-PD的生物合成符合可持续发展的趋势。基因工程和生物技术的发展可有效解决1, 3-PD生产中的局限，但是基因工程菌的潜力还有待发掘，具有较广阔的研究应用前景。首先，利用宏基因组中获得的新型相关基因构建高效基因工程菌，可进一步解决相关抑制问题。其次，上述提到的方法联合使用可以达到综合改善微生物特征的目的。此外，结合一些化学诱变、ARTP诱变、genome shuffling等育种技术，也可以最大限度地提高菌株耐受性从而提高1, 3-PD的产量。再次采用更多理性、非理性或半理性的方法将1, 3-PD发酵途径中的关键酶进行改造优化，可提高酶的催化活性，从而提高产量。另外，还可从发酵工艺入手，通过连续发酵或半连续发酵降低底物和产物对生产菌株的抑制作用，提高1, 3-丙二醇的产量。
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