, 唐丽杰东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030
收稿日期：2017-03-25;接收日期：2017-06-05 基金项目：国家科技支撑计划(No. 2013BAD12B01) 资助
摘要：旨在建立蓝舌病病毒4型(BTV-4) 特异性抗体ELISA检测方法，为蓝舌病的免疫学诊断提供新的技术。利用制备的两株抗4型BTV VP2蛋白的单克隆抗体4A-1G7和4B-1B6，建立BTV-4特异性竞争ELISA抗体检测方法。利用该方法同时对50份羊和牛BTV阴性血清进行检测，分别确定两种方法阻断率临界值为49%和40%。利用标准阳性血清检测的试验结果表明，该方法的敏感性、特异性和重复性符合OIE通用标准。同时，4A-1G7和4B-1B6两种竞争ELISA方法联合作用，可以检测感染4、18和20型BTV的血清。研究结果为建立以上各型BTV的检测方法提供了基础。
关键词：蓝舌病病毒 竞争ELISA 单克隆抗体 VP2蛋白
Establishment of two competitive ELISAs for specific detection of bluetongue virus serotype 4
Jiaxuan Li, Mingxin Zang, Shuangyu Xie, Yanping Jiang, Wen Cui, Yigang Xu, Min Liu, Xinyuan Qiao, Li Wang, Han Zhou, Yijing Li
, Lijie Tang College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang, China
Received: March 25, 2017; Accepted: June 5, 2017
Supported by: National Key Technology R & D Program of China (No. 2013BAD12B01)
Corresponding author:Yijing Li. Tel: +86-451-55190363; E-mail: yijingli@163.com
Lijie Tang. Tel: +86-451-55190824; E-mail: tanglijie@163.com
Abstract: To develop a clinical diagnosis technique for bluetongue virus infection, we established serotype-specific methods to detect serotype 4 of bluetongue virus (BTV-4). Two monoclonal antibodies (mAbs) against VP2 protein of BTV-4, named 4A-1G7 and 4B-1B6, were used as competitive antibodies in the competitive enzyme-linked immunosorbent assays (C-ELISA). We detected 50 negative serum samples from sheep, goats and cattle by C-ELISA. The cut-off values of 4A-1G7 and 4B-1B6 mAbs were 49% and 40%, respectively. The results of the sensitivity, specificity and repeatability by detecting standard positive serum, were consistent with the general standard of Office International Des Epizooties. Furthermore, serum samples of BTV-4, BTV-18 and BTV-20 infection could be screened out through the combined C-ELISAs by 4A-1G7 and 4B-1B6 mAbs. Thus, this technique may diagnose BTV-4, BTV-18 and BTV-20 infections.
Key words: bluetongue virus serotype 4 competitive ELISA monoclonal antibody VP2 protein
蓝舌病(Bluetongue，BT)是一种烈性非接触性传染病，主要经节肢动物(库蠓和伊蚊等)传播，可感染反刍动物如牛、绵羊、山羊、鹿、非洲羚羊、骆驼等[1]。世界动物卫生组织将其列为必须通报的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[2]。BT广泛分布于热带、亚热带地区。蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)血清型众多，目前至少有27个血清型，新发现的28型和29型还在鉴定中[3-4]。通过BT流行病学调查，中国共在31个省、市(区)发现BTV抗体阳性家畜，并从云南、湖北和安徽等地自然感染羊体中分离获得BTV[5]。据报道，我国已检测出BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-10、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-20和BTV-24等12种血清型[6-7]，目前BTV-1、BTV-4和BTV-20是广西优势的血清型，在全区广泛分布；而江苏、内蒙古、云南等地区均检测到BTV-1、BTV-7、BTV-10和BTV-16型，当前国内BT流行的血清型有了新的变化[8-10]。
BTV是由10个基因片段组成的双股RNA病毒，分别编码7个结构蛋白(VP1-VP7) 和4个非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a和NS4)[11]。VP2蛋白是BTV外壳蛋白的主要成分，同时是BTV血清型的主要决定因素[12-13]。VP2蛋白为型特异性蛋白，可以用来区别BTV各血清型间的不同[14]。
竞争ELISA (C-ELISA)是检测BTV抗体的一种常用方法[15]。C-ELISA方法可用于多种动物血清抗原检测，其特异性和敏感性高、成本低，广泛用于临床蓝舌病的诊断检测中[16-17]。本实验采用针对BTV4型(BTV-4) VP2蛋白的型特异性单克隆抗体[18]作为竞争性抗体与待检测抗体竞争，通过抑制率大小来判定样品血清的来源动物是否感染BTV，建立了一种快速、敏感的BTV型特异性检测方法。
1 材料与方法1.1 单克隆抗体、动物血清与主要试剂抗BTV-4 VP2的单克隆抗体4A-1G7 (抗体亚类为IgG1，抗原表位为160NH161)、4B-1B6 (抗体亚类IgG1，抗原表位为501SRS503)和BTV-4 VP2-A/B蛋白由本实验室保存[12]；1-24型BTV标准阳性血清(抗体滴度为1:640?1:1 280) 及阴性血清购自The Pirbright Institute蓝舌病参考实验室；HRP标记的山羊抗鼠IgG购自中杉金桥有限公司；BTV抗体ELISA试剂盒(TSI公司)购自上海雅吉生物科技有限公司；70份血清样品中5份绵羊、5份山羊和10份牛血清样品来自于黑龙江的某养殖场，25份绵羊、25份山羊血清样品来自于内蒙古；TMB显色液购自北京奥拓达科技有限公司。
1.2 单抗的大量制备及纯化用腹水法大量制备单抗4A-1G7和4B-1B6。将制备的腹水采用Protein G蛋白纯化柱纯化(GE公司)。
1.3 优化C-ELISA反应条件将BTV-4 VP2-A/B蛋白分别以1 μg/孔、2 μg/孔、5 μg/孔、10 μg/孔包被，分别包被1 h、2 h、3 h；再将纯化的单抗(4A-1G7和4B-1B6的蛋白浓度分别为4.2 mg/mL和5.3 mg/mL)用稀释液稀释至1:500、1:1 000、1:2 000、1:4 000倍；BTV-4标准阳性血清用PBS稀释液进行1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320倍稀释选择最佳待检样品加入量，进行矩阵交叉BTV C-ELISA方法检测，确定最佳稀释倍数，将腹水稀释液和血清样品混合加入ELISA反应板中；同时，反应时间分别设置为1 h、2 h、3 h，确定各步骤最佳反应时间。TMB显色反应时间分别为10 min、15 min、20 min，确定最佳显色时间。根据优化反应剂量和时间的结果，确定该检测方法的标准操作程序。
1.4 血清样品的鉴定按照BTV抗体ELISA试剂盒说明书，检测70份血清样品，确定样品血清的来源动物是否感染BTV。
1.5 判断标准的确定利用1.3建立的检测方法，同时对50份阴性绵羊、山羊和牛阴性血清进行检测，测得血清OD450，计算阻断率，计算公式为PI (阻断率)= {1?(ODx?ODmin)/(ODmax?ODmin)}×100% (ODmax为不加样品时的吸光值，ODx为样品的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值)。计算50份血清样本PI值的平均值(x)和标准方差(s)，根据统计学原则，将x+2s设定为样本的阴、阳性血清的临界值。样本的PI值 > x+2s时，可以在99.9%的水平上判为阳性。
1.6 特异性试验利用两种C-ELISA分别检测1-24型BTV标准阳性血清及阴性样品各10份，按照1:200稀释倍数，每孔100 μL加样。分别评价基于4A-1G7和4B-1B6的C-ELISA的特异性。
1.7 敏感性试验将BTV-4标准阳性血清做1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160和1:320 7个稀释度，分别用基于4A-1G7和4B-1B6单抗建立的C-ELISA检测不同稀释度血清，分析该C-ELISA可以检测到的标准阳性血清的最小稀释度，判断该方法的敏感性。
1.8 重复性试验选取10份血清，用3次包被的酶标板，各进行3次重复试验，计算其变异系数，评价重复性。
1.9 临床样品的检测以1.3方法确定的最佳反应条件，以1.5方法确定的阻断率临界值为标准，共检测了20份BTV阳性血清，并与群特异性BTV抗体ELISA试剂盒检测结果进行比较。
2 结果与分析2.1 血清样品的鉴定经BTV群特异性抗体ELISA试剂盒检测，70份血清样品中，50份血清样品检测结果为阴性，20份血清为阳性。
2.2 优化反应条件反应体系及反应条件经优化后试剂的最佳稀释度和反应条件见表 1、2。该批次检测用抗原PBS稀释，待检样品每孔加入100 μL。
表 1 基于4A-1G7的C-ELISA检测方法的反应条件优化结果Table 1 The optimized conditions for the 4A-1G7-based C-ELISA
| Detection with BTV antigen | Sample | Detection with BTV mouse Ab | TMB substrate | |
| Optimal reaction conditions | 5 μg/well | 1:20 | 0.42 μg/well | 100 μL/well |
| 37 ℃, 1 h | 37 ℃, 2 h | 37 ℃, 2 h | 37 ℃, 10 min |
表选项
表 2 基于4B-1B6的C-ELISA检测方法的反应条件优化结果Table 2 The optimized conditions for the 4B-1B6-based C-ELISA
| Detection with BTV antigen | Sample | Detection with mouse Ab to BTV | TMB substrate | |
| Optimal reaction conditions | 5 μg/well | 1:20 | 0.27 μg/well | 100 μL/well |
| 37 ℃, 1 h | 37 ℃, 2 h | 37 ℃, 2 h | 37 ℃, 10 min |
表选项
2.3 判断标准的确定采用优化后的基于4A-1G7的C-ELISA检测方法对50份羊和牛BTV阴性血清进行检测，抑制率和血清份数分布见图 1。测定OD450值，本次检测阻断率平均值为21%，标准差为13%，根据公式x+2s计算，阳性和阴性结果判定的临界值为49%。最终确定阴阳性判定阻断率临界值为抗原对照平均OD450的49%，即阻断率大于或等于49%的判为BTV阳性血清。
 |
| 图 1 基于4A-1G7的C-ELISA检测方法对阴性血清抑制率及对应血清份数分布图 Figure 1 The assay of negative serum samples of the 4A-1G7-based C-ELISA. |
| 图选项 |
用优化后的基于4B-1B6的C-ELISA检测方法对50份羊和牛BTV阴性血清进行检测，抑制率和血清份数分布见图 2。该方法检测阻断率平均值为23%，标准差为5%，根据公式计算，阳性和阴性结果判定的临界值为33%，考虑到个别样品接近40%的抑制率，最终确定阻断率大于或等于40%的判为BTV阳性血清。
 |
| 图 2 基于4B-1B6的C-ELISA检测方法对阴性血清抑制率及对应血清份数分布图 Figure 2 The assay of negative serum samples of the 4B-1B6-based C-ELISA. |
| 图选项 |
2.4 敏感性分析分别采用优化后的检测方法检测不同稀释度的标准BTV-4阳性血清，其中基于4A-1G7的C-ELISA检测结果为稀释度1:80时，PI > 49%；基于4B-1B6的C-ELISA检测结果为稀释度1:40时，PI > 40%。
2.5 特异性分析采用建立地方法检测1-24型BTV标准阳性样品及标准阴性样品，结果如表 3所示。结果表明两种检测方法可以检测到BTV-4标准阳性血清，但是对其他血清型的BTV病毒抗血清有一定的交叉反应。然而，两种检测方法联合应用时，当两种方法检测结果共同为阳性时，该样品为BTV-4、BTV-18或BTV-20感染的动物血清，即可以区分出BTV-4、BTV-18和BTV-20与其他血清型的BTV感染后的动物血清。
表 3 BTV-4特异性竞争ELISA的特异性试验检测结果Table 3 The specificity test of BTV-4-specific competitive ELISAs
| Samples | 4A-1G7 C-ELISA (%) | 4A-1G7 C-ELISA result | 4B-1B6 C-ELISA (%) | 4B-1B6 C-ELISA result | Superimposed result of both methods |
| BTV-1 | 1 | - | 21 | - | -/- |
| BTV-2 | 33 | - | 37 | - | -/- |
| BTV-3 | 68 | + | 38 | - | +/- |
| BTV-4 | 59 | + | 54 | + | +/+ |
| BTV-5 | 25 | - | 63 | + | -/+ |
| BTV-6 | 18 | - | 1 | - | -/- |
| BTV-7 | 41 | - | 10 | - | -/- |
| BTV-8 | 35 | - | 24 | - | -/- |
| BTV-9 | 35 | - | 71 | + | -/+ |
| BTV-10 | 48 | - | 37 | - | -/- |
| BTV-11 | 55 | + | 39 | - | +/- |
| BTV-12 | 38 | - | 66 | + | -/+ |
| BTV-13 | 63 | + | 38 | - | +/- |
| BTV-14 | 48 | - | 56 | + | -/+ |
| BTV-15 | 46 | - | 31 | - | -/- |
| BTV-16 | 53 | + | 38 | - | +/- |
| BTV-17 | 48 | - | 56 | + | -/+ |
| BTV-18 | 66 | + | 45 | + | +/+ |
| BTV-19 | 55 | + | 57 | - | +/- |
| BTV-20 | 60 | + | 73 | + | +/+ |
| BTV-21 | 41 | - | 66 | + | -/+ |
| BTV-22 | 50 | + | 39 | - | +/- |
| BTV-23 | 38 | - | 36 | - | -/- |
| BTV-24 | 68 | + | 26 | - | +/- |
| Negative serum | 8 | + | 4 | - | -/- |
表选项
2.6 重复性分析利用3批次试剂对10份绵羊血清分别用两种方法进行检测，所有试剂均为不同批次，检测结果表明同一份血清检测试剂批次间的变异系数在4%?10%，无显著差异。
2.7 临床样品检测将经BTV群特异性ELISA试剂盒检测结果为阳性的20份BTV血清样品，经基于4A-1G7和4B-1B6的C-ELISA方法检测均为阳性的样品含有3个，该检测样品为BTV-4、BTV-18或BTV-20感染的动物血清，排除其他血清型的感染，可以初步区分检测样品来源动物感染BTV的血清型。
3 讨论近些年，随着全球气候变暖，蓝舌病在世界各地不断暴发，BTV血清型众多[19]，且各型之间交叉免疫性差[20-21]，因此建立一种可以检测BTV各血清型的快速、敏感性的检测方法尤为重要[22]。BT血清抗体效价检测是了解BT感染情况、检测疫苗免疫效果的必要手段，目前BT血清抗体检测的主要方法之一是竞争ELISA[23]。目前，国内主要研究了BTV群特异性的竞争ELISA方法，未见有对BTV的型特异性竞争ELISA方法建立。本研究中，分别采用4型BTV VP2-A/B蛋白为包被抗原，分别用抗BTV-4 VP2单克隆抗体4A-1G7、4B-1B6为竞争抗体，建立了两种竞争ELISA方法。
特异性强和敏感性高是ELISA检测方法的最大优点，微量的样品就能引起高效的抗原抗体反应[24]，因此，准确选择抗原的包被浓度和血清样品的稀释度是ELISA实验的重要环节之一。通过对标准阳性样品、阴性样品和临床样品的检测，分析表明这两种方法具有良好的特异性和敏感性[25-26]。用两种C-ELISA方法的灵敏度进行了检测，确定该C-ELISA的检测灵敏度分别为1:80、1:40。国外有报道的类似产品可检测的血清稀释度范围为1:15-1:220[25]，可见，两种方法的灵敏度符合C-ELISA的鉴定范围。本研究建立的竞争ELISA方法的敏感性、特异性和重复性符合OIE《哺乳动物、禽类和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》标准[27]。
同时，利用基于4A-1G7和4B-1B6的C-ELISA方法联合应用可以区分出BTV-4、BTV-18或BTV-20感染的血清型。用基于4A-1G7的C-ELISA方法检测出的阳性样品，为BTV-3、BTV-4、BTV-11、BTV-13、BTV-16、BTV-18、BTV-19、BTV-20、BTV-22或BTV-24感染的动物血清；用基于4B-1B6的C-ELISA方法检测出的阳性样品，为BTV-4、BTV-5、BTV-9、BTV-12、BTV-14、BTV-17、BTV-18、BTV-20或BTV-21感染的动物血清。当同一个样品用两种方法检测结果均为阳性时，该样品为BTV-4、BTV-18或BTV-20感染的动物血清，即可以区分出BTV-4、BTV-18和BTV-20与其他血清型的BTV感染后的动物血清。如果两种方法检测结果均为阴性，待检样品可能为BTV-1、BTV-2、BTV-6、BTV-7、BTV-8、BTV-10、BTV-15或BTV-23型感染的动物血清；如果4A-1G7的检测结果为阳性而4B-1B6的结果为阴性，待检样品可能为BTV-3、BTV-11、BTV-13、BTV-16、BTV-19、BTV-22或BTV-24型感染的动物血清；如果4A-1G7的检测结果为阴性而4B-1B6的结果为阳性，待检样品可能为BTV-5、-9、-12、-14、-17或-21型感染的动物血清。BTV-4 VP2 (GenBank Accession No. AM132566356) 与BTV-18 VP2 (No. KX442585.1) 和BTV-22 VP2 (No. AJ585141.1) 的氨基酸序列同源性分别为52%和70%。本实验对比分析4A-1G7 (160NH161)、4B-1B6 (501SRS503)抗原表位与BTV-18、BTV-20 VP2氨基酸序列，发现BTV-18 VP2的第163-164位为NH片段，395-397位为SRS片段；发现BTV-20 VP2 161-162位为NH片段，502-503位为SRS片段。Maan等推测[12, 28]，BTV-18 VP2的163-164位、395-397位，能够识别BTV-18；BTV-20 VP2的502-503位能够识别BTV-20，与本实验所得结果相符合，即4A-1G7 C-ELISA和4B-1B6 C-ELISA两种方法检测BTV-4、BTV-18、BTV-20结果均应为阳性。
本研究采用针对BTV VP2型特异性单克隆抗体4A-1G7和4B-1B6建立C-ELISA，该检测方法短时间内(3?4 h)，可以用于初步区分不同型BTV感染的动物血清，并且实验条件要求低，具有型特异性，可用于大规模的血清抗体普查，并且本研究为下一步建立BTV型特异性检测方法奠定基础。
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