, 史劲松1, 许正宏21 江南大学 药学院，江苏 无锡 214122;
2 江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122
收稿日期：2017-01-13;接收日期：2017-03-29; 网络出版时间：2017-04-11 基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划) (No. 2011AA02A211)，江苏省普通高校学术学位研究生科研创新计划项目(No. KYLX16_0826) 资助
摘要：以实验室前期筛选得到的分枝杆菌(Mycobacterium sp. LY-1) 为出发菌株，采用等离子诱变(ARTP)技术选育出能高效转化植物甾醇为重要甾体药物中间体9α-羟基雄甾-4-烯-3, 17-二酮(9α-OH-AD)的菌株，并对其转化工艺进行优化。经过ARTP诱变选育得到遗传稳定性较好的分枝杆菌突变株Mycobacterium sp. C33，当底物植物甾醇投料浓度为15 g/L时，转化生成9α-OH-AD的摩尔得率达到15.5%，较原始菌株提高34.8%。继而采用正交实验设计方法，对突变菌的发酵培养基组分进行优化，并建立了油水双相转化体系，进一步提高了突变菌株C33的产物摩尔得率，最高达到47.0%，较优化前(15.5%)提高了2倍。
关键词：分枝杆菌 植物甾醇 9α-OH-AD 等离子诱变 生物转化
Mutation breeding of high 9α-hydroxy-androst-4-ene-3, 17-dione transforming strains from phytosterols and their conversion process optimization
Yang Ma1, Xiangdong Wang1, Menghui Wang1, Hui Li1
, Jinsong Shi1, Zhenghong Xu2 1 School of Pharmaceutical Science, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China;
2 School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
Received: January 13, 2017; Accepted: March 29, 2017; Published: April 11, 2017
Supported by: National High Technology Program of China (863 Program) (No. 2011AA02A211), Jiangsu College and University Academic Degree Graduate Research and Innovation Program (No. KYLX16_0826)
Corresponding author:Hui Li. Tel: +86-510-85326883; Fax: +86-510-85328177; E-mail: lihui@jiangnan.edu.cn
Abstract: In order to improve transformation efficiency of phytosterols into 9α-hydroxylation of 4-androstene-3, 17-dione (9α-OH-AD) by Mycobacterium sp. LY-1, we studied the strains breeding using atmospheric and room temperature plasma (ARTP) technology and optimized their conversion process. A high production strain named C33 with a good genetic stability was selected and the product molar yield reached to 15.5%, 34.8% higher than that of original strain with 15 g/L phytosterols. Furthermore, the fermentation medium was optimized through the design of orthogonal experiment. Besides, oil-water bidirectional transformation system was set up to improve the 9α-OH-AD molar yield of mutant strain C33. With adding 12 mL soybean oil to each 1 g phytosterols, the molar yield of 9α-OH-AD reached 47.0%, which increased twice than that of control (15.5%).
Key words: Mycobacterium sp. phytosterol 9α-OH-AD atmospheric and room temperature plasma biotransformation
甾体激素类药物主要包括性激素、肾上腺皮质激素和蛋白同化激素三大类[1]。甾体激素药物最首要的药效体现在对人类生育能力的改善[2-4]，其次还具有显著的抗肿瘤、抗炎抗敏、抗菌抗病毒、抗痉挛等效果[5-7]。由于甾类激素药物对人体机体发挥着十分重要的调节作用，因此该类药物现已成为仅次于抗生素的第二大品种。由于传统化学合成法带来严重的工业污染，并且存在收率低、成本高等问题，极大地限制了甾体激素在药物领域的发展，故近年来利用微生物转化逐渐成为主要发展趋势[8]。
植物甾醇是大豆榨油后的下脚料，作为新的甾体资源，由于其来源丰富、价格低廉，使得产品价格大幅度下降，为甾体激素药物产品带来了新的市场。植物甾醇是一类疏水性化合物，它的低溶解性导致的传质限制是其转化的瓶颈问题之一[9]。双相转化体系一定程度上为解决这个问题提供了有力的技术保障，采用天然油脂能够增加甾醇溶解度，且对微生物的伤害较低[10-13]。
9α-羟基雄甾-4-烯-3, 17-二酮(9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体[14]，其9α位作为被羟基化的位点，在进行简单的卤化反应后便可引入F或Cl等卤素取代基，从而有效提升某些皮质类激素(如地塞米松、倍他米松、糠酸莫米松及氯地米松等药物)的药效[15]，因此研究由植物甾醇转化生成9α-OH-AD具有广阔的市场前景。但利用微生物转化植物甾醇生成9α-OH-AD仍存在转化率低、产物得率低及产物纯度不高等诸多问题。要切实提高转化率，可行的措施主要包括：一是通过诱变筛选方法获得优势菌株，二是通过基因工程技术进行菌株改造，三是通过优化调整转化工艺。由于在分子操作方面尚存在一定难度，我们尝试以实验室1株可转化植物甾醇生成9α-OH-AD的分枝杆菌Mycobacterium sp. LY-1作为出发菌株，采用诱变结合工艺调整和优化的方法提升转化效率，以提高目的产物9α-OH-AD的浓度。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种分枝杆菌Mycobacterium sp. LY-1，由本实验室保藏。
1.1.2 试剂植物甾醇(β-谷甾醇47.0%，菜油甾醇24.6%，豆甾醇15.5%，菜籽甾醇3.4%)购自湖北巨胜科技有限公司；9α-羟基雄甾-4-烯-3, 17-二酮(9α-OH-AD)购自上海瀚香生物科技，纯度为98.0%以上。
1.1.3 培养基PDA斜面培养基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，琼脂20。
种子培养基(g/L)：NaNO3 5.4，酵母粉15，甘油2，(NH4)2HPO4 0.6。
发酵培养基(g/L)：NaNO3 5.4，玉米浆20，(NH4)2HPO4 0.6，植物甾醇15，pH 8.0。
1.2 方法1.2.1 菌株的培养将PDA斜面保存的分枝杆菌菌体接种于无菌种子培养基，120 r/min、30 ℃摇床培养72 h。
1.2.2 菌株诱变时间的选择将斜面上挑取的分枝杆菌移至100 mL种子培养基中，30 ℃、120 r/min摇床培养72 h至菌体的对数生长期，取0.01 mL菌液均匀地涂在金属载片上。把装有样品的金属载片平板放到ARTP诱变系统操作室里，逐渐增加诱变时间(15–210 s)进行诱变。诱变结束后，用镊子把金属载片移至装有1 mL培养基的EP管里，制成新的菌悬液。对新的菌悬液进行后培养7 d，培养结束后记录下各平板的菌落数，计算诱变致死率，如下式，确定最佳诱变时间。
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1.2.4 突变株的遗传稳定性评价将筛选出的优势突变株分别进行转化培养，测定其9α-OH-AD的生成能力，将保种管中的突变菌株分区划线于PDA固体培养基上培养7 d，挑取单菌落于种子培养基中，120 r/min、30 ℃摇床培养72 h，转接发酵培养基7 d后测定9α-OH-AD得率，再将该种子液重新划线于PDA固体培养基上培养7 d，挑取单菌落于种子培养基，按上述步骤重复5次，比较每次9α-OH-AD得率，以考察突变菌株的遗传稳定性。
1.2.5 菌体生物量测定菌体生物量以每升转化液中的菌体干重来表示。取洁净的离心管75 ℃烘干至恒重，称重记为W1。准确量取1 mL的待测菌液置于离心管中，12 000 r/min离心3 min后弃上清，用乙酸乙酯清洗菌体3遍。将含菌体的离心管再次烘干至恒重，称量得到菌体与离心管的重量之和，记为W2。W2与W1之差即为1 mL的待测菌液中的菌体干重。
1.2.6 产物提取准确量取0.5 mL待测发酵液，用等体积乙酸乙酯反复萃取6遍，合并萃取后的上清液，将上清液烘干得到底物、副产物、产物的混合物，用8倍体积的乙腈复溶稀释后，0.22 μm有机滤膜过滤除杂，HPLC分析转化液中底物、副产物、产物含量。
1.2.7 分析方法采用高效液相色谱法(HPLC)检测产物，配制0.5 g/L的9α-OH-AD标准品，利用外标法计算目的产物的浓度。色谱柱，Agilent TC-C18 (4.6 mm× 250 mm，5 μm)；流动相，乙腈/水(7:3，体积比)；柱温30 ℃；检测波长254 nm；流速0.5 mL/min；进样10 μL。
产物摩尔得率计算方法：
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1.2.8 正交实验设计筛选最佳培养基组分根据原始培养基组分设计3因素3水平正交试验(表 1)。按照实验设计分别配制发酵培养基。以1.0%的接种量将种子液转接到发酵培养液中，30 ℃、120 r/min摇床培养7 d。采用统计学方法分析实验结果，确定最优培养基配方。
表 1 正交试验设计Table 1 Orthogonal test design
| Levels | NaNO3 (g/L) | Corn steep liquor (g/L) | (NH)2HPO4 (g/L) |
| A | B | C | |
| 1 | 4 | 15 | 0.4 |
| 2 | 5 | 20 | 0.6 |
| 3 | 6 | 25 | 0.8 |
表选项
1.2.9 油水双相转化体系的建立按照每投加1 g底物，加入16 mL的油量向发酵培养基中加入大豆油、菜籽油、葵花籽油、橄榄油，并与无油转化进行对比，比较5种条件下9α-OH-AD的积累量。
选择最佳的油水转化方式后，对油的添加浓度进行梯度优化，当投加每1 g底物时，分别加入4、8、12、16、20 mL油量进行转化，30 ℃，120 r/min培养7 d后，乙酸乙酯萃取发酵液进行HPLC检测，根据9α-OH-AD得率，确定最优的油添加浓度。
2 结果与分析2.1 分枝杆菌Mycobacterium sp. LY-1的ARTP诱变2.1.1 最佳诱变时间的确定将分枝杆菌Mycobacterium sp. LY-1经ARTP诱变照射不同时间后进行再生培养，根据再生单菌落数计算其致死率，结果如图 1所示。随着ARTP诱变时间的延长，菌体致死率迅速增加。当照射时间为150 s时，菌体致死率达到98.0%左右，当达到180 s时，平板无菌体生长，由于等离子诱变在致死率较高时比较易发生正向突变，故选择150 s作为原生质体的处理时间。
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| 图 1 不同诱变时间菌体的致死率 Figure 1 The lethality of the cells in different mutagenic time. |
| 图选项 |
2.1.2 突变菌株的选育及转化能力验证在ARTP诱变系统操作室对菌体照射150 s后，涂布于PDA平板上培养7 d，从单菌落中挑取150株突变株，测定各突变株的9α-OH-AD得率。如图 2、3所示，通过摇瓶转化实验验证，最终筛选得到8株正向突变菌株C3、C12、C21、C25、C27、C33、C39、C49，其中C33产物得率较野生菌提高最多，9α-OH-AD摩尔得率达到15.5%。
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| 图 2 优势突变菌株的筛选 Figure 2 Screening of dominant mutant strains. |
| 图选项 |
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| 图 3 产物HPLC检测图谱(A：9α-OH-AD标样，B：出发菌株LY-1，C：诱变菌株C33) Figure 3 Detection of the product by HPLC (A: 9α-OH-AD standard, B: original strain LY-1, C: mutagenic strain C33). |
| 图选项 |
2.1.3 最佳诱变时间的确定将突变株C33进行传代培养，以考察其遗传稳定性。如图 4所示，经过连续5代的培养，确定其为1株稳定性好且转化率高的菌株。
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| 图 4 突变菌株C33的遗传稳定性 Figure 4 Genetic stability of mutant strain C33. |
| 图选项 |
2.2 突变菌株的转化工艺优化2.2.1 培养基组分的优化培养基的组分、配比、缓冲能力都对微生物的生长和产物形成有重要的影响。本试验采用正交实验设计方法，在摇瓶中对分枝杆菌转化植物甾醇的培养基组分(NaNO3、玉米浆和(NH4)2HPO4)进行优化，进一步研究各组分对菌种转化能力的影响。设计了三因素三水平的正交试验，以9α-OH-AD的浓度为指标，选用L9(33)正交表进行培养基的进一步优化，并进行极差分析。正交试验结果见表 2。
表 2 正交试验结果Table 2 The results of orthogonal test
| Group | A | B | C | 9α-OH-AD yield (%) |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 13.71 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 13.88 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 12.44 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 15.42 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 11.81 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 14.61 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 12.89 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 9.56 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 15.06 |
| Average 1 | 1.48 | 1.55 | 1.40 | |
| Average 2 | 1.55 | 1.30 | 1.64 | |
| Average 3 | 1.39 | 1.56 | 1.37 | |
| Mean square (R) | 0.16 | 0.26 | 0.27 |
表选项
由极差R值可知，(NH)2HPO4浓度对转化产物的形成影响最为显著，然后依次是玉米浆、NaNO3。正交实验得到的理论最佳培养基配方为A2B3C2，即NaNO3 5 g/L，玉米浆25 g/L，(NH)2HPO4 0.6 g/L，此条件下9α-OH-AD得率最高。
2.2.2 油水双相转化体系的构建及优化油水双相转化体系的建立：构建油水双相体系可以很大程度地提高9α-OH-AD的积累量，两相体系中用到的大豆油脂，能够有效增加甾醇溶解度，且相比有机溶剂对微生物的伤害性更低。在转化过程中，加入油脂可以提高甾醇的投料量和菌体的活力[16-17]，因此采用该体系，利用突变菌株C33转化植物甾醇，从图 5可以看出，大豆油-水双相体系下9α-OH-AD的得率最高，并且大豆油的价格相对也较低，故采用大豆油进行后续实验。从图 6可以看出，9α-OH-AD浓度在转化7 d左右的时间达到最高，摩尔得率达到43.0%以上。
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| 图 5 油水双相体系中油类的筛选 Figure 5 Screening of oil in biphasic system. |
| 图选项 |
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| 图 6 突变菌株C33油水双相体系转化参数 Figure 6 Batch conversion process of oil-water biphasic system with C33. |
| 图选项 |
大豆油添加浓度的优化：在建立油水双相体系并大大提高9α-OH-AD得率后，本实验对大豆油进行了进一步的浓度优化，结果如图 7所示。当大豆油的添加量为每1 g植物甾醇添加12 mL时，9α-OH-AD的摩尔得率最高，达到47.0%以上。
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| 图 7 不同油梯度的转化效果 Figure 7 Effects of different soybean oil concentrations on product yield. |
| 图选项 |
3 结论本实验以实验室保存的分枝杆菌Mycobacterium sp. LY-1为出发菌株，采用等离子诱变技术(ARTP)对菌株进行诱变选育。通过筛选，成功获得了1株遗传稳定性良好，且能高效转化植物甾醇产9α-OH-AD的突变菌株C33，并对诱变菌的发酵培养基进行了正交实验优化，确定了最适培养基组分为：NaNO3 5 g/L，玉米浆25 g/L，(NH4)2HPO4 0.6 g/L。此外，建立了油水双相转化体系，优化后得到当每1 g植物甾醇添加12 mL大豆油时9α-OH-AD得率最高，投加15 g/L底物时，9α-OH-AD摩尔得率可达到47.0%以上。
目前利用微生物转化植物甾醇的产物多为AD与ADD，或以AD为底物转化生成9α-OH-AD，直接由植物甾醇生成9α-OH-AD的报道相对较少，后续研究希望通过提高底物投料量，为工业化生产创造更大的价值。本实验中大豆油的作用机制尚不明确，仅了解到其对底物起到助溶作用，但对菌体细胞膜结构是否存在影响从而增强了底物传质效率，仍需要进一步实验探究。本文的研究结果可作为大豆油作用机制的研究基础，对于其他微溶于水底物的生物转化研究也具有一定的参考价值。
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