江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122
收稿日期：2016-11-01;接收日期：2017-01-24 基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划) (No. 2014AA021304)，国家自然科学基金(No. 31400078) 资助
摘要： 酶转化法是生产β-丙氨酸的重要途径，但单一酶法转化存在底物价格较高的问题。通过构建双酶催化体系制备β-丙氨酸，即将来源于大肠杆菌的天冬氨酸酶(AspA)和来源于谷氨酸棒杆菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)偶联，以富马酸和氨为底物进行酶促反应合成β-丙氨酸。催化反应中AspA与PanD的最适加酶比例为1:80，其中AspA的浓度为10 μg/mL，转化温度为37 ℃，pH为7.0；浓度为100 mmol/L的富马酸可在8 h内被完全转化，转化率为100%，摩尔产率为90.9%，β-丙氨酸的产量为90 mmol/L，约为7 g/L；浓度为200 mmol/L的富马酸在反应8 h后，体系中β-丙氨酸的产量为126 mmol/L，约合9.8 g/L，继续延长反应时间，转化率并没有明显提高。根据该研究提出的双酶偶联转化工艺可将价格低廉的富马酸一步转化为具有高附加值的β-丙氨酸。
关键词： 天冬氨酸酶 L-天冬氨酸α-脱羧酶 β-丙氨酸 天冬氨酸酶 双酶偶联
Biocatalytic access to β-alanine by a two-enzyme cascade synthesis
Yu Gao, Zhongmei Liu, Ke Liu, Zhemin Zhou, Wenjing Cui
College of Bioengineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
Received: November 1, 2016; Accepted: January 24, 2017
Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2014AA021304), National Natural Science Foundation of China (No. 31400078)
Corresponding author:Wenjing Cui. Tel/Fax: +86-510-85197551; E-mail: wjcui@jiangnan.edu.cn
Abstract: Enzymatic synthesis is an important way to produce β-alanine, but the biological method is expensive generally because of the high price of substrate. In this paper, a two-step enzymatic cascade system was developed, combining L-aspartase from Escherichia coli DH5α and L-aspartate α-decarboxylase from Corynebacterium glutamicum. This system catalyzes Fumarate and ammonia to β-alanine. The optimal ratio of AspA and PanD was 1:80 (W/W), and the concentration of AspA was 10 μg/mL, at 37 ℃ and pH 7.0. When the concentration of Fumarate was 100 mmol/L, the reaction reached its equilibrium after 8 h, and the yield of β-alanine was 90 mmol/L (7 g/L). The yield of β-alanine can reach 126 mmol/L (9.8 g/L) when the concentration of Fumarate increased to 200 mmol/L. Extending reaction time, the conversion rate did not change obviously. Using this two-step enzymatic cascade system, β-alanine from cheaper substrate Fumarate can be obtained.
Key words: L-aspartase L-aspartate α-decarboxylase β-alanine L-aspartase enzyme cascade
β-丙氨酸是自然界中唯一存在的β-型氨基酸，也是一种非蛋白氨基酸，存在于某些细菌、真菌和植物中[1]。β-丙氨酸及其衍生物在医药、食品、化工等领域都有着广泛的应用。在医药方面，β-丙氨酸用于合成泛酸、泛酸钙、肌肽、帕米膦酸钠和巴柳氮等[2]；在化工方面应用于电镀、铅中毒解毒剂及合成甜味剂[3]。国内外β-丙氨酸的生产主要以化学合成法为主[4]，即以丙烯酸或丙烯腈为底物进行合成，此法生产过程中消耗大量能量，同时对环境和生物体都有一定的毒害作用。另一种生产方法是生物合成法，利用L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartate α-decarboxylase，EC4.1.1.11，PanD)、以L-天冬氨酸为底物催化生成β-丙氨酸[5]，此法专一性高且环保，缺点是L-天冬氨酸价格偏高。
L-天冬氨酸α-脱羧酶催化L-天冬氨酸脱去α位的羧基生成β-丙氨酸，是生物体内泛酸合成途径中重要的酶。诸多报道对不同来源的PanD进行了详细的研究[6-8]，其中来源于谷氨酸棒杆菌的PanD酶是一类依赖于丙酮酰基的四聚体脱羧酶，其特点为酶活高且能够在菌体内进行自裂解。酶法制备β-丙氨酸的研究中，浙江工业大学张潇潇[9]通过将钝齿棒杆菌来源panD基因重组到大肠杆菌中进行表达并优化条件，最终β-丙氨酸的产量达到76.47 mg/L；华东理工大学范海洋[10]优化大肠杆菌来源PanD重组菌，将产量提高至130 mg/L；浙江工业大学楼坚等[11]最终将发酵液中β-丙氨酸的产量提高至649 mg/L。
工业生产天冬氨酸，主要是由天冬氨酸酶(L-Aspartase，EC4.3.1.1，AspA)催化富马酸加氨合成L-天冬氨酸。大肠杆菌来源AspA由4个相同的亚基组成，单体分子量为50 kDa左右。AspA催化富马酸加氨合成L-天冬氨酸的反应为可逆反应，所以富马酸不能完全转化为L-天冬氨酸[12-13]。
因为富马酸价格较天冬氨酸低廉，本研究以富马酸和氨水为底物，构建AspA和PanD双酶偶联制备β-丙氨酸体系。通过条件优化，确定了最适酶比例和最适底物浓度，使整个反应体系中无中间产物L-天冬氨酸积累，将价格低廉的富马酸转化为目的产物。本研究为制备β-丙氨酸提供了新的思路与方法。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与培养基重组菌株E. coli BL21 pET-28a-aspA和E. coli BL21 pET-24a-panD，均为实验室前期构建。
E. coli的种子培养基为Luria-Bertani (LB)培养基，诱导培养基为Terrific-Broth (TB)培养基。
1.1.2 生化试剂富马酸、L-天冬氨酸钠、β-丙氨酸均购自上海生工生物工程有限公司。
1.2 方法1.2.1 PanD酶的表达将重组大肠杆菌BL21/pET24a-panD接种于4 mL卡那霉素浓度为100 μg/mL的TB培养基，37 ℃、200 r/min振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1%的接种量接种于含卡那霉素浓度为100 μg/mL的TB培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养至菌液OD600至0.6–0.8，加入IPTG至终浓度0.8 mmol/L，37 ℃诱导培养16–20 h，收集菌体超声破碎，通过Tris-tricine SDS-PAGE方法[14]分析鉴定重组蛋白表达水平。
1.2.2 AspA酶的表达将重组大肠杆菌BL21/pET28a-aspA接种于4 mL卡那霉素浓度为100 μg/mL的TB培养基，37 ℃、200 r/min振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1%的接种量接种于含卡那霉素浓度为100 μg/mL的TB培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养至菌液OD600为0.6–0.8，加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L，24 ℃诱导培养16–20 h，收集菌体超声破碎，通过SDS-PAGE分析鉴定重组蛋白表达水平。
1.2.3 重组蛋白的纯化和鉴定将重组菌体溶于结合缓冲溶液(50 mmol/L Na2HPO4、50 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑)，超声破碎，离心，上清用0.22 μm滤膜过滤。用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡5 mL的His Trap HF柱，取20 mL的破碎上清上样，用10倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，分别用8倍柱体积的150、300和500 mmol/L咪唑的缓冲液洗脱蛋白，收集样品后用透析袋密封，置于50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0) 中4 ℃透析6–8 h，去除残余咪唑，并用SDS-PAGE分析鉴定。
1.2.4 蛋白浓度的测定蛋白质定量采用常规的Bradford法[15]。
1.2.5 L-天冬氨酸及β-丙氨酸的测定反应液用苯基异硫酸酯(PITC)衍生，具体步骤为：取500 μL反应液于1.5 mL离心管，加入250 μL 0.1 mol/L PITC乙腈溶液和250 μL 1 mol/L三乙胺乙腈溶液，充分混匀，避光室温放置0.5 h，加入700 μL正己烷溶液，涡旋振荡器振荡1 min，静置30–60 min，吸取下层溶液，经0.22 μm有机滤膜过滤，进样量为10 μL[16]。
β-丙氨酸衍生产物用HPLC测定[17]。色谱柱为La Chrom C18 (5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相A溶液为80% (V/V)已腈水溶液，B溶液为97:3 (V/V，pH 6.5) 的0.1 mol/L乙酸钠-乙腈溶液；采用梯度洗脱：0–20 min，B溶液由95%下降到65%；20–30 min，B液由65%上升到95%；30–35 min，B溶液梯度不变。检测波长为254 nm，柱温为40 ℃。所测得衍生产物的含量等同于衍生前物质的含量。
1.2.6 富马酸的测定反应液经0.22 μm有机滤膜过滤后用HPLC检测，色谱柱为Prevail Organic Acid (OA)有机酸分析柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)。流动相为20%甲醇溶液(磷酸调pH至2.2)，流速为0.6 mL/min，检测波长为220 nm，柱温为40 ℃，检测时间为15 min，进样量为10 μL。
1.2.7 AspA催化富马酸生成L-天冬氨酸取20 μL AspA酶液(0.5 mg/mL)加到终浓度为50 mmol/L的NaH2PO4/Na2HPO4 (pH 7.0) 缓冲液中，然后在该体系中加入100 μL浓度为500 mmol/L的富马酸(NH4调pH至7.0)、10 μL浓度为100 mmol/L的MgCl2、无菌水补足1 mL反应体系，37 ℃、200 r/min下进行酶促反应(振荡反应)，终止反应时取适量反应液于100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，用0.22 μm微孔有机滤膜过滤，利用HPLC检测产物生成量。
1.2.8 PanD催化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸反应进程的测定取200 μL PanD酶液(2 mg/mL)加到终浓度为50 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液(pH 7.0) 中，然后在该体系中加入100 μL浓度为500 mmol/L的L-天冬氨酸溶液，最后用无菌水补足至1 mL反应体系，37 ℃、200 r/min下进行酶促反应(振荡反应)，终止反应时取适量反应液于100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，用0.22 μm微孔有机滤膜过滤，利用HPLC检测产物生成量。
1.2.9 双酶串联反应在含有一定浓度的底物富马酸和足量氨(调pH至7.0) 的10 mL反应液中，加入一定比例的两种酶，反应体系中含有1 mmol/L的MgCl2，50 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液(pH 7.0)，37 ℃、200 r/min下进行酶促反应(振荡反应)，终止反应时取适量反应液于100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，用0.22 μm微孔有机滤膜过滤，利用HPLC检测反应液中各成分的含量，计算β-丙氨酸的产率。
2 结果与分析2.1 酶的表达和纯化携带aspA和panD目的基因的重组大肠杆菌经IPTG诱导后表达，细胞超声破碎后的细胞破碎液经亲和柱纯化后，得到电泳纯的重组蛋白。结果如图 1A所示，纯化后的AspA蛋白为50 kDa左右，与AspA的理论分子量一致。
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| 图 1 重组蛋白及纯化电泳鉴定 Figure 1 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins and purified proteins. M: marker; 1: supernatant of E. coli pET28a-aspA cell; 2: purified AspA; 3: supernatant of E. coli pET24a-panD; 4: purified PanD. |
| 图选项 |
Tris-tricine电泳(图 1B)结果显示大部分PanD单体已自身裂解为α亚基(12.4 kDa)和β亚基(2.8 kDa)。β亚基在Tris-tricine凝胶上发生一定的迁移，是由于分子量小的蛋白形成球形，其较高的多肽内部的电荷不能被结合的SDS电荷所覆盖，所以偏离了相对迁移率和分子量对数的相互关系。电泳结果表明，在大肠杆菌中成功表达了大肠杆菌来源的aspA和谷氨酸棒杆菌来源的panD。
2.2 双酶偶联催化富马酸生成β-丙氨酸2.2.1 AspA催化富马酸加氨生成L-天冬氨酸10 μg/mL的AspA纯酶催化50 mmol/L的富马酸，结果如图 2所示。催化反应在2 h后即达稳定状态，由于该反应是可逆反应，即使延长反应时间，L-天冬氨酸的摩尔产率仍为75%。
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| 图 2 AspA催化富马酸生成L-天冬氨酸 Figure 2 AspA catalyzes fumarate. |
| 图选项 |
2.2.2 PanD催化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸400 μg/mL PanD催化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸的反应情况如图 3所示，50 mmol/L底物可在8 h内完全转化为L-天冬氨酸，转化率约为98%。
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| 图 3 PanD催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸 Figure 3 PanD catalyzes L-aspartate. |
| 图选项 |
2.3 优化两种酶比例上述结果可知，PanD的酶活较AspA低，催化反应进行较慢，是双酶体系中的限速酶。PanD的最适反应温度为55 ℃，最适pH为7.0左右[18]，而AspA的最适条件分别为55 ℃和pH 8.0左右[19]。由于偶联反应时间较长，考虑到蛋白酶在55 ℃条件下的反应12 h酶活损失严重，设定双酶偶联体系反应条件为37 ℃、pH 7.0。
在双酶偶联催化体系中，固定富马酸浓度为50 mmol/L，AspA的添加浓度为10 μg/mL，调整PanD的添加量，使AspA与PanD的加酶质量比分别为1:40、1:60、1:80，进行双酶偶联反应。
结果如图 4所示，在1:40和1:60 (W/W)的反应体系中，反应8 h，β-丙氨酸的产率只有82%和93%，且尚有部分中间产物未完全转化，留在反应体系中，反应至12 h，1:40的反应体系中仍有中间产物。
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| 图 4 不同酶浓度比例下的双酶偶联催化 Figure 4 Enzyme cascade synthesis with different ratio. (A) AspA: PanD was 1:40 (W:W); (B) The ratio of AspA and PanD was 1:60 (W:W); (C) The ratio of AspA and PanD was 1:80 (W:W). |
| 图选项 |
而在1:80的反应体系中，反应8 h，富马酸可完全转化为β-丙氨酸，β-丙氨酸的产率 > 95%，中间产物L-天冬氨酸无残余。
随着PanD浓度的提高，β-丙氨酸的合成速度大大增加，且中间产物L-天冬氨酸的残余量减少。综合考虑选择1:80 (W/W)作为最适浓度比。
2.4 优化底物富马酸浓度前期研究以50 mmol/L的富马酸为底物进行酶促反应研究，此浓度无法满足高浓度制备β-丙氨酸的要求，故将AspA和PanD按照1:80 (W/W)的比例催化浓度为50、100、200 mmol/L的富马酸，HPLC检测β-丙氨酸含量(表 1)。同时监测了200 mmol/L富马酸反应进程中富马酸、天冬氨酸与β-丙氨酸的变化情况(图 5)。
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| 图 5 双酶偶联体系催化200 mmol/L富马酸 Figure 5 Enzyme cascade synthesis 200 mmol/L fumarate. |
| 图选项 |
表 1 不同底物浓度下双酶偶联体系转化生成β-丙氨酸的浓度Table 1 The production of β-alanine under different concentration of fumarate
| Fumarate (mmol/L) | 6 h (mmol/L) | 8 h (mmol/L) | 12 h (mmol/L) | 24 h (mmol/L) |
| 50 | 49.3±2.1 | 49.5±1.8 | 49.6±1.2 | 49.9±1.1 |
| 100 | 87.2±4.4 | 89.5±3.8 | 90.9±2.5 | 94.1±2.6 |
| 200 | 120.0±5.6 | 126±3.4 | 140.6±4.6 | 143.4±3.2 |
表选项
表 1结果显示，底物浓度为50 mmol/L时，酶促反应能在8 h内转化率达100%；底物浓度为100 mmol/L时，8 h内摩尔生成率为90%，合成β-丙氨酸的浓度为90 mmol/L，24 h后β-丙氨酸的产率在95%左右；当底物浓度增加至200 mmol/L时，反应速度明显减缓，8 h内β-丙氨酸的摩尔生成率为62%，体系中β-丙氨酸的浓度为126 mmol/L，延长反应时间至24 h后，β-丙氨酸的摩生成尔率为70%。图 5结果显示底物浓度为200 mmol/L时，反应12 h后残余约40 mmol/L的中间产物L-天冬氨酸，我们推测是由于高浓度的β-丙氨酸对PanD酶有抑制作用，使得β-丙氨酸得率在高浓度底物条件下反而降低至62%。
双酶偶联酶促反应的转化率随着时间的延长而增加，但由于反应逐渐趋于平衡，且振荡反应过程中部分酶会失活，24 h后反应体系中可明显观察到白色悬浮物，推断为蛋白酶变性沉淀。
3 结论本文利用AspA和PanD构建双酶偶联反应体系，催化底物富马酸合成β-丙氨酸。通过优化反应条件，确定最佳反应条件：100 mmol/L富马酸，AspA与PanD比例为1:80，其中AspA的浓度为10 μg/mL，温度37 ℃，pH 7.0。此条件下，8 h时β-丙氨酸的浓度为90 mmol/L，约合7 g/L。提高富马酸浓度为200 mmol/L，8 h底物的摩尔生成率为63%，β-丙氨酸的浓度约为126 mmol/L，约合10 g/L，相较之前的研究有显著的提高。然而就工业生产而言，β-丙氨酸的产量仍有很大提升空间。有文献报道真核来源的PanD酶具有更高的催化活性，下一步将考虑用真核来源PanD酶替代谷氨酸棒杆菌来源的PanD酶，进一步提高β-丙氨酸的产量。同时，细胞催化具有可重复利用、操作简便等优点，建立并优化全细胞催化工艺是下一步研究方向。
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