, 赵敏健2, 位曙光1, 赵朋1, 蒋文超1, 刘莉娜1, 赵萍11 西南大学 家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400715;
2 西南大学 生物技术学院，重庆 400715
收稿日期：2017-01-05;接收日期：2017-04-27; 网络出版时间：2017-05-17 基金项目：国家自然科学基金(Nos. 31402139, 31572465)，国家自然科学基金重点项目(No. 31530071)，重庆市基础科学与前沿技术研究专项(Nos. cstc2015jcyjA00040, cstc2015jcyjBX0035)，中央高校基本科研业务费(No. XDJK2013A019)，西南大学博士基金(No.SWU112111) 资助
摘要：精氨酸激酶(Arginine kinase，AK)是无脊椎动物体内能量代谢的关键酶，在生长发育、营养利用、免疫抗性、胁迫应答等生命活动过程中发挥着重要的调控作用。家蚕精氨酸激酶BmAK与能量平衡、抗NPV病毒过程相关，但目前关于其分子结构和酶学性质的研究不多。克隆了BmAK基因ORF序列，分析了其染色体定位、基因组结构、mRNA结构、二级结构和三级结构。进化分析表明AK在进化过程中高度保守。原核表达获得了可溶性的BmAK重组蛋白，通过Ni-NTA亲和层析纯化了BmAK。圆二色光谱分析显示BmAK包含α螺旋结构，其α螺旋结构在pH 5–10范围内相对稳定。酶活分析表明BmAK的最适温度为30 ℃，最适pH为7.5。25 ℃时BmAK的催化活性最大，在15–30 ℃范围内，BmAK的结构相对稳定，活性差别不大。BmAK的结构在pH 7.0左右相对稳定。这些研究为揭示BmAK的结构和功能提供了基础，有助于开发以AK为分子靶标的绿色安全环保的新型杀虫剂。
关键词：家蚕 精氨酸激酶 表达纯化 结构 活性
Prokaryotic expression, purification and characterization of arginine kinase of Bombyx mori
Huawei He1, Yejing Wang2
, Minjian Zhao2, Shuguang Wei1, Peng Zhao1, Wenchao Jiang1, Li'na Liu1, Ping Zhao1 1 State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400715, China;
2 College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China
Received: January 5, 2017; Accepted: April 27, 2017; Published: May 17, 2017
Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31402139, 31572465), State Key Program of National Natural Science of China (No. 31530071), Chongqing Research Program of Basic Research and Frontier Technology (Nos. cstc2015jcyjA00040, cstc2015jcyjBX0035), Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. XDJK2013A019), Start-up Grant from Southwest University (No. SWU112111)
Corresponding author:Yejing Wang. Tel: +86-23-68251575; E-mail: yjwang@swu.edu.cn
Abstract: Arginine kinase (AK) is a key enzyme in energy metabolism of invertebrates and plays an important regulatory role in the life activities such as growth and development, nutrition utilization, immune resistance and stress response. Arginine kinase of Bombyx mori (BmAK) is related to the energy balance and anti-NPV process, but there is little research on its molecular structure and enzymatic properties. We cloned the ORF sequence of BmAK gene, and analyzed chromosomal localization, genomic structure, mRNA structure, secondary and tertiary structure. Phylogenetic analysis indicated that AK was highly conserved in evolution. Soluble recombinant BmAK was obtained by prokaryotic expression, and purified by Ni-NTA affinity chromatography. The circular dichroism spectroscopy showed that BmAK contained α-helix structures, and its α-helix structures were relatively stable in the pH range between 5 and 10. Enzyme activity analysis showed that the optimum temperature of BmAK was 30 ℃ and the optimum pH of BmAK was 7.5. The optimal temperature of BmAK was 25 ℃. Between 15 ℃ and 30 ℃, the structure and activity of BmAK was relatively stable. The structure of BmAK was relatively stable at pH 7.0. Our findings reveal the structure and function of BmAK to develop novel green safe and environmentally friendly insecticides.
Key words: Bombyx mori arginine kinase expression and purification structure activity
精氨酸激酶(Arginine kinase, AK) (EC 2.7.3.3) 是无脊椎动物体内一种重要的磷酸原蛋白激酶。它可逆地催化ATP上的γ磷酸基团转移到精氨酸上，从而形成ADP和一种具有高能键的储能分子——磷酸精氨酸[1]。反应方程式如下：
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由于精氨酸激酶在生命活动过程中的重要作用，多种不同来源的精氨酸激酶基因被克隆和体外表达，其结构和功能的研究也不断深入。1995年，Ellington等首先克隆了美洲鲎精氨酸激酶基因，并对其序列进行了分析[13]。随后，Maleszka等克隆分析了蜜蜂的精氨酸激酶基因[14]。2006年，王华兵和徐豫松从家蚕中克隆了精氨酸激酶，并分析了其在不同组织和时期的表达特征[10]。之后，美洲大蠊[15]、蝗虫[16]、凡纳滨对虾[17-18]、家蚕[19]、棉铃虫[9-11, 20-21]、海参[22]、锯缘青蟹[23]、烟草夜蛾[12]、捻转血矛线虫[24]等精氨酸激酶基因相继被克隆，并对其时空表达、结构活性等进行了研究。陈克平等发现家蚕精氨酸激酶在抗NPV的家蚕品种中高表达，推测其可能与家蚕抗NPV病毒相关[4]。
虽然家蚕精氨酸激酶的研究已经取得了一些进展，但对其分子结构和酶学性质则知之甚少。本文从家蚕中克隆了精氨酸激酶基因，并将其构建到原核表达载体，进行表达纯化。在此基础上，进一步分析了其酶学性质和蛋白结构，为深入理解其分子结构和生物学功能提供了基础。
1 材料与方法1.1 材料和试剂蛋白分子量marker、硫酸卡纳霉素(Kana)、T4 DNA连接酶购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；大肠杆菌Escherichia coli DH5α和E. coli Transetta (DE3) 购自北京全式金生物技术有限公司；dNTPs、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自上海生工；EcoRⅠ、Hind Ⅲ和Q5高保真DNA聚合酶购自New England Biolabs公司；质粒抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。感谢美国西南医学中心张学武教授馈赠表达载体pSKB2。pSKB2是基于pET-28a(+)改造的载体，将thrombin的酶切位点替换为prescission的酶切位点，其他保持不变。
1.2 生物信息学分析利用家蚕基因组数据库SilkDB (http://silkdb.org/)和Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)分析家蚕精氨酸激酶(BmAK)染色体定位、基因组DNA和mRNA序列，利用Protparam (http://web.expasy.org/protparam/)分析BmAK蛋白分子量、等电点、结构域，并预测其二级结构和三级结构。以BmAK氨基酸序列为模板进行Blast分析，利用分子进化软件Mega[25]构建系统发育进化树。
1.3 表达载体构建根据BmAK的cDNA序列，利用Primer Premier软件进行引物设计，正反向引物分别为5′-CCGAATTCATGGTCGACGCCGCAACC-3′和5′-CGCAAGCTTCTACAGAGACTTCTCGATCTTGATGAGCT-3′，其中下划线部分分别表示EcoRⅠ和Hind Ⅲ的酶切位点。以5龄3天家蚕后部丝腺组织cDNA (本实验室提供)为模板，通过PCR扩增获得BmAK基因，利用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。将扩增获得的DNA片段通过凝胶回收试剂盒纯化回收，将pSKB2载体与目标DNA片段同时进行EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，再利用T4 DNA连接酶将二者连接。将连接产物转化DH5α，并通过菌落PCR、双酶切和基因测序对重组质粒进行验证。
1.4 蛋白原核表达蛋白表达纯化参考之前的方案[26-28]，此处简述如下。选择正确的重组质粒转化Transetta (DE3) 细胞，首先挑取单菌落37 ℃过夜培养，然后接种到含有卡那霉素的LB培养基中培养至OD600约0.8–1.0，加入0.1 mmol/L IPTG在16 ℃和37 ℃、220 r/min转速下分别培养20 h和4 h诱导BmAK表达，4 ℃、12 000 r/min离心20 min收集菌体，加入缓冲液A (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，10% Glycerol)悬浮细胞，冰浴超声破碎。破碎后的细胞于4 ℃、12 000 r/min离心，分别收集上清和沉淀，进行15% SDS-PAGE电泳。利用考马斯亮蓝染色分析不同培养温度下BmAK的表达情况。发现BmAK在两种温度下均在上清中表达，故选择37 ℃进行大量表达纯化。
1.5 重组蛋白的纯化在37 ℃、220 r/min转速下，加入0.1 mmol/L IPTG诱导4 h以大量表达重组BmAK蛋白。收集细胞，冰浴超声破碎，然后在4 ℃、12 000 r/min离心20 min收集上清。利用0.45 μm滤膜对上清过滤，然后在4 ℃下进行Ni-NTA亲和层析纯化，利用包含不同咪唑浓度的缓冲液进行梯度洗脱，分别收集不同组分的洗脱液，进行15% SDS-PAGE分析。考马斯亮蓝染色后，选择条带单一的梯度洗脱液进行浓缩，并利用HiPrep 26/10 (GE Healthcare)脱盐除去咪唑，同时置换为缓冲液B (20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，5%甘油)。收集脱盐后的蛋白溶液，浓缩后于–80 ℃冻存。
1.6 凝胶过滤分析取冻存的重组BmAK蛋白，解冻后于4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取上清载入Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare)凝胶层析柱进行凝胶过滤分析，上样体积0.5 mL，流速0.5 mL/min，流动相为缓冲液B。收集蛋白组分，进行15% SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析。
1.7 二级结构分析利用Millipore超滤浓缩离心管将纯化的BmAK蛋白置换于磷酸缓冲液PBS中，然后借助圆二色光谱仪MOS-500 (Bio-Logic，法国)对BmAK蛋白的二级结构进行分析。测试温度为25 ℃，波谱扫描范围为190–250 nm，所用比色皿光程为1 mm，蛋白浓度为0.1 mg/mL，扫描速度为240 nm/min。
分别将不同pH值的缓冲溶液与纯化的BmAK蛋白在室温下孵育30 min，然后利用MOS-500进行二级结构分析，以不含蛋白的相应pH缓冲溶液为空白对照。所有的实验重复3次，取平均值进行分析。
1.8 酶学活性检测BmAK的酶学活性检测参考于振行等[29]。酶活反应体系如下：57 mmol/L精氨酸，66 mmol/L乙酸镁，2 mL溴百里酚蓝指示剂，53.2 mg ATP钠盐，反应总体积为20 mL。反应溶液现配现用，并利用NaOH调节pH到7.5，注意避光保存。反应溶液首先在30 ℃温育10 min，然后取1 mL反应液加入比色皿中，再加入10 μL纯化的1 mg/mL BmAK，利用DU 800型紫外分光光度计(BECKMAN，美国)测定575 nm处吸光值在1 min中内下降的数值。重复上述实验，取3次测定的平均值为BmAK的活性。
1.9 最适反应温度和热稳定性分析将BmAK的酶活反应体系分别在10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃孵育10 min，然后再按照上述测活方法检测BmAK活性。以BmAK的最高反应活性为100%，其他温度下活性相对最高活性作图，从而确定BmAK的最适反应温度。接下来将BmAK溶液分别在10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃孵育10 min，然后在最适反应温度下测定BmAK的活性，从而分析BmAK的热稳定性。
1.10 最适反应pH和pH稳定性分析将BmAK的酶活反应体系分别设定为pH 6.5、6.75、7.0、7.25、7.50、7.75和8.0的缓冲溶液，其他保持不变，然后再按照上述测活方法在最适温度下检测BmAK活性。以BmAK的最高反应活性为100%，其他pH下活性相对最高活性作图，从而确定BmAK的最适反应pH。接下来将BmAK分别在pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲溶液中孵育10 min，然后在最适反应温度和最适反应pH下测定BmAK的活性，从而分析BmAK的pH稳定性。
2 结果与分析2.1 BmAK基因克隆与分析根据家蚕基因组数据库和PubMed数据库，以5龄3天家蚕后部丝腺组织cDNA为模板，利用设计的引物进行PCR扩增，获得长度约为1 068 bp的序列。将获得的DNA片段与pSKB2载体通过双酶切后连接，转化DH5α，首先通过菌落PCR扩增验证，然后以EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切对构建成功的质粒验证(图 1A)，最后通过基因测序进一步确认克隆构建成功。
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| 图 1 BmAK基因的克隆和分析(A：BmAK基因克隆、菌落PCR和双酶切验证；B：染色体定位；C：BmAK基因组DNA示意图；D：BmAK基因mRNA示意图) Figure 1 Cloning and analysis of BmAK. (A) 1% agar gel analysis of BmAK. M: DNA marker; 1: PCR product; 2: colony PCR product; 3: double enzyme digestion products. (B) Chromosomal localization of BmAK gene. (C) The diagram of BmAK genomic DNA sequence. (D) The diagram of BmAK mRNA sequence. ATG: start codon; TGA: stop codon; UTR: untranslated region; ORF: open reading frame. |
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BmAK基因在GenBank数据库中的登录号为692924，该基因定位于家蚕第5号染色体(图 1B)。该基因全长11 377 bp，由3个外显子和2个内含子组成(图 1C)。mRNA全长1 285 bp，其中包括一段编码1 068 bp的开放阅读编码框(ORF)，编码355个氨基酸。BmAK基因mRNA的5′末端存在一段长51 bp的非翻译区序列(5′-UTR)，3′末端包含一段长148 bp的非翻译区序列(3′-UTR)和一段由17个A组成的polyA加尾信号(图 1D)。
2006年，王华兵等利用5′ RACE法从家蚕中克隆了BmAK基因[10, 30]。该基因包含2个外显子和1个内含子，cDNA全长1 268 bp，编码355个氨基酸，GenBank登录号为DQ272299。与本文克隆的BmAK基因相比，二者在基因结构方面存在一定差异，但编码的氨基酸完全相同。这种基因结构的差异可能与家蚕的品种相关，本文采用的家蚕品种为大造，而王华兵等采用的家蚕品种为C108[10, 30]。
2.2 BmAK蛋白结构分析Protparam分析显示BmAK蛋白分子量约为40 kDa，等电点为5.87。利用在线服务器SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)分析发现BmAK蛋白包含两个典型的结构域，其中20–91位氨基酸残基组成了ATP-胍基磷酸转移酶N末端结构域，113–355位氨基酸残基组成了ATP-胍基磷酸转移酶结构域(图 2A)。利用Pubmed分析BmAK蛋白保守的结构域和关键氨基酸位点，发现BmAK属于磷酸原激酶超家族中类精氨酸激酶家族一员，其中第62–65位、67位、193位、224位、270位、272–273位、313–314位氨基酸残基被认为是与精氨酸结合的保守位点，第121位、123位、125位、184位、220位、228位、279位、281–283位、308位、310位、312–313位、323位被认为是与ADP结合的保守位点，第305–326位氨基酸残基形成了底物特异环(图 2B)。利用PSIPRED分析BmAK蛋白的结构，发现BmAK蛋白由2个显著的结构域组成，其中N末端结构域由6段短的α螺旋结构组成，C末端结构域由多段α螺旋和β片层结构组成(图 2C–D)。
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| 图 2 BmAK分析(A：结构域预测；B：保守结构域和关键氨基酸位点分析；C：预测的BmAK二级结构；D：预测的BmAK三级结构) Figure 2 Analysis of BmAK. (A) Domain prediction. (B) Analysis of the conserved domain and key amino acid residues. (C) The predicted secondary structures of BmAK. (D) The predicted tertiary structure of BmAK. |
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2.3 BmAK蛋白系统进化分析将BmAK氨基酸序列通过Pubmed提交进行BLAST分析，选取24种与BmAK序列同源的物种进行系统进化分析，结果如图 3所示。进化树分析显示，家蚕BmAK与同为鳞翅目的冬尺蠖蛾Operophtera brumata、小菜蛾Plutella xylostella的精氨酸激酶序列相似度最高，暗示了这些物种的精氨酸激酶具有相似的进化起源。序列差异最大的是斑马鱼Danio rerio、小鼠Mus musculus和智人Homo sapiens的肌酸激酶，显示了精氨酸激酶在不同物种中的进化差异。总体来看，精氨酸激酶在低等和高等生物中的序列相当保守，暗示了精氨酸激酶在低等和高等生物生命活动过程中都发挥着重要的功能。
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| 图 3 BmAK与其他物种同源蛋白的进化分析 Figure 3 Phylogenetic analysis of BmAK and AKs from other species. |
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2.4 BmAK蛋白表达纯化将克隆获得的BmAK基因与pSKB2载体连接，经双酶切和基因测序验证后，将正确构建的重组表达质粒pSKB2-BmAK转化Transetta (DE3) 表达细胞，在16 ℃和37 ℃下，分别加入0.1 mmol/L IPTG诱导含有6个组氨酸标签(6×His)的重组BmAK蛋白(6×His-BmAK，His6-BmAK)表达。SDS-PAGE显示，无论在16 ℃还是37 ℃，上清中均存在一条约为43 kDa的明显蛋白条带，表明成功表达了重组His6-BmAK蛋白，且目的蛋白主要以可溶性蛋白的表达形式存在于细胞裂解后的上清中，在沉淀中几乎看不到目的蛋白的条带(图 4A)。因此，我们选择在37 ℃下培养细胞诱导目的蛋白的表达。
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| 图 4 BmAK表达纯化(A：BmAK表达分析；B：Ni-NTA亲和层析纯化BmAK) Figure 4 Expression and purification of BmAK. (A) Analysis of BmAK expression. M: protein molecular weight marker; 1: 16 ℃ supernatant; 2: 16 ℃ pellet; 3: 37 ℃ supernatant; 4: 37 ℃ pellet. (B) Purification of BmAK via Ni-NTA affinity chromatography. M: protein molecular weight marker; 1: supernatant; 2: pellet; 3–8: elutions of 20, 40, 80, 100, 200 and 500 mmol/L imidazole. |
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在37 ℃下，加入0.1 mmol/L IPTG大规模诱导重组BmAK蛋白表达，然后在4 ℃下通过Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白，分别利用包含20–500 mmol/L咪唑浓度的缓冲溶液梯度洗脱。SDS-PAGE结果显示，大多数洗脱组分获得的目的蛋白纯度都超过了90%，其中包含500 mmol/L咪唑的缓冲溶液洗脱的目的蛋白纯度超过了98% (图 4B)。收集包含500 mmol/L咪唑的缓冲溶液洗脱的His6-BmAK蛋白，脱盐浓缩后冻存于–80 ℃。
2.5 BmAK蛋白溶液存在形式分析将纯化的BmAK蛋白通过凝胶过滤层析柱分析BmAK在溶液中的存在形式，结果如图 5A所示。BmAK流经Superdex 200 10/300 GL凝胶层析柱，显示为一个单一锐利的对称峰形。SDS-PAGE结果显示，该峰代表的为重组His6-BmAK蛋白(图 5B)。根据图 5A的洗脱体积，可以推算出重组His6-BmAK在溶液中的分子量约为43 kDa，表明重组表达的His6-BmAK蛋白在溶液中主要以单体的形式存在。
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| 图 5 BmAK在溶液中的存在形式分析(A：凝胶过滤层析分析；B：SDS-PAGE分析洗脱物) Figure 5 Analysis of the existing form of BmAK in Solution. (A) Gel filtration analysis. (B) SDS-PAGE analysis of the elution. |
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2.6 BmAK蛋白二级结构分析通过圆二色光谱法分析BmAK蛋白的二级结构，结果显示，BmAK蛋白的圆二色光谱在约208 nm和222 nm处具有两个明显的负峰，在约192 nm处具有一个明显的正峰(图 6A)，表明获得的重组BmAK蛋白含有一定的α螺旋结构，这与之前BmAK蛋白结构预测的结果基本一致。利用软件Biokine v4.74可以计算出BmAK中α螺旋、β折叠链和无规则卷曲结构的含量分别约为32%、8%和60%，因此BmAK的圆二色光谱图显示出α螺旋结构的特征峰，β折叠链和无规则卷曲结构的特征峰在圆二色光谱图中表现不明显。
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| 图 6 BmAK二级结构分析(A：圆二色光谱分析BmAK二级结构；B：圆二色光谱分析pH对BmAK二级结构的影响；C：θ222分析pH对BmAK蛋白α螺旋结构的影响) Figure 6 Analysis of BmAK secondary structures. (A) Analysis of the secondary structure of BmAK by circular dichroism spectroscopy. (B) Analysis of the effects of pH on the secondary structures of BmAK by circular dichroism spectroscopy. (C) Analysis of the effects of pH on the α-helix structures of BmAK by θ222. |
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利用圆二色光谱法进一步分析不同pH的缓冲溶液对BmAK蛋白二级结构的影响，结果如图 6B所示。从图中可以看出，随着pH值的改变，BmAK圆二色光谱图中α螺旋结构的特征峰发生了显著的改变。由于β折叠链和无规则卷曲结构的特征峰在BmAK的圆二色光谱图中表现不明显，因此，直接利用圆二色光谱研究pH对BmAK蛋白中β折叠链和无规则卷曲结构的影响较为困难，但这并非意味着pH值的改变不会影响β折叠链和无规则卷曲结构。本文以222 nm处的椭圆度值θ222来表征BmAK的α螺旋结构，以θ222对不同的pH作图，从而反映pH对BmAK蛋白α螺旋结构的影响(图 6C)。结果显示，θ222在pH 5–10的缓冲溶液中变化不大，表明在pH 5–10的缓冲溶液中，BmAK蛋白的α螺旋结构含量相对稳定，基本不受pH变化的影响。当pH < 5时，随着pH的下降，θ222值升高，指示BmAK蛋白的α螺旋结构受pH影响，逐渐减少；当pH > 10时，随着pH的升高，θ222值快速升高，表明在碱性条件下，进一步升高溶液pH，诱导了BmAK蛋白的α螺旋结构迅速减少。
2.7 最适反应温度和热稳定性在不同的温度下分别检测BmAK活性，从而测定其最适反应温度，结果如图 7A所示。结果显示，大约30 ℃时BmAK的活性最高。当温度低于30 ℃时，随着温度的升高，BmAK的活性快速升高，表明温度促进了BmAK催化反应的进行；当温度高于30 ℃时，随着温度的升高，BmAK的活性逐渐下降，直至80 ℃时活性降低至最高活性的约5%左右。升高温度一方面可以加速BmAK催化反应的进行，另一方面也可能引起BmAK构象发生变化从而导致活性丧失。从30 ℃升高温度到80 ℃的过程中，高温导致的失活效应要比其促进效应显著，从而导致了BmAK催化活性的下降。因此，BmAK的最适反应温度约为30 ℃。
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| 图 7 最适反应温度和热稳定性分析(A：BmAK的最适反应温度分析；B：BmAK的热稳定性分析) Figure 7 Analysis of the optimum temperature and thermostability. (A) Analysis of the optimum temperature of BmAK. (B) Analysis of the thermostability of BmAK. |
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将BmAK在不同的温度下孵育10 min，然后在最适温度下检测其活性，从而分析BmAK的热稳定性，结果如图 7B所示。25 ℃时BmAK的活性最高，其次是20 ℃和30 ℃，分别约为最高活性的99.52%和98.96%。15 ℃时BmAK的活性约为最高活性的98.32%，5 ℃时BmAK的活性约为最高活性的87.94%，35 ℃和40 ℃时BmAK的活性约为最高活性的95%。当温度升高到50 ℃时，BmAK的活性迅速降至其最高活性的70%左右。在5–25 ℃温度范围内，BmAK蛋白的结构相对稳定，逐渐升高温度可以促进BmAK催化反应的进行，因此在25 ℃时BmAK的活性达到最大值；当温度超过25 ℃时，进一步升高温度会引起BmAK的结构变化，从而导致其活性下降。总体来看，在15–30 ℃的范围内，BmAK的活性变化不大，表明其结构在此温度区间相对稳定。
2.8 最适反应pH和pH稳定性在不同pH的溶液中分别检测BmAK的活性，从而测定BmAK的最适反应pH，结果如图 8A所示。pH 7.5时，BmAK的活性最高；pH 6.5时，其活性仅为最高活性的约25%。随着pH值逐渐从6.5升高到7.5，BmAK的活性逐渐升高；当进一步升高pH到8.0时，BmAK的活性降至最高活性的约65%。这些结果表明，BmAK的最适反应pH为7.5。
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| 图 8 最适反应pH和pH稳定性分析(A：BmAK的最适反应pH分析；B：BmAK的pH稳定性分析) Figure 8 Analysis of the optimum pH and pH stability. (A) Analysis of the optimum pH of BmAK. (B) Analysis of the pH stability of BmAK. |
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将BmAK在不同pH的缓冲溶液中孵育10 min，然后在pH 7.5和30 ℃下分别检测其活性，从而分析BmAK在不同pH下的稳定性，结果如图 8B所示。在pH 7.0，BmAK具有最高的活性；pH 6.0时其活性约为最高活性的30%；随着pH从7.0升高到8.0，BmAK的活性快速下降至其最高活性的约50%，进一步增加pH到11.0，BmAK的活性持续下降至其最高活性的约15%。这些结果表明，pH对BmAK的结构具有一定的影响。在pH 7.0左右，BmAK的结构相对稳定。
3 讨论精氨酸激酶是无脊椎动物体内一类重要的磷酸原激酶，在能量代谢、贮藏和利用方面发挥关键的调控作用。AK在不同的组织中均有表达，但在能量需求较高的组织中表达尤其显著[10-14, 31-32]。昆虫是自然界种类和数量最多的无脊椎动物，具有重要的经济和科学研究价值。AK是参与昆虫能量代谢的关键酶。除参与昆虫肌肉能量供应，AK还与昆虫的发育、繁殖、运动、免疫和抗性等密切有关。当前，AK的研究主要集中在贝类、虾、螃蟹、海参等动物和锥体虫、线虫等寄生虫。昆虫AK的研究主要围绕其cDNA序列特征[10]、时空表达特征[9-10, 12-14, 21-29, 31]、生长发育调控[11]、免疫应答[4, 8, 15]和环境适应[33]等问题，关于其分子结构和酶学性质则很少涉及[24, 34-35]。
本研究从5龄3天家蚕后部丝腺组织中克隆获得了BmAK ORF序列，分析了BmAK基因的染色体定位、基因组DNA结构、mRNA结构及其蛋白二级和三级结构。BmAK包含两个保守的结构域，ATP-胍基磷酸转移酶N末端结构域和ATP-胍基磷酸转移酶结构域，其中N末端结构域由6段短α螺旋结构组成，ATP-胍基磷酸转移酶结构域由多股α螺旋结构包裹的β片层结构组成。BmAK具有精氨酸激酶共有的活性中心序列CPTNLGT及关键的D61和R192残基[36-37]，与其他昆虫AK的氨基酸序列高度相似，与脊椎动物肌酸激酶的序列也具有较高的同源性，暗示了它们在体内可能对能量代谢具有相似的调控功能。
原核表达分析显示，BmAK主要在上清中以可溶性蛋白的形式表达，暗示了其可能折叠形成了正确的空间结构。酶分子折叠形成正确的空间构象对于其催化活性至关重要。酶学活性检测显示重组表达的BmAK具有良好的催化活性。凝胶过滤层析分析揭示了重组表达的BmAK在溶液中以单体结构的形式存在，这与大多数昆虫AK的结构一致[38]。圆二色光谱分析表明，BmAK蛋白包含有α螺旋结构，证实了之前生物信息学预测的结果，同时也表明重组表达的BmAK可以折叠形成正确的空间构象。BmAK酶活的最适温度为30 ℃，最适pH为7.5，这与家蚕最适饲育温度22–28 ℃基本一致。在15–30 ℃范围内，BmAK的活性变化不大(图 7B)，表明在此温度区间BmAK的结构相对稳定；同时，作为家蚕体内与能量代谢相关的关键酶，BmAK的酶学活性可能不会影响家蚕在15–30 ℃范围内的生命活动。对比pH对BmAK二级结构(图 6B)和酶学活性(图 8B)的影响，可以发现在pH 5–10范围内BmAK的二级结构并没有发生显著的改变，但BmAK的酶学活性则改变了很多，表明在酶分子的结构发生明显改变之前，其活性中心的构象已经发生了显著的变化，这与邹承鲁先生之前提出的著名论断“酶活性部位构象变化发生在整体构象变化之前”一致[39]。
根据蛋白分子量和结构，精氨酸激酶一般被分为3类：单亚基、双亚基和四亚基[22]。昆虫AK多属于单亚基精氨酸激酶，海参AK属于双亚基精氨酸激酶。海参AK的N末端序列和W218、W208残基对其结构稳定性和酶学活性具有至关重要的作用[40]。金属离子对AK的催化反应非常关键，不同的离子种类对不同物种的AK作用机制也不相同。Mn2+和Mg2+对蝗虫AK[16]和龙虾AK[41]的酶活具有激活效应，而Zn2+和Cu2+则对蝗虫AK的酶活具有抑制作用[16]。Mn2+和Cu2+可以完全抑制凡纳滨对虾AK的酶活。这些发现表明尽管精氨酸激酶在进化过程中氨基酸序列高度保守，但不同的生活环境可能也对不同物种来源的AK蛋白结构和酶学活性产生一定的影响。
本研究克隆了家蚕BmAK基因，并成功获得了可溶的、具有酶学活性的BmAK蛋白，对其蛋白结构和酶学性质开展了初步的研究，为深入研究其活性位点构象、关键氨基酸残基、激活剂和抑制剂等建立了基础。AK是无脊椎动物包括鳞翅目昆虫特有的能量代谢相关的关键酶。多数的农林害虫属于鳞翅目昆虫。家蚕是鳞翅目昆虫研究的模式动物。因此，深入研究BmAK的结构和酶学性质，有助于揭示AK在鳞翅目昆虫体内的生理功能和调控机制，从而在此基础上筛选AK酶活性抑制剂，开发以AK为害虫防控分子靶标的绿色安全环保的新型杀虫剂。
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