, 周焕斌11 中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193;
2 四川大学 生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室, 四川 成都 610065
收稿日期：2017-04-25;接收日期：2017-08-28; 网络出版时间：2017-09-06 基金项目：中国农业科学院科技创新工程和植物病虫害国家重点实验室开放基金资助
作者简介：周焕斌??中国农业科学院植物保护研究所研究员, 博士生导师。主要从事各种不同用途基因组定点编辑技术在水稻等主要农作物的研发与应用, 借助其深度探讨水稻与病原菌互作的分子机制, 发掘重要基因资源, 并加以组合修饰, 获得无生物安全风险的基因编辑材料, 服务于农业生产。已在Cell Host & Microbe、Nuleic Acids Research、Plant J、Mol Plant Microbe Interact等SCI杂志上发表文章10篇, 被引用达600多次
摘要：对基于rBE3（Rice base editor）和rBE4碱基编辑系统创制获得OsSERK1（D428N）和pi-ta（S918F）等基因的单碱基编辑突变体材料进行编辑特异性和遗传稳定性分析，旨在全面了解和更好地利用该碱基编辑系统。首先对OsSERK1（D428N）和pi-ta（S918F） sgRNA的潜在脱靶位点进行预测，并对T0代材料中的各脱靶位点进行PCR扩增和Sanger测序检测；同时对该两个基因的突变体材料自交获得的T1代植株的靶位点序列和外源T-DNA分离进行检测。结果显示各T0代材料均未检测到潜在脱靶位点发生单碱基编辑；此外，OsSERK1（D428N）和Os08g07774含有相同的sgRNA位点，且两个位点均能发生单碱基编辑；rBE3或rBE4系统介导产生的碱基编辑可稳定遗传至T1代，并在T1代可获得无外源T-DNA的纯合突变体。上述结果表明由rBE3或rBE4介导的碱基编辑具有较高的特异性，可进行多位点编辑，引入的碱基替换可稳定遗传至后代。
关键词：CRISPR/Cas9n 大鼠胞苷脱氨酶 脱靶效率 T-DNA分离 水稻
Specificity and inheritance of rBE3 and rBE4 endonuclease-induced gene modifications in rice
Bin Ren1,2*, Fang Yan1*, Yongjie Kuang1, Na Li1, Dawei Zhang2, Honghui Lin2
, Huanbin Zhou1 1 State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
2 Ministry of Education Key Laboratory of Bio-Resource and Eco-Environment, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, Sichuan, China
Received: April 25, 2017; Accepted: August 28, 2017; Published: September 6, 2017
Supported by: The Agricultural Science and Technology Innovation Program of The Chinese Academy of Agricultural Sciences and Open Project of State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection
Corresponding author:Honghui Lin.Tel:+86-28-85411792;Fax:+86-28-85415300;E-mail:hhlin@scu.edu.cn
Huanbin Zhou.Tel:+86-10-62815914;Fax:+86-10-62894642;E-mail:hbzhou@ippcaas.cn
*These authors contributed equally to this work
Abstract: To gain more insights into the rice base editor (rBE3 and rBE4), we evaluated the mutation efficiency, off-target and inheritance of OsSERK1(D428N) and pi-ta(S918F) genes modified with rBE endonucleases. We predicted and analyzed the putative off-target sites of the sgRNA designed for OsSERK1(D428N) and pi-ta(S918F) by PCR amplification and Sanger sequencing. Then we further characterized the inheritance and stability of targeted base mutations and T-DNA segregation in the progeny of the self-fertilized T0 plants. Analysis of the DNA sequencing data of T0 plants of OsSERK1(D428N) revealed no nucleotide change at any of the four potential off-target sites. For OsSERK1(D428N) and Os08g07774 carry the same sgRNA targeting sites, base substitution at both two loci were detected at a frequency of 41.67%. The targeted base mutations could be transmitted readily to T1 progeny. Furthermore, genetic segregation caused the loss of T-DNA at a frequency between 25.0% and 40.9% in the T1 transgenic plants of OsSERK1(D428N) and pi-ta(S918F). These results demonstrated that the rBE3 and rBE4 systems could mediate specifically targeted base editing in one-or multi-site, and the targeted base editing could be stably inherited to next generation.
Key words: CRISPR/Cas9n rat APOBEC1 off-target T-DNA segregation rice
近年来，基因组定点编辑技术作为一种重要技术手段在植物学研究和作物品种改良中得到了广泛应用。目前，植物基因组定点编辑技术主要是利用CRISPR/Cas9等系统在目标基因组靶位点处引入DNA双链断裂，再经非同源末端连接(Non-homologous end Joining，NHEJ)机制修复后在切割位点产生数个核苷酸的缺失或插入，进而导致所在靶位点基因的阅读框移码使得靶基因功能丧失[1-2]。除了常见的在特定基因组靶位点处引入核苷酸缺失或插入，对基因组靶位点特定碱基进行定向编辑也已成为基因编辑领域的难点和热点。对基因组靶位点特定碱基进行定向编辑，可实现靶基因定向功能激活或者丧失，这对于研究基因功能研究和作物品种改良具有重要作用。利用植物细胞内基因组DNA修复途径的同源重组(Homologous recombination，HR)或非同源末端连接机制，研究人员已经成功地在水稻中实现了靶基因的定点插入和基因矫正[3-4]。然而，较低的基因编辑效率限制了其广泛的使用。因此，对植物基因组特定碱基进行定向改造以得到基因功能获得性突变体仍然具有一定的挑战性。2016年，在哺乳动物细胞中，基于由Cas9n切口酶、大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂UGI组成的融合蛋白(即碱基编辑器，Base editor 3，BE3) 和sgRNA的引导成功对靶标基因实现了单碱基编辑[5]，这为单碱基编辑技术的发展提供了全新的思路。其原理为sgRNA引导碱基编辑器结合到基因组靶位点，胞嘧啶脱氨酶将活性窗口内的胞嘧啶碱基(C)向胸腺嘧啶碱基(T)或鸟嘌呤碱基(G)、腺嘌呤碱基(A)转换，尤其是当UGI存在时，胞嘧啶碱基对向胸腺嘧啶转换具有一定的偏好性。此后，科研人员很快将此技术应用到植物中，利用APOBEC1-Cas9n-UGI组成的编辑编辑器BE3相继在水稻、小麦、玉米、拟南芥和番茄中实现了单碱基编辑，获得了相应突变体材料[6-11]。然而，对BE3介导的植物单碱基编辑的脱靶效应、遗传稳定性等尚未见报道。因此，本课题组对前期基于rBE3 (APOBEC1-Cas9n-UGI，PAM序列为NGG)和rBE4 (APOBEC1-Cas9n (VQR)-UGI，PAM序列为NGA[12-13]等)而创制的水稻单碱基编辑突变体进行了脱靶效应和遗传稳定性等的检测，旨在全面地了解并更好地应用该技术。
1 材料与方法1.1 材料OsSERK1(D428N) 和pi-ta(S918F) 等基因的单碱基编辑T0代和T1代突变体材料，均由本实验室以水稻品种Kitaake为背景材料分别利用rBE3或rBE4碱基编辑系统创制获得[8]，均种植在玻璃温室中。CTAB购自北京睿恒均安科技有限公司，无水乙醇、氯仿和异丙醇等常规化学试剂(分析纯)均购自国药集团，I-5TM 2× High-Fidelity Master Mix购自克劳宁(北京)生物科技有限公司，2× Tsingke Master Mix购自北京擎科新业生物技术有限公司。试验所用引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。
1.2 方法1.2.1 潜在脱靶位点的预测分析将各基因的靶位点sgRNA序列在http://rice.plantbiology.msu.edu/standalone_blast.shtml网站上进行Blastn比对(Expect Threshold设为1 000，其余参数为默认设置)，在比对获得相似序列中，选择其3′端含有PAM序列(NGG或NGA)且PAM序列前20个左右的碱基与靶位点sgRNA序列相似性较高的位点作为潜在的脱靶位点。
1.2.2 水稻基因组DNA的提取参考Porebski等的方法[14]，采用CTAB法提取水稻叶片的基因组DNA。具体操作为：剪取的水稻幼苗叶片经全自动样品快速研磨仪研磨(60 Hz，60 s)后，加入600 μL 2× CTAB提取液(含0.1% β-巯基乙醇)后振荡混匀，65 ℃水浴裂解45 min；加入500 μL氯仿抽提，14 000 r/min室温离心10 min；离心后取上清液400 μL于离心管，加入400 μL异丙醇，颠倒混匀后置于–20 ℃中沉淀30 min；14 000 r/min离心10 min后弃上清液，白色DNA沉淀经70%乙醇洗涤风干后加入30 μL ddH2O溶解。DNA溶液置于–20 ℃保存备用。
1.2.3 碱基编辑位点及潜在脱靶位点的检测以水稻突变体DNA为模板，利用特异引物(见表 1) 对各编辑位点及潜在脱靶位点的两侧序列进行PCR扩增。PCR扩增体系为：I-5TM 2× High-Fidelity Master Mix 25 μL，引物F/R (10 μmol/L)各2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 20 μL。PCR扩增程序为：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，循环34次；72 ℃延伸5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后直接委托北京擎科新业生物技术有限公司进行Sanger测序，分析其碱基编辑类型。
表 1 文中所用到的引物及其序列Table 1 List of oligonucleotides used in this study
| Primer name | Primer sequence (5'–3') |
| OsSERK1-F2 | GCGTTTACGAGGGTTCTGTA |
| OsSERK1-R2 | TATGCCCAATTGTTCCACGAA |
| Os08g07774-F1 | TAGAACGGCCGCCATATGAA |
| Os08g07774-R1 | GGCTAGACGAGCAAGGTCAA |
| Os08g07890-F1 | TTCTACAGAACGGCCACCAT |
| Os08g07890-R1 | TATCCTCATCTCTGGCACGG |
| Os08g07890-F2 | TGCGTTTACGTGGGTTCTGT |
| Os08g07890-R2 | CATGACACCCTCACCTCTGG |
| Os06g12110-F1 | GCCTTGAGACACGCTTACGA |
| Os06g12110-R1 | CCCAATCATGCACTCTGGCA |
| Os06g12120-F1 | ACCCAATCATGCACTCTGGC |
| Os06g12120-R1 | TGACTGGCCAACACGAAGAA |
| pi-ta-F1 | CTGCAATTCGCAAGCATC |
| pi-ta-R1 | CACCTTTCGTTCTTTGATCC |
| HptII-F1 | CGGAAGTGCTTGACATTG |
| HptII-R1 | GACCTCGTATTGGGAATCC |
| Cas9-F1 | GGGTAATGAACTCGCTCTGC |
| Cas9-R1 | TGGCGTCAAGAACTTCCTTTG |
表选项
1.2.4 无外源T-DNA元件突变体的鉴定选择发生碱基编辑事件的T0代植株单株自交结实获得T1种子，并将其播种成苗后提取叶片基因组DNA。以T1代植株DNA为模板，分别利用T-DNA上的潮霉素特异引物HhtII-F1/R1和Cas9特异引物Cas9-F1/R1 (见表 1) 对T-DNA的有无进行两轮PCR检测。PCR扩增体系为：2× Tsingke Master Mix 5 μL，引物F/R (10 μmol/L)各0.2 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O补齐至10 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环25次；72 ℃延伸5 min。PCR产物利用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
2 结果与分析2.1 rBE3介导的多位点单碱基编辑在创制OsSERK1(D428N) 突变体材料过程中，对其sgRNA (CCAAAGATTATCCATCGTGA TGT，下划线为PAM序列NGG)的特异性进行了评估，通过在水稻基因组数据库中进行Blastn比对分析，检索到基因Os08g07774中也含有该sgRNA序列，即通过该sgRNA可能同时对这两个基因的靶位点碱基进行编辑。因此，通过设计特异引物对OsSERK1(D428N) 突变体材料中基因Os08g07774的靶位点进行了PCR扩增和Sanger测序。结果显示在12株OsSERK1(D428N) T0代突变体材料中，检测到了5株材料在基因Os08g07774的靶位点处发生了预期的碱基编辑事件。其中，突变体#419的OsSERK1(D428N) 和Os08g07774的靶位点碱基编辑方式均为G-16 > A/WT (杂合突变，WT为野生型)；突变体#417的OsSERK1(D428N) 靶位点发生杂合突变(G-16 > A/WT)，而Os08g07774靶位点则为纯合突变(G-14TG-16 > ATA) (见图 1和表 2)。此外在Os08g07774靶位点处还检测到2株材料发生Indel (插入或缺失)现象(见表 2)。
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| 图 1 OsSERK1(D428N) T0代突变体#419和#417的两个靶位点的测序结果 Figure 1 Sanger sequencing chromatogram of OsSERK1(D428N) T0 rice line #419 and #417. The PAM sequences are in green, putative target bases in the activity window in red; nucleotide mutations are underlined in sequencing chromatograms. |
| 图选项 |
表 2 OsSERK1(D428N) T0代突变体多位点碱基编辑和脱靶检测Table 2 Multiple target-base editing and off-target detections of OsSERK1(D428N) T0 rice lines
| T0代株系 | 具相同gRNA位点(多位点编辑) | 预测的脱靶位点 | ||||||
| SERK1(Os08g07760) | Os08g07774 | Os08g07890-1 | Os08g07890-2 | Os06g12110 | Os06g12120 | |||
| #417 | CAC-TAC/WT | CAC-TAT (纯合) | WT | WT | WT | WT | ||
| #418 | CAC-TAC/WT | CAC-TAC/WT | WT | WT | WT | WT | ||
| #419 | CAC-TAC/WT | CAC-TAC/WT | WT | WT | WT | WT | ||
| #421 | CAC-TAC/WT | CAC-TAC/WT | WT | WT | WT | WT | ||
| #428 | CAC-TAC (纯合) | -21/WT | WT | WT | WT | WT | ||
| #430 | GAC-TAC/WT | WT | WT | WT | WT | WT | ||
| #724 | CAC-TAC/WT | WT | WT | WT | WT | WT | ||
| #736 | CAC-TAC/WT | -8/WT | WT | WT | WT | WT | ||
| #805 | CAC-TAC/WT | CAC-TAT/WT | WT | WT | WT | WT | ||
| #811 | CAC-TAC/WT | WT | WT | WT | WT | WT | ||
| #828 | CAC-AAC/WT | WT | WT | WT | WT | WT | ||
| #927 | CAC-TAC/WT | WT | WT | WT | WT | WT | ||
表选项
2.2 rBE3介导的单碱基编辑脱靶分析将OsSERK1(D428N) 的靶位点sgRNA序列(CCAAAGATTATCCATCG TGATGT，下划线为PAM序列NGG)对水稻全基因组序列进行比对，获得5个潜在脱靶位点，其中Os05g44290中的相似位点其5′端(GCA)不存在PAM序列NGG，故排除其为潜在脱靶位点的可能性；而其余4个位点均可能为脱靶位点(图 2)。因此分别对这4个潜在脱靶位点设计特异引物，并以OsSERK1(D428N) T0代突变体材料的DNA为模板进行PCR扩增和测序，在检测的12株突变体材料中，均未检测到潜在脱靶位点发生碱基编辑(表 2)。将pi-ta(S918F) 的靶位点sgRNA序列(CTTCTATGCATCTTCAACCTGAC，下划线为PAM序列NGAC)与水稻全基因组序列进行比对分析，结果显示未检索出与其靶位点sgRNA相似的序列，即该sgRNA将特异地引导pi-ta(S918F) 的靶位点碱基编辑，不存在潜在脱靶位点。
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| 图 2 预测的潜在脱靶位点序列和靶位点序列比对分析 Figure 2 Sequencing comparative analysis between the putative off-target and target sites. The PAM sequences are in green, putative target bases in the activity window in red, mismatching bases in blue and insert bases in black and boldface. |
| 图选项 |
2.3 单碱基编辑突变体的遗传稳定性分析为了检测由rBE3/sgRNA和rBE4/sgRNA介导产生的碱基编辑能否稳定遗传至后代，将单碱基编辑突变体OsSERK1(D428N) #805 (CAC > TAC/WT)和pi-ta(S918F) #22 (C > T/WT)经自交获得的T1代种子播种成苗并对各单株的靶位点进行了PCR扩增和Sanger测序分析。结果显示，在两个突变体材料的T1代植株中检测出单碱基编辑事件，同时还存在纯合突变(图 3)。在检测的22株OsSERK1(D428N) #805 T1代植株中野生型(WT):杂合突变体(WT/CAC > TAC):纯合突变体(CAC > TAC)分离比为4:12:6 (χ2=0.545 4 < χ0.052=5.991)，36株pi-ta(S918F) #22 T1代植株中野生型(WT):杂合突变体(WT/C > T):纯合突变体(C > T)分离比为13:14:9 (χ2=2.667 < χ0.052=5.991)，均符合孟德尔定律的自由分离比1:2:1。上述结果表明由rBE3/sgRNA和rBE4/sgRNA介导产生的碱基编辑能够稳定遗传至后代。
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| 图 3 OsSERK1(D428N)#805 (左)和pi-ta(S918F) #22 (右)突变体的T1代植株的靶位点测序结果 Figure 3 Sanger sequencing chromatogram of OsSERK1(D428N) #805 (left) and pi-ta(S918F) #22 (right) in T1 progeny. Nucleotide mutations are underlined in sequencing chromatograms. |
| 图选项 |
2.4 单碱基编辑突变体后代外源T-DNA元件分离为进一步获得无外源T-DNA插入元件的单碱基编辑突变体，利用引物HptII-F1/R1和Cas9-F1/R1对OsSERK1(D428N) #805和pi-ta(S918F) #22的T1植株进行两轮PCR检测。结果显示在T1代植株中筛选获得了无外源T-DNA的材料(图 4)。在22株OsSERK1(D428N) #805 T1代植株中检测出9株不含外源T-DNA，其中包含3株纯合突变体和4株杂合突变体。在36株pi-ta(S918F) #22 T1代植株中检测出9株不含外源T-DNA，其中仅包含2株杂合突变体。这表明在通过农杆菌导入的外源T-DNA元件可以从突变体T1代中分离出去并可获得无外源DNA片段的单碱基编辑突变体材料。
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| 图 4 OsSERK1(D428N) #805 (A)和pi-ta(S918F) #22 (B)突变体的T1代植株中潮霉素HptII和Cas9基因检测 Figure 4 PCR-detection of transgenes (HptII and Cas9) in T1 progeny of OsSERK1(D428N) #805 (A) and pi-ta(S918F) #22 (B). M: DNA marker; T0: OsSERK1(D428N) #805 or pi-ta(S918F)#22 T0 line; Kit: Kitaake; 1–15: T1 progenies of OsSERK1(D428N) #805 or pi-ta(S918F) #22. |
| 图选项 |
3 讨论CRISPR/Cas9技术是近年来发展起来的一种简单、快速、高效的对基因定点编辑技术，广泛应用于微生物和动植物中[15-20]，其常见编辑类型有基因定点插入[21]、DNA片段缺失[22-23]、多位点突变[23-24]等，但对于实现单碱基编辑仍是难点且对其编辑的特异性和稳定性缺乏了解。本课题组前期研究中将水稻密码子优化的APOBEC1和UGI与Cas9n、Cas9n (VQR)融合构建了一套新的rBE3、rBE4系统，实现了在水稻基因组DNA中的单碱基编辑[8]，本研究对该系统单碱基编辑的脱靶现象和稳定遗传性进行了研究。
本研究选择了OsSERK1(D428N) (rBE3) 和pi-ta(S918F) (rBE4) 两个突变体材料进行脱靶分析，通过在水稻基因组数据库中将sgRNA进行Blastn比对分析发现pi-ta(S918F) 的sgRNA具有较好的特异性，并没有发现潜在的脱靶位点；而OsSERK1(D428N) 的sgRNA序列不仅与Os08g07774一致，而且还具有其他的潜在脱靶位点，我们通过Sanger测序发现，在OsSERK1(D428N) 的12株T0代突变体植株中，有41.67%的植株实现了双位点的单碱基编辑，但并没有检测到脱靶现象的发生。由于碱基编辑系统主要用来编辑一些具有重要功能的关键碱基，在设计sgRNA引物时的可选区域很受限制，因此可能会导致所用sgRNA的特异性差和编辑效率低的问题。同时rBE系统引入的碱基编辑多为杂合突变，即基因组仍会存在野生型序列。因此对于本研究中OsSERK1(D428N) 突变体在非目的区域Os08g07774处同时发生的碱基编辑的情况，经T0代突变体自交分离后，在其后代中已成功筛选获得仅含有OsSERK1(D428N) 突变的植株(数据未显示)。本研究中通过将sgRNA序列在水稻基因组数据库中进行Blastn检索潜在脱靶位点、PCR扩增和Sanger测序对T0代突变体材料的潜在脱靶位点进行分析，结果虽未检测出脱靶现象的发生，但由于仅进行Blastn检索可能会遗漏其他可能相似的潜在脱靶位点和PCR扩增会使以低频率嵌合体存在的脱靶突变进一步稀释导致检测不到脱靶发生，因此后期如果该材料进一步用于遗传育种时将会在全基因组层面进行脱靶检测。Kim等[25]利用Digenome-Seq技术对单碱基编辑系统(BE3) 在人HEK293T细胞系中的脱靶效应进行了研究，发现BE3系统的脱靶位点远少于CRISPR/Cas9系统，具有很高的特异性。此外，对于相同sgRNA和脱靶导致的非目的位点突变还可通过与亲本多次回交的方法进行去除。这些结果表明rBE系统可以利用特异性的sgRNA产生特定碱基编辑的突变体材料。有趣的是，仅有2株OsSERK1(D428N) T0代突变体材料在Os08g07774基因中检测到了Indel事件的发生，这与Yuan等[9]研究类似，同时Lu等[6]研究表明BE3在植物出现Indel事件的几率(10%)高于动物细胞。Indel事件可能是由于细胞内基因组DNA修复途径造成。Cas9n可以切割基因组DNA使其出现nicks，而sgRNA通常编辑DNA的一条链，而另一条链并没有参与到基因编辑，但是在后续的DNA修复机制会同时对两条DNA链进行修复，这个修复过程可能会造成Indel事件的发生。这一事件的发生机制是否与靶位点区域内外的序列有关暂时还不清楚。
相对于目前广泛的基因功能缺失突变体材料的定制应用，基因功能获得性突变体材料的创制也具有重要意义。rBE系统所利用的单碱基编辑为植物基因功能获得性突变体材料的定制提供了新的方向。因此，rBE系统的编辑事件是否能够稳定遗传尤其重要。研究发现，OsSERK1(D428N) 和pi-ta(S918F) T0代植株自交后可以在T1代中分离出无T-DNA的纯合突变体植株，这也表明利用rBE单碱基编辑系统产生的突变性状可以稳定遗传给后代。
本研究结果显示rBE系统可以利用特异性的sgRNA产生特定碱基突变的突变体材料，同时还可实现多位点突变，产生的碱基突变也能稳定地遗传给后代，表明rBE系统可以被用于定制基因功能获得型水稻材料，对水稻基因的功能学研究具有巨大推动作用。
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