朱德旋1, 杜春梅1,2
, 董锡文1,2, 薛春梅1,2, 王瑞1 1. 佳木斯大学生命科学学院, 黑龙江 佳木斯 154007;
2. 佳木斯大学应用微生物研究所, 黑龙江 佳木斯 154007
收稿日期：2019-11-05；修回日期：2020-01-06；网络出版日期：2020-05-29
基金项目：佳木斯大学校长创新创业基金(XZYF2019-29)；北药与功能食品特色学科建设项目(2017)；黑龙江省自然科学基金(C2017064)
*通信作者：杜春梅, Tel/Fax:+86-454-8603986, E-mail:dcm_037@163.com;
董锡文, Tel/Fax:+86-454-8617776, E-mail:dongxiwen@126.com.
摘要：[目的] 从北方寒地种植的不同农作物根际土壤中分离高效解磷的细菌，为微生物制剂和磷肥的开发提供适于本地区的优良菌种。[方法] 通过初筛和复筛从26株解磷菌中筛选获得一株高效解磷细菌，对其进行生理生化和分子生物学鉴定，同时采用钼蓝比色法测定解磷能力。采用平板对峙法测定拮抗植物病原菌能力。[结果] 通过筛选后获得的菌株B51-7经鉴定为伯克霍尔德菌属。菌株在发酵液中可溶性磷含量最高达到832.74 mg/L，同时具有很强的广谱抑菌作用，抑菌率最高为89.71%，可以显著促进水稻生长。[结论] 菌株B51-7是一株具有生物防治作用的高效解磷细菌，可应用于生物菌肥和生防制剂中。
关键词：寒地解磷菌植物病原菌拮抗作用
Identification and antagonism activity of an inorganic phosphorus-dissolving bacterial strain isolated from cold region
Dexuan Zhu1, Chunmei Du1,2
, Xiwen Dong1,2, Chunmei Xue1,2, Rui Wang1 1. College of Life Sciences, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China;
2. Institute of Applied Microbiology, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China
Received: 5 November 2019; Revised: 6 January 2020; Published online: 29 May 2020
*Corresponding author: Chunmei Du, Tel/Fax:+86-454-8603986, E-mail:dcm_037@163.com;
Xiwen Dong, Tel/Fax:+86-454-8617776, E-mail:dongxiwen@126.com.
Foundation item: Supported by the Jiamusi University President Innovation and Entrepreneurship Fund Project (XZYF2019-29), by the Northern Medicine and Functional Food Specialty Discipline Construction Project (2017) and by the Heilongjiang Provincial Natural Science Foundation Project (C2017064)
Abstract: [Objective] In order to find strains suitable for the development of biocontrol agents and biophosphate fertilizer, bacteria with high phosphorus-dissolving efficiency were isolated from the rhizosphere soils of different crops planted in the cold region of north China. [Methods] A highly effective phosphorous-dissolving bacterium was obtained from 26 bacterial strains with phosphorous-dissolving activity through preliminary and second screening. The bacterial strain was identified through physiological, biochemical and molecular biological methods, and its phosphorus-dissolving activity was tested by molybdenum blue colorimetry method. Meanwhile, the antagonism activity to several plant pathogens was determined by plate confrontation method. [Results] Strain B51-7 was obtained by the screening and identified as Burkholderia sp.. The soluble phosphorus content of the strain B51-7 in the fermentation broth reached 832.7 mg/L. Meanwhile, this strain had a broad-spectrum antifungal activity with the highest antagonism rate of 89.71%. A pot experiment showed that the growth of rice was significantly promoted by inoculation of strain B51-7. [Conclusion] Strain B51-7 was a highly effective phosphate-dissolving bacterium with biological control effect, and could be applied for making biological fertilizers and biocontrol agents.
Keywords: cold regionphosphorus bacteriaplant pathogensantagonism activity
磷是植物生长发育的必需元素，主要从土壤中获取，是植物体内很多重要化合物的组成成分，参与细胞的物质代谢、能量代谢、信号传递等，是农业生产的重要物质保障[1-3]。由于土壤固磷作用的普遍存在，可溶性磷肥的利用效率很低，大部分磷肥作为无效态(难溶态)在土壤中积累，提高土壤中磷的利用率成为广大研究者的热点课题之一[4]。研究表明，土壤中存在着一些微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的状态，这些微生物称为解磷菌[5]。土壤中解磷菌的存在，能够显著地增加土壤肥力，增强土壤供磷能力，提高作物对磷的吸收量和根系活力，改善作物生物量和产量[6-7]。此外，部分解磷菌还可以抑制植物病原菌，具有对人畜安全、对环境压力小、不易诱导病原菌产生抗药性等优点，因而筛选出多功能的优良解磷菌菌株具有广阔的发展前景[8]。
国内外许多****先后从植物根际土壤中分离获得具有解磷能力的解磷菌，并在解磷能力的测定、解磷机理以及农业应用等方面取得一定成果。大部分研究者分离获得的解磷菌只具有单一的解磷功能，如Mamta等[9]从植物根系土壤获得一株高效解磷菌，可溶解难溶性磷，促进植物对磷的利用。但针对具有抑菌作用的解磷菌研究较少，Dipak等[10]在印度河水中获得一株能够产生抑菌活性物质的解磷菌，因受地域及环境的限制，未能广泛应用于世界各地。故筛选出适合当地使用的多功能解磷菌具有重要的实际应用意义。本研究拟从寒地植物根际土壤中筛选获得一株能够抑制植物病原菌的高效解磷细菌，以期为寒地土壤使用的解磷微生物肥料研发提供优良菌株。
1 材料和方法 1.1 试验材料
1.1.1 样品来源: 植物根际土壤样品采自东北寒地(东经130°49′30.26″，北纬46°55′16.60″)，采集生长状态良好的水稻、玉米和大豆根际土壤，除去植物根系表层约5 cm的土壤，用无菌铲采集深5-15 cm的根际土壤，每个取样点采集3份样品，将样品按编号装于自封塑料袋中，带回实验室。
1.1.2 供试植物病原真菌: 番茄晚疫病菌(Phytophthora infestans)、茄子褐纹病菌[Phomopsis vexans (Sacc.Et Syd.) Harter]、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)、辣椒疫病菌[Phytophthora capsici Leonian]，由佳木斯大学张跃华老师提供；玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)、大豆疫菌(Phytophthora sojae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)，由佳木斯大学李修平老师提供。
1.1.3 培养基: 牛肉膏蛋白胨培养基[11]，马铃薯葡萄糖培养基(PDA)[12]，初筛培养基(PVK)[13]，复筛培养基(NBRIP)[14]。上述培养基中加入1.8%的琼脂粉使其成为固体培养基，7×104 Pa灭菌30 min。
1.1.4 主要试剂及仪器: (1) 试剂：3 mol/mL硫酸溶液，2.5%钼酸铵溶液，5%抗坏血酸溶液，细菌DNA快速抽提试剂盒、SpanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、Taq DNA聚合酶和dNTPs购于生工生物工程(上海)股份有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
(2) 钼蓝比色混合液：3 mol/L硫酸溶液﹕去离子水﹕5%抗坏血酸溶液﹕2.5%钼酸铵溶液= 1﹕2﹕1﹕1，按上述体积比例依次加入、混匀即为钼蓝比色混合液，现用现配。
(3) 仪器：HC-2517型高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；22PC05299型可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；PHS-2C型精密酸度计，杭州雷磁分析仪器公司；ZHWY-2102型恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；Tgradient型梯度PCR仪，Biometra公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂。
1.2 解磷菌的筛选
1.2.1 初筛: 称取10 g鲜样，置于90 mL带玻璃珠的无菌水中，振荡30 min，制成10-1-10-5系列梯度稀释的土壤溶液，取10-3、10-4、10-5土壤稀释液100 μL涂布至PVK初筛平板上，每个梯度重复3次，28 ℃恒温培养7 d。挑取产生透明圈的菌体划线至NBRIP复筛平板上，反复纯化3次，挑取单菌落转接于细菌试管斜面上，置于4 ℃的冷藏箱中储存备用。
1.2.2 复筛: 将纯化后的菌株接种于100 mL细菌液体培养中，37 ℃、140 r/min摇床培养12 h后，调节菌液浓度达到108 CFU/mL，制备成种子液。
1.2.3 测量: 取20 μL种子液滴加至NBRIP平板中央，28 ℃、恒温培养7 d，重复3次，测量菌体直径(d)、透明圈直径(D)并计算D/d。
1.3 菌株B51-7鉴定
1.3.1 菌株形态及生理生化试验: 观察牛肉膏蛋白胨培养基上菌株生长状态(包括菌落形态、颜色、透明度及表面结构等)；采用革兰氏染色法，在油镜下观察菌体。
1.3.2 菌株16S rRNA基因序列分析: 按照细菌DNA快速抽提试剂盒操作手册提取菌体DNA，16S rRNA基因的PCR扩增正向引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，反向引物1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反应体系：DNA模板0.1 μL，10×PCR Buffer 2 μL，Mg2+(25 mmol/L) 1.2 μL，dNTPs (each 10 mmol/L) 0.4 μL，引物27F (10 μmol/L) 0.5 μL，引物1492R (10 μmol/L) 0.5 μL，Taq DNA Polymerase (5 U/μL) 0.4 μL，ddH2O 14.9 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后采用SpanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒纯化，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。用DNAMAN软件进行序列拼接，再将获得的16S rRNA基因序列与NCBI数据库做BLAST比对分析，利用MEGA 7.0软件构建系统发育树。
1.4 菌株B51-7解磷能力的测定 制备菌株B51-7种子液。取1 mL种子液转接于100 mL NBRIP液体培养基中，30 ℃、140 r/min摇床培养8 d，同时以不接菌的NBRIP液体培养基为空白对照，重复3次。取1 mL发酵液12000 r/min离心5 min，钼蓝比色法[15]测定上清液中可溶性磷含量，酸度计测量pH。
1.5 菌株B51-7拮抗植物病原菌能力的测定 采用平板对峙法[16]。在PDA平板中央放置直径为0.8 cm的植物病原菌菌丝体。用移液枪吸取菌株B51-7种子液，接种4滴在植物病原菌的周围，每滴20 μL。以单独接种植物病原菌的平板为对照。28 ℃培养，待对照植物病原菌长满平板时测量植物病原菌直径、处理组抑菌圈直径(cm)，计算抑菌率。抑菌率[17]=(1?处理组植物病原菌直径/对照组植物病原菌直径)×100%。
1.6 盆栽试验 (1) 对照组(CK)：试验土壤+未加菌培养液；(2)处理组(B51-7)：试验土壤+菌株B51-7种子液。
取培育生长状态良好且长势相同的水稻秧苗进行盆栽，每盆移栽2株，秧苗插入深度为2 cm，每个处理3次重复，每间隔1个月，等量施加相应培养液，共施加5次，在露天阳台上实施，统一管理，全程不施用任何肥料，根据土壤状况和天气情况适时浇水除草。待水稻成熟后分别测定植株分蘖数、地上株高、地下根长和水稻千粒重；同时，采集水稻根际土壤，测定土壤理化指标及土壤微生物数量[18]。
1.7 数据分析 利用SPSS 19.0和Origin 7.5软件进行数据分析及图表制作。
2 结果和分析 2.1 解磷菌的筛选 利用PVK固体培养基从东北寒地土壤中初筛获得26株解磷菌。将26株解磷菌纯化培养，利用NBRIP固体培养基进行复筛，得到解磷能力相对较弱的菌株19株，得到具有明显解磷能力且产生较大透明圈的菌株7株，后者中2株为解磷真菌，5株为解磷细菌；解磷细菌革兰氏染色结果均为阴性杆菌，且都可以利用柠檬酸盐，分解葡萄糖产酸但不产气，均不能产生H2S、分解淀粉和精氨酸等。初筛及复筛具有典型透明圈的菌株B51-7如图 1所示，该菌株在复筛的平板上产生透明圈直径为1.28 cm，菌落直径为0.71 cm，且透明圈直径与菌落直径比值(D/d)高达1.8，此比值均高于其他菌株，故以该菌株作为重点研究菌株。
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| 图 1 菌株B51-7在PVK平板(A)和NBRIP平板(B)上的透明圈 Figure 1 Clear zones of strain B51-7 on PVK plate (A) and NBRIP plate (B). |
| 图选项 |
2.2 菌株B51-7鉴定
2.2.1 菌株形态及生理生化试验: 菌株B51-7菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上形态规则，呈圆形，表面光滑，乳白色且不透明，不产色素；革兰氏染色结果为阴性杆菌，无芽孢；生理生化测定结果如表 1所示。
表 1. 菌株B51-7的生理生化试验结果 Table 1. Physiological and biochemical test results of strain B51-7
| Test items | Results | Test items | Results | |
| Utilization of glucose | +N | Hydrogen sulfide test | - | |
| Utilization of lactose | -N | Liquefaction test of gelatin | - | |
| Utilization of sucrose | -N | Starch hydrolysis test | - | |
| Utilization of maltose | -N | Decomposition oil test | + | |
| Utilization of mannose | -N | Arginine double hydrolysis test | - | |
| Indole test | + | Ornithine decarboxylase test | + | |
| Methyl red test | - | Malonate test | - | |
| Acetylmethyl methanol test | - | Oxidase test | - | |
| Citrate test | + | Contact enzyme Test | - | |
| Nitrate reduction test | - | Gram stain | - | |
| +: positive (growth or reaction); -: negative (no growth or no reaction); N: no gas. | ||||
表选项
2.2.2 菌株16S rRNA基因序列分析: 将测序得到的16S rRNA基因序列在NCBI数据库进行BLAST比对，根据同源序列进行系统发育树的构建。从图 2可看出，菌株B51-7与菌株(Burkholderia vietnamiensis LMG 10929)处于同一分支，亲缘关系较近，两者序列相似度达99%，且B51-7在进化树上处于伯克霍尔德属模式进化支之间，所以菌株B51-7暂鉴定为伯克霍尔德属。
 |
| 图 2 菌株B51-7的系统发育树 Figure 2 The phylogenetic tree of strain B51-7. |
| 图选项 |
2.3 菌株B51-7解磷能力的测定 对菌株B51-7进行解磷能力及pH测定。该菌株连续发酵培养8 d，其解磷能力随时间变化呈先升后降的趋势(图 3)。前4 d培养中，解磷能力逐渐增加，可溶性磷含量增幅明显(P < 0.05)，在第4天时，发酵上清液中可溶性磷含量达832.74 mg/L，随后解磷能力下降。与初始pH值相比，发酵液中pH值呈先降后升趋势。发酵培养第2天pH值降到最低4.12 (P < 0.05)，与初始pH值7.0相比，下降了2.88；发酵培养4 d后，pH值逐步升高。初步推断该菌株是通过自身生长代谢产生一种或多种酸性物质，将难溶性的磷酸三钙转化为可溶性磷，具体转化机制尚待研究。
 |
| 图 3 菌株B51-7发酵液可溶性磷含量及pH变化 Figure 3 Soluble phosphorus content and pH in the fermentation broth of the strain B51-7. Different lowercase letters above the bars represent significant difference (P < 0.05). |
| 图选项 |
2.4 菌株B51-7拮抗植物病原菌能力的测定 通过平板对峙试验测定菌株B51-7拮抗多种植物病原菌的能力。结果显示菌株B51-7对7种植物病原菌均有抑制作用，如表 2和图 4所示，对大豆疫菌、玉米大斑病菌和辣椒炭疽病菌的抑菌效果最明显，其中对大豆疫菌抑菌圈直径高达3.76 cm，且与其他6种病原菌均有显著差异，抑菌率达到了89.71%；玉米大斑病菌和辣椒炭疽病菌仅次于大豆疫菌，抑菌圈直径分别为3.30 cm和3.33 cm，无显著差异，抑菌率分别为76.92%和76.47%；菌株对植物病原菌水稻纹枯病菌、番茄晚疫病菌、辣椒疫病菌和茄子褐纹病菌均产生明显的抑菌带，其中水稻纹枯病菌抑菌圈直径最小，为1.97 cm，与其他菌株均有显著差异，抑菌率为47.62%。因此，菌株B51-7具有很好的生物防治潜质。
表 2. 菌株B51-7抗植物病原菌活性 Table 2. Antibacterial activity of B51-7 strain on plant pathogens
| Plant pathogens | Diameter of inhibition zone/cm | Antibacteria rate/% |
| Rhizoctonia solani | 1.97±0.08d | 47.62 |
| Phomopsis vexans (Sacc.Et Syd.) Harter | 2.74±0.12c | 68.57 |
| Phytophthora infestans | 2.65±0.14c | 65.67 |
| Setosphaeria turcica | 3.30±0.11b | 76.92 |
| Phytophthora capsici Leonian | 2.80±0.08c | 64.62 |
| Phytophthora sojae | 3.76±0.07a | 89.71 |
| Colletotrichum capsici | 3.33±0.17b | 76.47 |
| The data are “mean±SD”. Different letters in the same column show significant difference (P < 0.05). The same as follows. | ||
表选项
 |
| 图 4 菌株B51-7对6种植物病原菌的抑制作用 Figure 4 Inhibiting effects of strain B51-7 on six kinds of plant pathogens. A: Rhizoctonia solani; B: Phytophthora infestans; C: Phytophthora capsici Leonian; D: Colletotrichum capsici; E: Setosphaeria turcica; F: Phytophthora sojae. |
| 图选项 |
2.5 菌株B51-7对水稻根际土壤及生长的影响 通过测量水稻根际土壤的理化指标和微生物数量，探讨菌株B51-7对水稻根际土壤的影响。结果如表 3所示，与对照组相比，处理组土壤的含水量和有效磷显著升高，pH和电导率显著下降；同时处理组土壤中细菌数量增加，真菌和放线菌数量显著减少。故施加菌株B51-7可以提高植物根际土壤有效磷含量，降低pH，改良碱性土壤。
表 3. 菌株B51-7对水稻根际土壤的影响 Table 3. Effects of strain B51-7 on rhizosphere soil of rice
| Soil | Moisture content/% | pH | Electrical conductivity/(μS/cm) | Available phosphorus/(mg/kg) | Bacteria/ (×107 CFU/g) | Fungi/ (×106 CFU/g) | Actinomyces/ (×106 CFU/g) |
| CK | 19.26±0.53b | 8.31±0.07a | 420.00±8.16a | 58.45±0.49b | 11.5±0.76a | 2.01±0.06a | 9.77±0.12a |
| B51-7 | 21.09±0.85a | 7.46±0.01b | 376.67±9.43b | 69.59±0.78a | 11.64±0.33a | 1.15±0.02b | 0.96±0.04b |
表选项
菌株B51-7对水稻生长的影响如表 4所示，处理组水稻的分蘖数、地上株高、地下根长和千粒重均高于对照组；其中地上株高增加21.7%，地下根长增加61.3%，千粒重增加9.2%，且均呈显著差异。故施用菌株B51-7可以促进植物生长，改善水稻产量。
表 4. 菌株B51-7对水稻生长的影响 Table 4. Effects of strain B51-7 on rice growth
| Treatment | Tiller number | Aboveground plant height/cm | Underground root length/cm | 1000-grain weight/g |
| CK | 3.33±0.94a | 63.13±2.15b | 10.23±0.87b | 23.26±1.31b |
| B51-7 | 3.67±0.94a | 76.83±1.35a | 16.50±0.70a | 25.40±0.19a |
表选项
3 结论和讨论 目前国内外有许多关于植物根际解磷菌的报道，其种类主要有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单孢菌属(Pseudolnonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、固氮菌属(Azoto-baeter)、伯克氏菌属(Burkholderia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)等[19-20]，Hani等[21]和Mehta等[22]分别从不同农作物根际分离到解磷微生物。大量科研成果表明不同属的解磷菌株解磷能力有所差异。本研究从3种植物根系土壤分离获得解磷菌26株，经分子生物学鉴定主要有伯克霍尔德菌属和泛菌属等，其解磷能力各不相同，相同培养条件下菌株B51-7的解磷能力表现出高于其他菌株。解磷能力的高低可能与增溶基因的直接表达有关，受菌株自身的遗传信息影响[23]。
相同种属的解磷菌其解磷能力各有不同。戴沈艳等[24]从江西红壤性水稻田中分离获得解磷菌为伯克霍尔德属，能够溶解少量的Ca3(PO4)2。史国英等[15]从广西甘蔗根际土壤中分离获得一株伯克霍尔德菌，可溶解Ca3(PO4)2，水溶性磷含量最高达到305.85 mg/L。菌株B51-7是从黑龙江寒地黑土中分离获得一株伯克霍尔德菌，可溶解Ca3(PO4)2，可溶性磷含量最高为832.74 mg/L。故同种菌株的解磷能力也受生境条件影响。
同一菌株在不同条件下其解磷能力也有所不同。王光华等[25]表明同一菌株受环境诱导可能有多种溶磷机制，溶磷量的不同与溶磷菌产生的有机酸组成和数量变化有关。故相同条件下，菌株B51-7的解磷能力随时间的变化有所差异，主要是菌株自身代谢产生有机酸组成和数量受时间影响。同时随有机酸含量的积累与利用，菌体周围环境的酸碱度会有所改变，一般情况pH值与可溶性磷含量呈负相关，这与Zheng[26]等提出的观点相同。
伯克霍尔德菌(Burkholderia)属对植物病原菌防治等方面具有很大应用潜力。在国外一些优势菌株已应用在实际生产中，但我国关于Burkholderia cepacia complex(Bcc)作为生物防治菌的研究报道较少[27]。Li等[28]对洋葱伯克霍尔德菌进行深入研究，表明该种菌株具有较高的生物防治价值。宫安东等[29]筛选获得一株伯克霍尔德菌WY6-5，兼具溶磷和抑菌作用。因此，有针对性地筛选适合当地应用的多功能解磷菌是本研究的重点，而菌株B51-7作为伯克霍尔德菌属中的一员，具有很强的广谱抑菌效果，同时具有很高的解磷能力，是一株多功能的生防菌，可为多功能微生物制剂的研发提供优良菌株。
植物根际是一个很特别的微区域，影响着周围微生物生长繁殖和代谢过程，同时根际微生物也会影响植物的生长发育以及植物根际土壤的理化性质[30-31]。由于菌株B51-7在生长过程中可以降低发酵液的pH，溶解Ca3(PO4)2，故本试验以碱性土壤为盆栽土壤，对各组水稻根际土壤的理化指标、微生物数量和水稻植株长势等指标进行显著分析。结果表明，菌株B51-7能够提高土壤中有效磷含量，改善碱性土壤；促进植物生长，改善水稻产量，与李乐等[32]研究结果一致。故菌株B51-7在解磷菌肥等领域也具有良好的发展空间。
本研究从北方寒地分离的解磷菌株B51-7为伯克霍尔德菌。该菌株适合北方地理和土壤环境条件，具有较强的解磷能力，可溶性磷含量最高为832.74 mg/L，同时可以抑制多种植物病原菌，具有良好的生物防治功能，也可促进水稻的生长发育。因此，菌株B51-7在生物肥料和生物农药领域具有良好的发展前景。
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