嗜虫耶尔森氏菌HlyA及HasA外分泌表达系统的构建
黄晨燕^1#, 郑茹萍^2#, 黎钟秀¹, 余云钦¹, 罗雨琦¹, 周建双¹, 张飞萍¹, 吴松青¹
1. 福建农林大学林学院, 生态公益林重大有害生物防控福建省高校重点实验室 福建 福州 350002;
2. 厦门大学环境与生态学院, 福建 厦门 361000
收稿日期：2019-02-23；修回日期：2019-05-30；网络出版日期：2019-06-21
基金项目：国家重点研发计划课题（2017YFD0600105）；国家自然科学基金（31601905）；福建省科技厅自然科学基金（2016J01097）；福建省科技计划项目（2018N5002）；福建农林大学科研基金（xjq201614）；福建农林大学林学院林学高峰学科项目（71201800720，71201800753，71201800779）；福建省大学生创新创业训练计划项目（201810389102）；福建省林业科学研究项目[Minlinke（2017）03]
_*通信作者：吴松青, E-mail:dabinyang@126.com.
^#共同第一作者

摘要：[目的] 构建一株具备外分泌蛋白功能的工程菌，解决杀虫毒素无法由胞内分泌至胞外，无法直接作用于虫体等问题，为松墨天牛防治提供新思路。[方法] 本研究先测定从松墨天牛肠道及其生境中分离出的嗜虫耶尔森氏菌（CSLH88）的生长特性及抗性，进而对其进行分子改造。构建HlyA（pGHKW2）以及HasA（pGHKW4）外分泌表达载体，利用电穿孔法将其转入CSLH88菌株，获得能够表达绿色荧光蛋白的工程菌。利用稀释涂板及荧光体式镜检测技术对两个质粒进行遗传稳定性检测，并采用SDS-PAGE及Western blotting技术验证蛋白外分泌功能。[结果] CSLH88菌株培养2-4 h能够进入对数生长期，并对卡那霉素（Kan）敏感。成功构建了含有Kan抗性基因的pGHKW2（GenBank：MK562405）和pGHKW4（GenBank：MK562404）两个外分泌表达载体的CSLH88工程菌株。其中，发现pGHKW4质粒更加适合在嗜虫耶尔森氏菌中稳定遗传。SDS-PAGE及Western blotting检测结果表明HlyA系统无法在CSLH88菌株中将目的蛋白分泌到胞外，而HasA系统则可以有效地发挥外分泌表达功能。[结论] 通过对HlyA及HasA两个外分泌表达系统进行研究，从中筛选出HasA型血红素转运系统作为CSLH88菌株的外分泌表达系统，为后续外分泌杀虫毒素蛋白菌株构建以及CSLH88菌株的致病性研究奠定基础。
关键词：松墨天牛嗜虫耶尔森氏菌外分泌表达系统绿色荧光蛋白
Construction of HlyA and HasA exocrine expression systems in Yersinia pestis
Chenyan Huang^1#, Ruping Zheng^2#, Zhongxiu Li¹, Yunqin Yu¹, Yuqi Luo¹, Jianshuang Zhou¹, Feiping Zhang¹, Songqing Wu¹
1. Key Laboratory of Integrated Pest Managemet in Ecological Forest, Fujian Province University, Forestry College of Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian Province, China;
2. College of Environment and Ecology, Xiamen University, Xiamen 361000, Fujian Province, China
Received: 23 February 2019; Revised: 30 May 2019; Published online: 21 June 2019
_*Corresponding author: Wu Songqing, E-mail:dabinyang@126.com.
Foundation item: Supported by the National Key Researchand Development Project (2017YFD0600105), by the National Natural Science Foundation of China (31601905), by the Fujian Science and Technology Department Natural Science Foundation (2016J01097), by the Fujian Science and Technology Plan Project (2018N5002), by the Fujian Agricultural and Forestry University Scientific Research Fund (xjq201614), by the Fujian Agricultural and Forestry University Forestry College Forest Science Peak Discipline Project (71201800720, 71201800753 and 71201800779), by the Fujian College Students Innovation and Entrepreneurship Training Program Project (201810389102) and by the Fujian Forestry Science Research Project [Minlinke (2017) 03]
^#Those authors contributed equally to this work

Abstract: [Objective] Construction of transgenic strain can effectively improve the insecticidal effect. But the insecticidal toxin cannot be secreted from intracellular to extracellular, so it cannot directly act on the insect body. Therefore, if we can construct an engineered strain with exocrine protein function, it is an effective way to solve these problems. [Methods] In this study, the growth characteristics and resistance of Yersinia pestis (CSLH88) isolated from the intestinal tract and habitat of M. alternatus were determined, and then the molecular modification was carried out. The exocrine expression vectors of HlyA (pGHKW2) and HasA (pGHKW4) were constructed and transformed into CSLH88 strain by electroporation to obtain engineering strain capable of expressing green fluorescent protein. The genetic stability of the two plasmids was tested, and the exocrine function of the proteins was verified by SDS-PAGE and Western blotting techniques. [Results] The strain of CSLH88 could enter logarithmic growth stage after 2-4 hours of culture and had no resistance to kanamycin (Kan). Two exocrine expression vectors, pGHKW2 (GenBank:MK562405) and pGHKW4 (GenBank:MK562404), were successfully constructed. It was found that pGHKW4 plasmid was more suitable for stable inheritance in Y. pestis. The results of SDS-PAGE and Western blot showed that the secretion of extracellular proteins in HlyA system protein was blocked, while the HasA system could play an exocrine expression function in CSLH88 strain. [Conclusion] By studying the exocrine expression systems of HlyA and HasA, HasA heme transport system was selected as the exocrine expression system of CSLH88 strain. It lays a foundation for the construction of exocrine toxin protein strain and the pathogenicity of CSLH88 strain.
Keywords: Monochamus alternatus HopeYersinia pestisexocrine expression systemgreen fluorescent protein
松材线虫病被称为松树的癌症，能够造成松树大面积枯死，松墨天牛是该病的主要传播媒介^[1]。因此，有效控制松墨天牛种群数量是防控松材线虫病的重要手段。松墨天牛的传统防治手段以清理枯死木、化学防治、诱捕器防治以及生物防治为主^[2-3]。其中，化学防治在实际生产应用上已经取得明显成效，但伴随着有害生物抗药性的产生、环境污染以及南方地区高温多雨等一系列问题的出现，极大地限制了化学杀虫剂的使用。而相比之下，生物防治手段具有对环境友好、持效期长且对靶标害虫针对性强等优点，使其成为当前研究的热点。目前，常用昆虫病原微生物作为杀虫剂对松墨天牛进行生物防治。但由于松墨天牛幼虫期生活隐蔽，导致杀虫物质难以接触虫体^[4]，防治效果有待提高。而相较于一般的病原微生物，昆虫肠道微生物虽然在环境中的丰度不高，却能够有效地在昆虫肠道内富集。若能够对天牛肠道微生物菌群进行分子改造，进而表达杀虫毒素，则可以有效地杀死树干内的幼虫，为松墨天牛防治提供新途径。
近年来，利用肠道微生物菌群能够在昆虫肠道内富集的特点，使其表达所需的毒素基因，达到防治虫媒传播疾病的目的，并逐渐成为一种新型的生物防治手段。例如，Hurwitz等通过对克氏锥虫肠道微生物菌群进行基因改造，使其能够表达杀虫毒素，进而达到防治美洲锥虫病的目的^[5]。天牛科昆虫的肠道细菌种类丰富，以肠杆菌科细菌为常见优势菌群。项目组前期从松墨天牛肠道中分离出嗜虫耶尔森氏菌(Yersinia sp.)，该菌是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的革兰氏阴性杆菌，存在于多种鞘翅目昆虫的肠道中^[6-7]。然而，根据已有的利用肠道优势菌进行防治天牛的相关报道，发现其防治效果并不理想^[8]。主要由于缺乏分泌型的表达原件，导致表达后的蛋白多停留于菌体内，无法释放到菌体外并作用于昆虫肠道上皮细胞^[9]。由此可见仅将毒素富集到昆虫肠道，而毒素无法分泌至胞外，仍然无法提高杀虫效果。因此，寻找一种能够在细菌内将外源蛋白由胞内分泌至胞外的外分泌表达系统尤为重要。
细菌分泌系统是参与细菌蛋白分泌的重要途径，能够将蛋白从胞内分泌到胞外^[10]。α-溶血素(HlyA)分泌系统及HasA型血红素转运系统是细菌中常见的Ⅰ型分泌表达系统^[11]。王四宝等利用α-溶血素(HlyA)分泌系统及HasA型血红素转运系统，分别对蚊子肠道的成团泛菌(Pantoea agglomerans)和沙雷氏菌(Serratia marcescens)进行改造，使得两种菌株均能够外分泌表达抗疟疾的效应蛋白，有效阻断了疟疾的传播^[12-13]。同样，若利用HlyA及HasA外分泌表达系统进行外分泌菌株构建，对后续进行松墨天牛防治研究具有重要的意义。但是不同宿主菌对不同的外分泌表达系统的适应性不同，若能利用绿色荧光蛋白基因(gfp)作为报告基因，构建一个能操纵宿主菌合成GFP的外分泌表达载体，便于检测HlyA以及HasA两个表达系统在嗜虫耶尔森氏菌中的外分泌表达情况。
基于以上思路，本研究选用从松墨天牛肠道中分离得到的嗜虫耶尔森氏菌(CSLH88)，以该菌为研究对象，绿色荧光蛋白为标记蛋白，构建分别含有α-溶血素(HlyA)分泌系统和HasA型血红素转运系统的CSLH88工程菌。采用荧光检测手段，对其质粒遗传稳定性进行测定，并验证构建后的CSLH88菌株外分泌功能。通过两个外分泌系统的比较，筛选出适用于嗜虫耶尔森氏菌的外分泌表达系统，为后续进行高毒力菌株构建奠定基础。
1 材料和方法 1.1 菌株与试验材料 本文所采用的pUC19-nptII-GFP-HlyA和pUC19-nptII-GFP-HasA两个表达载体、pLB-Kan质粒及CSLH88菌株均为实验室所保存。引物合成由福州擎科生物技术有限公司完成。
抗生素及使用浓度：氨苄西林(Amp)、氯霉素(Cm)、卡那霉素(Kan)、四环素(Tcy)溶解在蒸馏水或者无水乙醇中，将每种抗生素均先配制成100 mg/mL的母液，配好的抗生素用一次性过滤器过滤除菌后，按不同的比例加入培养基中，使得培养基中抗生素的终浓度分别为100、200、400、800和1000 μg/mL。
液体LB培养基(1 L)：Tryptone 10 g，Yeast extract 5 g，NaCl 10 g，pH调至7.2(固体LB培养基加1.8%琼脂条)。
含kan抗生素培养基：液体LB培养基中加入卡那霉素(Kan)，使其工作液浓度为100 μg/mL。
1.2 菌株生长曲线及抗性测定
1.2.1 菌株生长曲线测定: 取50 μL CSLH88甘油菌按1%接种于5 mL的培养基中，150 r/min、30 ℃恒温培养12 h；将活化的菌液按1%的量转接入新的100 mL LB培养基中，30 ℃、150 r/min培养，以未接种的液体LB培养基作为空白对照。每隔2 h取3 mL样品测其600 nm波长吸光度值，重复3次并计算平均值，确定其生长特性并绘制菌株的生长曲线图。

1.2.2 菌株抗性测定: 取50 μL活化过夜的CSLH88菌液，依次涂布于分别含有Amp、Cm、Kan、Tcy四种抗生素的固体LB培养基中，每种抗生素均有100、200、400、800和1000 μg/mL这5种浓度的固体LB培养基，并以不含抗生素的固体LB培养基作为空白对照。涂布后置于恒温培养箱中(30 ℃)倒置培养12 h，观察CSLH88的生长情况。
1.3 重组菌株的构建
1.3.1 含Kan抗性标记的外分泌重组质粒构建: 根据NCBI数据库中已有的Kan基因序列，设计出特异性扩增引物(5′-GCTTACTAGTGCATGCG AAGCGGAACACGTAGAAAGCC-3′，3′-CGCCAA GCTTGCTTCAATTCAGAAGAACTCGTCA-5′)。PCR反应总体系为25 μL，模板DNA 2 μL，Primer (10 mmol/L)各1.25 μL，Q5^?热启动超保真2×Master Mix 12.5 μL，ddH₂O 8 μL。将上述试剂依次加到PCR管中，反应混匀液置于PCR仪中进行扩增。反应体系为：98 ℃ 5 min；98 ℃ 1 min，57.7 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min进行30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。
将pUC19-nptII-GFP-HlyA和pUC19-nptII-GFP- HasA两个表达载体进行线性化处理及凝胶回收后，利用EasyGeno快速重组克隆试剂盒将回收的PCR产物与线性DNA片段进行连接，详细步骤参考试剂盒中说明书进行。将上述连接产物按常规转化方法转到E. coli DH5α感受态细胞，涂布于含有Kan (终浓度为100 μg/mL) LB固体培养基中，静置恒温培养箱(37 ℃)中培养12 h。
挑选转化单斑接种于含Kan抗生素的液体LB培养基，150 r/min、37 ℃培养12 h。随后，参照OMEGA公司的质粒提取试剂盒Plasmid Mini Protocol Ⅰ说明进行质粒提取，并选择相应限制性核酸内切酶进行双酶切，最后进行测序验证。得到含有Kan抗性标记的pGHKW2和pGHKW4两个外分泌表达质粒。

1.3.2 电穿孔感受态制备: 以1%的接菌量转接活化过夜的CSLH88于新的LB液体培养基，30 ℃、150 r/min的摇床振荡2–3 h。取出菌液冰浴10 min后离心4 ℃，5000 r/min、5 min弃上清。用10%甘油重悬菌体后，4 ℃、5000 r/min离心5 min，弃上清，重复3次。最后用100 μL 10%甘油轻轻重悬菌体，获得CSLH88电转感受态细胞，新制备的感受态细胞可保存于–80 ℃，以备电穿孔时使用。

1.3.3 电转化: 将CSLH88电转感受态细胞置于冰上冻融后分别加入5 μL重组质粒，轻弹混匀后迅速转入冰浴后的电极杯，用擦镜纸擦干电极杯外壁的水珠，设置电压为2500 V、电容25 μF、电阻600 Ω等参数后进行电击。电击结束后，立即往电极杯中加入500 μL的LB培养基，将所有液体移至1.5 mL离心管，30 ℃、150 r/min振荡培养1.5 h。复苏后的细胞12000 r/min室温离心1 min，弃上清液。最后，吸取100 μL混匀沉淀液涂布于含有Kan(终浓度为100 μg/mL)的LB平板，恒温培养箱(30 ℃)中倒置培养12 h。

1.3.4 阳性转化子的验证: 挑选转化单斑接种于含Kan(终浓度为100 μg/mL)抗生素的LB液体培养基，150 r/min、37 ℃培养12 h。随后，进行质粒提取，并选择相应限制性核酸内切酶进行双酶切，最后进行测序验证。
将活化过夜的CSLH88-pGHKW2及CSLH88- pGHKW4的菌液分别制片后在倒置荧光显微镜下直接观察，以CSLH88的菌体形态为对照，同时在明场和紫外激发光下观察荧光现象。
1.4 遗传稳定性检测 取活化12 h的CSLH88-pGHKW2菌株及CSLH88-pGHKW4菌株划线于含Kan的LB固体培养基上培养，挑取荧光体视镜下观察发绿色荧光的单菌落接种到含抗生素液体LB中培养12 h。取1 mL菌液于1.5 mL EP管中，12000 r/min离心1 min，去上清后加入等量液体LB，重悬后离心，按此步骤洗涤3次，重悬于1 mL液体LB中。按1%的接种量接种于不含抗生素的液体LB中，恒温摇床30 ℃、150 r/min培养12 h，之后重复转接。分别取第1、3、5等奇数次转接后的菌液逐级稀释涂布于不含抗生素的固体LB培养基中，置于30 ℃恒温培养箱中培养24 h，于荧光体视镜下统计发光菌落数，直至无发光菌落数为止。每次稀释涂布做3次重复，计算质粒丢失率，以此检测重组质粒在非选择压力下的遗传稳定性，并以相同条件进行处理的CSLH88菌株作为阴性对照。
1.5 外分泌蛋白提取及验证 吸取30 μL菌液接种入3 mL含Kan (终浓度为100 μg/mL)的LB液体培养基中，30 ℃，150 r/min活化培养12 h后按1 %接菌量将菌液转接入新的液体培养基中，30 ℃，150 r/min培养24 h。

1.5.1 胞外蛋白超滤浓缩: 将培养后的菌液4 ℃、8000 r/min离心10 min收集上清液，将其缓慢加到冰预处理的超滤管(Amicon Ultra-4centrifugal filter devices)中，4 ℃、5000 r/min离心20 min，重复此操作直至浓缩完所有上清液。离心结束后，将超滤管中的蛋白液用移液枪轻轻混匀并收集到离心管中，即为胞外蛋白，保存于–20 ℃备用。

1.5.2 胞内蛋白提取: 上述离心后的菌体用PBS缓冲液重悬后，4 ℃、8000 r/min离心8 min后去上清，重复此步骤3次。而后置于冰上进行超声波破碎处理(50 Hz)，破碎频率为10 s，间歇5 s，每管菌体破碎时间约为30 min，破碎后的细胞溶液4 ℃、8000 r/min离心8 min。得到的上清即为胞内蛋白，保存于–20 ℃备用。

1.5.3 外分泌蛋白验证: 参考分子克隆实验指南的方法制备SDS-PAGE胶，蛋白制样后电压90 V进行SDS-PAGE。SDS-PAGE胶置于R250考马斯亮蓝染色液和脱色液慢摇染色和脱色，最后利用双向电泳扫描成像仪分析SDS-PAGE情况。同时，进行Western blotting分析，先进行SDS-PAGE，而后将SDS-PAGE胶置于200 mA条件下1 h将蛋白转印至NC膜上，然后进行常规的5%的奶粉、一抗及二抗孵育操作，一抗溶液为1:4000稀释后的GFP-Tag RabbitePolycional Antibody，二抗溶液为1:5000稀释后的Goat Anti-Rabbit IgG，最终利用多功能成像系统(FluorChem Q，ProteinSimple)检测NC膜上荧光条带，分析GFP蛋白表达情况。
2 结果和分析 2.1 菌株生长曲线及抗性分析 菌株的生长特性是评定细胞活力的重要指标。试验通过分光光度法对CSLH88的生长特性进行测定，由该菌株的生长曲线图(图 1)可以看出，CSLH88菌株于30 ℃下培养2–4 h后进入生长对数期，生长速度达到最快。随后，菌株生长虽呈现上升趋势，但生长速率逐渐减缓(图 1)。通过分析CSLH88的生长特性，能够为后续使用电穿孔法构建转基因工程菌摸索最优的试验条件。

图 1 CSLH88菌株的生长特性曲线 Figure 1 Growth characteristic curve of CSLH88 strain.

图选项

此外，对CSLH88菌株进行抗性分析，如表 1所示。结果表明，CSLH88对Amp和Cm有抗性，即使在高浓度下仍能正常生长。相反，对Kan和Tcy无抗性，不能在含有Kan和Tcy的平板上生长。基因工程中常常利用抗性基因作为标记基因，用于筛选成功转化重组质粒的阳性克隆。通过对CSLH88抗性进行研究，为后期选择卡那基因作为重组质粒的抗性基因奠定基础。
表 1. 嗜虫耶尔森氏菌(CSLH88)的抗性结果 Table 1. Resistance results of Yersinia entomophaga (CSLH88)

Type	Antibiotic concentration/(μg/mL)
	100	200	400	800	1000
Amp	+	+	+	+	+
Cm	+	+	+	+	+
Kan	–	–	–	–	–
Tcy	–	–	–	–	–
+: The strain can grow normally; –: The strain can’t grow normally.

表选项






2.2 抗性标记的重组质粒鉴定 通过PCR得到kan基因片段，预期大小为1096 bp，可以在电泳图上观测到其1000 bp左右的扩增条带(图 2-A)。在Sph Ⅰ处对pUC19-nptII- GFP-HlyA外分泌表达载体进行线性化处理后，用In-Fusion克隆连接体系构建pGHKW2重组质粒。该重组质粒以pUC19载体为基本骨架，含nptII启动子，gfp基因、kan抗性基因以及HlyA、HlyB、HlyD三个外分泌系统构件(图 3)，大小为9425 bp。对构建的阳性克隆质粒用Sac Ⅰ、Spe Ⅰ进行双酶切验证，预期得到片段大小分别为5666 bp和3759 bp，与电泳图条带大小大致相符(图 2-B)。测序验证结果与设计条带序列相符，证明pGHKW2分泌表达载体构建成功。同样的方法对pUC19-nptII-GFP- HasA外分泌表达载体进行处理，构建pGHKW4重组质粒。该重组质粒以pUC19载体为基本骨架，含nptII启动子，gfp基因、Kan抗性基因以及HasA这一外分泌系统构件(图 3)，大小为5494 bp。用Sac Ⅰ、Xma Ⅰ进行双酶切，预期得到片段大小分别为1142 bp和4352 bp，与电泳图条带大小大致相符(图 2-C)。测序验证结果与设计条带序列相符，证明pGHKW4分泌表达载体构建成功。后续将验证得到的质粒序列提交到GenBank中，获得pGHKW2的序列登陆号为MK562405，pGHKW4的序列登陆号为MK562404。

图 2 kan基因PCR片段(A)和pGHKW2质粒(B)、pGHKW4质粒双酶切验证(C) Figure 2 PCR of kan gene and double digestion of pGHKW2 and pGHKW4 vector. A: PCR of kan gene; B: pGHKW2 Vector and Double digestion of pGHKW2; C: pGHKW4 Vector and Double digestion of pGHKW4. M: 1 kb marker (Thermo). Lane 1: PCR fragment of kan gene; lane 2: pGHKW2 plasmid; lane 3: Double digested by Sac Ⅰ and Spe Ⅰ; lane 4: pGHKW4 plasmid; lane 5: Double digested by Sac Ⅰ and Xma Ⅰ.

图选项

图 3 pGHKW2及pGHKW4表达载体构建流程图 Figure 3 Map of pGHKW2and pGHKW4 reconstructed plasmid. A: Insertion site of Kan gene in pGHKW2; B: pGHKW2 plasmid; C: Insertion site of Kan gene in pGHKW2; D: pGHKW2 plasmid.

图选项

2.3 重组外分泌菌株荧光检测 利用电转化法将重组质粒pGHKW2及pGHKW4转入CSLH88菌株中，使其能够表达和外分泌绿色荧光蛋白。将重组菌株制片后置于倒置荧光显微镜下观察菌体形态。从图 4可以看出，CSLH88菌体呈短杆状，其本身不携带绿色荧光基因，因此在紫外激发光源视野下一片暗黑；相反，含有pGHKW2分泌表达载体和pGHKW4分泌表达载体的工程菌，在激发光源下能发出明亮的绿色荧光，证明其电转成功，分别得到CSLH88- pGHKW2、CSLH88-pGHKW4两个重组菌株。

图 4 荧光倒置显微镜下的菌体形态(40倍) Figure 4 Cell morphology under fluorescent inverted microscope (40 times microscopic observation). A, C, E: CSLH88, CSLH88-pGHKW2 and CSLH88-pGHKW4 observed under dark field of fluorescence microscope; B, D, F: CSLH88, CSLH88- pGHKW2 and CSLH88-pGHKW4 observed under bright field of fluorescence microscope.

图选项

2.4 质粒遗传稳定性检测 在无选择压力的条件下对CSLH88-pGHKW2、CSLH88-pGHKW4两个带有荧光标记的菌株进行转接，通过计算菌量粗略推测出隔代菌株的传代次数。利用荧光体视镜进行观察，可以发现阴性对照处理的菌落均不发荧光，其他两种菌株可以观察到荧光现象。但当CSLH88-pGHKW2转接3次时，部分菌落开始出现重组质粒荧光消失现象。大约传代22次时，质粒保有率为46%，传代50次时质粒保有率下降为0%。当CSLH88-pGHKW4转接9次时，大约传代64次，重组质粒稳定性开始出现下降趋势。当传代134次时，质粒保有率下降为0%，菌落荧光现象消失(表 2)。因此，两个外分泌表达质粒遗传稳定性存在一定的差异。虽然两个重组菌株均出现质粒丢失的情况，但pGHKW4质粒能够在嗜虫耶尔森菌株中稳定遗传。
表 2. 质粒遗传稳定性 Table 2. Genetic stability of plasmids

Number of transfers	Culture time/h	Generation	pGHKW2 Plasmid retention rate/%	pGHKW4 plasmid retention rate/%
1	12	8	100	100.00
3	36	22	46	100.00
5	60	36	25	100.00
7	84	50	0	100.00
9	108	64	0	64.35
11	132	78	0	50.00
13	156	92	0	20.20
15	180	106	0	5.97
17	204	120	0	3.51
19	228	134	0	0
21	252	148	0	0

表选项






2.5 外分泌绿色荧光蛋白表达与验证 CSLH88-pGHKW2和CSLH88-pGHKW4菌株培养24 h后，通过对其胞内和胞外蛋白提取，分别进行SDS-PAGE和Western blotting验证。由SDS-PAGE的结果可以看出，两株工程菌都能够分泌蛋白。Western blotting结果表明，携带HlyA表达系统的CSLH88-pGHKW2菌株胞内能够检测到GFP蛋白，但胞外基本无目的蛋白分泌(图 5-B)，表明该系统在CSLH88菌株中虽有胞内蛋白的表达，但无法分泌到胞外。而GFP与HasA蛋白能够在CSLH88-pGHKW4菌株中融合表达，并且胞外和胞内均能检测到目的蛋白条带(图 5-D)，说明HasA系统能够在CSLH88菌株中发挥功能，能够成功进行目的蛋白的外分泌表达。

图 5 SDS-PAGE和Western blotting分析GFP表达情况 Figure 5 SDS-PAGE and Western blotting analysis of expression product of GFP. A: SDS-PAGE analysis of CSLL88-pGHKW2 protein; B: Western blotting analysis of CSLL88-pGHKW2 protein; C: SDS-PAGE analysis of CSLL88-pGHKW4 protein; D: Western blotting analysis of CSLL88-pGHKW2 protein.

图选项

3 讨论 松墨天牛是松材线虫的重要传播媒介，有效控制松墨天牛数量对防止松材线虫病蔓延起到关键性作用^[1]。但松墨天牛幼虫生活较为隐蔽，防治难度较大。过去几十年，寻找环境友好型的害虫防治系统一直都是科学界和商业界努力的目标。随着细菌、病毒、真菌、孢子虫、线虫等病原微生物杀虫剂相继被发现并使用，害虫防治的方法和途径日益趋于完善。尤其是昆虫肠道微生物具有能够在昆虫肠道富集的特点使其逐渐成为防治虫媒传播疾病的重要手段，取得显著的防治效果^[12-13]。项目组前期从松墨天牛肠道中分离出嗜虫耶尔森氏菌(CSLH88)，该菌能够在松墨天牛肠道富集。为了利用电转化法进行克隆改造，首先对CSLH88进行生长特性研究，结果发现CSLH88在30 ℃下培养2–4 h后进入生长对数期。由于制备高转化效率的感受态细胞是影响电穿孔效率的重要因素之一，利用处在生长对数期的菌体制备感受态细胞时，能够提高转化成功率^[14]。因此选用生长至对数期的CSLH88菌株制备感受态细胞用于后续电转，进而提高了克隆成功的可能。
另一方面，为了选择合适的抗性基因，对嗜虫耶尔森氏菌进行抗性分析，结果表明CSLH88对氨苄西林及氯霉素存在抗性，对卡那霉素和四环素菌均无抗性。因此，选择卡那霉素为抗性基因，进而通过分子克隆等技术构建了分别携带α-溶血素(HlyA)分泌系统和HasA型血红素转运系统的pGHKW2和pGHKW4载体，通过电穿孔法转化入CSLH88菌株中，构建能够外分泌表达绿色荧光蛋白的转基因工程菌。α-溶血素(HlyA)分泌系统和HasA型血红素转运系统作为研究已久的两个外分泌表达系统^[15-16]，其系统构件以及作用机理得到较为深入研究，两个外分泌系统都曾发现于肠杆菌科细菌中^[17-18]。其中，α-溶血素(HlyA)分泌系统组成简单，系统转运通道主要由内膜组成蛋白HlyB、HlyD和形成外膜通用孔道的组成蛋白TolC构成^[19]。此外，HasA型血红素转运系统同属于革兰氏阴性菌分泌系统的I型分泌系统，最早发现于粘质沙雷氏菌。该系统主要由HasD蛋白、膜融合蛋白HasE以及HasF蛋白构成连接内外膜的通道。HasD蛋白属于ABC蛋白(ATP-binding cassette)，是执行识别信号肽、提供能量等作用的重要元件，而系统识别的信号序列是位于hasA的羧基端的168个的碱基^[16]。本研究成功构建了含有HlyA和HasA外分泌功能的表达系统，为下一步对两种外分泌系统在嗜虫耶尔森菌株中的适应性进行研究提供了前提条件。
质粒的遗传稳定性检测是研究外源质粒在转基因工程菌中适应性的一个重要环节^[20]，能为后续应用提供理论基础。本研究分别对pGHKW2和pGHKW4两个质粒进行遗传稳定性检测，两个重组菌株均存在质粒丢失的现象。但pGHKW2质粒的稳定性较差，传代50代时，质粒保有率降为0%，而pGHKW4传代100代以上仍然具有一定的质粒保有率。质粒的遗传稳定性受宿主细胞的遗传特性、质粒自身的特性及培养条件等因素的影响^[21]，由此可见pGHKW2质粒的遗传稳定性较差可能与HlyA外分泌表达载体结构复杂有关系，相比之下HasA表达载体元件较少，更有利于其在嗜虫耶尔森氏菌中稳定遗传。尔后，利用SDS-PAGE和Western blotting技术检测外源蛋白的表达和分泌情况，结果表明CSLH88-pGHKW2菌株能够表达GFP-HlyA融合蛋白，但无法分泌到胞外。这可能是由于嗜虫耶尔森氏菌中的TolC蛋白与pGHKW2所携带的HlyA、HlyB和HlyD无法兼容，无法形成复合体完成分泌功能^[22]。因此，尽管CSLH88-pGHKW2菌株能够在荧光显微镜下观察到荧光现象，外分泌系统构件不能有效发挥其外分泌功能，进而造成胞内蛋白无法分泌到胞外，导致Western blotting无法在胞外检测到GFP蛋白。而pGHKW4载体中的gfp基因能够和HasA蛋白融合表达，并分泌到胞外，说明含有HasA外分泌表达系统的工程菌构建成功。此外，pGHKW4质粒在嗜虫耶尔森氏菌中具有较好的遗传稳定性，因此，HasA型血红素转运系统是在嗜虫耶尔森氏菌中的首选外分泌表达系统，这也为后续将gfp基因替换成杀虫毒素基因，从而为外分泌杀虫毒素蛋白菌株构建提供研究基础。

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