甄莉, 吴耿, 杨渐, 蒋宏忱
中国地质大学(武汉)生物地质与环境地质国家重点实验室, 武汉 430074
收稿日期：2019-03-13；修回日期：2019-04-26；网络出版日期：2019-05-10
基金项目：科技基础性工作专项（2015FY110100）；国家自然科学基金项目（41502318）；科技部国际合作重点项目（2013DFA31980）；中央高校基本研科业务费专项
作者简介：蒋宏忱，博士，中国地质大学(武汉)生物地质与环境地质国家重点实验室教授、博导，2007年获美国迈阿密大学博士学位。2012年入选教育部“新世纪优秀人才支持计划”，2014年获国家优秀青年基金。现任中国微生物学会地质微生物专业委员会委员、中国古生物学会地球生物学分会理事、Frontiers in Microbiology副主编、《盐湖研究》和《微生物学报》编委。致力于盐湖和热泉等极端环境地质微生物学研究。先后主持了国家基金委重大研究计划重点项目、国家优秀青年基金项目等重要课题，已在Environmental Microbiology、Applied and Environmental Microbiology等专业期刊发表科研论文90余篇。2015年获中国地质学会青年地质科技奖-银锤奖，2017年获云南省自然科学二等奖(排名第二).
*通信作者：蒋宏忱, Tel:+86-27-67883452, Fax:+86-27-67883451, E-mail:jiangh@cug.edu.cn.
摘要：[目的] 探究西藏热泉沉积物中硫氧化细菌群落多样性及其环境影响因素。[方法] 选取西藏5个地热区的25个热泉样点，现场测量各采样点的水体理化参数，并采集热泉水和沉积物样品。通过功能基因（硫代硫酸盐水解酶编码基因：soxB）克隆文库分析方法，研究沉积物样品中硫氧化细菌群落的组成和多样性，并统计分析其与环境参数之间的相关性。[结果] 克隆文库分析结果显示，西藏热泉沉积物样品中的硫氧化细菌主要分属于α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria纲。研究样品中的硫氧化菌群落香农指数与溶解有机碳的浓度（R = 0.489，P < 0.05）呈显著正相关。另外，统计发现西藏各热泉之间的硫氧化菌群落组成差异较大，其优势硫氧化细菌种群差异明显，大多数样点的优势硫氧化细菌种群为β-Proteobacteria，少量样点以α-Proteobacteria和γ-Proteobacteria为主。Mantel检验结果显示，西藏热泉样品中的硫氧化细菌群落组成与温度、硫化物、电导率、海拔、总溶解固体和pH显著（P < 0.05）相关。[结论] 西藏热泉沉积物中的硫氧化细菌群落广泛分布，且主要以变形菌门为主。地理隔离和理化差异导致了热泉沉积物样品间的硫氧化菌群落组成差异。
关键词：西藏热泉硫氧化细菌硫循环soxB基因
Distribution and diversity of sulfur-oxidizing bacteria in the surface sediments of Tibetan hot springs
Li Zhen, Geng Wu, Jian Yang, Hongchen Jiang
State Key Laboratory of Biogeology and Environmental Geology, China University of Geosciences, Wuhan 430074, Hubei Province, China
*Corresponding author: Hongchen Jiang, Tel:+86-27-67883452, Fax:+86-27-67883451, E-mail:jiangh@cug.edu.cn.
Foundation item: Supported by the Fund Project: Special basic Work of Science and Technology (2015FY110100), by the the National Natural Science Foundation of China (41502318), by the Key Project of International Cooperation of China Ministry of Science and Technology (2013DFA31980) and by the Fundamental Research Funds for the Central Universities, China University of Geosciences (Wuhan)
Abstract: [Objective] To study the distribution and diversity of sulfur-oxidizing bacteria (SOB) in the surface sediments of Tibetan hot springs. [Methods] We collected 25 hot spring sediments from 5 Tibetan geothermal areas. In the field or laboratory, we measured the physicochemical parameters of water or sediment samples. We constructed soxB gene-based clone libraries and performed phylogenetic analysis to analyze the SOB community diversity. We conducted statistical analysis to assess the influencing factors on the SOB community. [Results] Phylogenetic analysis showed that the SOB mainly consisted of α-Proteobacteria, β-Proteobacteria and γ-Proteobacteria in the Tibetan hot spring sediments. The former were dominant classes. The dominant SOB classes differ among the sampled hot springs in our research:β-Proteobacteria were dominant in most of the studied samples, whereas only a few of them were dominated by α-Proteobacteria or γ-Proteobacteria. Mantel test showed that the SOB community composition of the studied samples significantly (P < 0.05) correlated with altitude, conductivity, pH, sulfide, total dissolved solids and temperature. [Conclusion] In Tibetan hot spring sediments, α-Proteobacteria and β-Proteobacteria were the main SOB communities, but γ-Proteobacteria was rare. The SOB community structures differed significantly among the studied hot springs, which is mainly caused by their different physical and chemical properties.
Keywords: Tibethot springssulfur-oxidizing bacteriasulfur cyclesoxB gene
硫元素是自然环境中最重要的元素之一，是氨基酸和酶的关键组成成分[1]。自然界中的硫元素具有多种形态(如单质硫、无机和有机硫化合物)，它们之间通过各种生物、物理、化学过程参与自然界生态循环[2]。硫循环过程包括硫氧化、硫还原、硫酸盐还原等过程，同时关联着碳、氮等元素的地球化学循环，是地球重要的元素循环过程之一[3-4]。其中微生物在推动全球硫循环中扮演着重要角色[5]。硫氧化是硫循环的重要组成部分，通常指单质硫或还原性硫化物被微生物氧化的过程，常由硫氧化细菌(sulfur-oxidizing bacteria，SOB)催化。SOB的硫氧化过程是由一系列的酶催化完成，其中soxB基因编码的硫代硫酸盐水解酶就是最为关键的酶之一[6-9]。因此，soxB常被用作标记基因广泛应用于研究各种自然环境中的SOB多样性[10]，例如热泉[11]、盐碱湖[12]、深海热液[13]等。
热泉是典型的陆地热、酸极端环境，有着活跃的生物地球化学循环(如硫循环)过程[14]。同时，热泉环境(如高温、低氧)与原始地球形成初期的环境极其相近[15]，因此，研究热泉微生物生态及其参与的元素循环过程，对于我们探究地球早期生命具有重要的指示作用。另外，热泉环境存在着多种形态的硫化物，可为SOB生长和新陈代谢提供能量[14]。前人基于16S rRNA基因研究发现热泉存在大量硫氧化细菌群落，比如硫杆菌属、硫微螺菌属和硫化叶菌属等[16-17]。以上研究主要采用16S rRNA基因分析了热泉总细菌或古菌群落多样性，对于全面认识热泉硫氧化微生物群落多样性仍存在不足。功能基因分析在探测某一特殊功能微生物群落(如SOB)多样性方面具有较强优势[12]。因此，借助功能基因(如soxB基因)分析方法将有助于我们进一步加深认识热泉SOB群落多样性及其响应环境因子的变化。
我国西藏地区具有丰富的地热资源(如热泉)[18]。该地区热泉分布广泛，受人类活动干扰较少，且具有多种环境梯度[19]，如本研究中西藏热泉温度梯度(28.6–90 ℃)和pH梯度(pH 3.0–9.1)。因此，西藏地区热泉是研究嗜热和赖热微生物多样性及其响应环境因子变化的天然实验场。前人在西藏地区已开展大量微生物多样性研究[20-22]，但对于硫氧化菌群多样性仍未得到全面认识。因此，本研究以西藏热泉为研究对象，通过克隆文库技术分析soxB基因的多样性，揭示硫氧化细菌的多样性和群落组成，并初步研究其对各种环境因子的相关性。相关研究结果可加深我们对热泉生境中硫氧化细菌群落生态多样性的认知，为理解热泉生境硫循环生物地球化学过程提供数据基础。
1 材料和方法 1.1 采样点分布 本研究共选取25个采样点，涉及区域分布在西藏5个地区：曲色涌巴(标记为QSYB)有4个样点；打加(标记为DG)有14个样点；色米(标记为SM)有1个样点；曲才(标记为QC)有3个样点；曲卓木(QZM)有3个样点。采样点的地理位置如图 1所示。
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| 图 1 中国西藏热泉研究区域分布图 Figure 1 Regional map of research on Tibet hot springs in China |
| 图选项 |
1.2 样品采集及水体理化参数测试 现场测量西藏各个热泉采样点的GPS位置、海拔、pH、温度等理化参数。每个采样点的GPS及海拔高度信息由便携式仪器(eTrex H，Garmin，USA)检测。温度和pH由便携式温度计和pH计(LaMotte，MD，USA)检测。电导率和总溶解固体含量使用电导率测定仪(SX713，上海三信仪表)。热泉水总二价铁Fe(Ⅱ)和硫化物含量测试采用哈希试剂盒(HACH，USA)。
采集热泉水，用0.7 μm玻璃纤维滤膜(Whatman GF/F filters)过滤后，分装在30 mL的棕色玻璃瓶中(所用玻璃纤维滤膜和棕色玻璃瓶已经450 ℃马弗炉高温灼烧，消除有机物)，标记后用封口膜包装，以防止标签掉落和样品泄漏，样品全程置于干冰中运输。运回实验室后存放于4 ℃冰箱，用于后续溶解性有机碳(DOC)的测定。另外，在水与沉积物接触处约1 cm位置采集沉积物，分装于无菌的50 mL离心管，标记后用封口膜包装，以防止标签掉落和样品泄漏，样品全程置于干冰中运输。运回实验室后放于–80 ℃超低温冰箱储存，用于后续热泉沉积物DNA提取和总有机碳(TOC)的测定。
用N/C2100S分析仪(Analytik Jena，Germany)测量热泉水样中的溶解性有机碳(DOC)和沉积物样品中的总有机碳(TOC)浓度。用于检测TOC的热泉沉积物样品需要先用HCl酸化去除沉积物中的碳酸盐，用去离子水反复冲洗去除Cl–后，将pH调至中性，放置于65 ℃烘箱烘至干燥，用研钵研至粉末状态待用。所有样品避免反复冻融。
1.3 DNA提取和PCR扩增 采用试剂盒Fast DNA Soil-Direct Kit (MP BIO，美国)提取西藏热泉沉积物样品总DNA。以提取的总DNA作为模板，参照前人文献中的PCR条件[23]，用引物soxB693F (5'-ATCGGNCARGCN TTYCCNTA-3')/soxB1446B(5'-CATGTCNCCNCCRTGYTG-3')对soxB基因进行PCR扩增[24]。使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，同时选用DL2000 DNA作为Marker，在紫外灯下观察，在该Marker对应的750 bp的位置切取含目标条带的琼脂糖凝胶。用试剂盒Axy Prep DNA Gel Extraction Kit (Axygen，美国)纯化PCR产物，回收DNA。
1.4 克隆文库构建和系统发育分析 参照前人文献中的方法[25]，将纯化回收的PCR产物连接到pGEM-T载体上(Promega，美国)，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将转化后的细胞均匀涂布到含有氨苄青霉素钠盐(100 μg/mL)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(简称X-Gal，80 μg/mL)以及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，(简称IPTG，0.5 mmol/L)的LB抗性筛选平板上，置于37 ℃培养箱培养过夜。对每1个采样点都建立1个克隆文库，总共构建了25个soxB基因克隆文库，编号与样点名称相同：QC02、QC04、QC05、SM01、DG02、DG07、DG12、QSYB08、QSYB09-2、QSYB09-3、QSYB10、DG01-1、DG01-2、DG01-3、DG01-4、DG01-5、DG01-6、DG02-1、DG02-2、DG02-3、DG02-4、DG02-5、QZM02、QZM04和QZM06。对于每个克隆文库，进行蓝白斑筛选，随机挑取50个左右的阳性克隆子，然后进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，简称RLFP)分析[26]。根据每一种酶切带型，挑选出一个代表性克隆子送至上海生工(武汉)测序部测序。返回的原始序列使用Bioedit软件进行修剪，然后在线使用National Center for Biotechnology Information网站(简称为NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)对修剪后的序列进行比对(BLASTX)，选取有效的soxB基因序列。以98%序列相似性作为分类标准，使用Mothur软件对soxB基因克隆序列进行分类操作单元(即operational taxonomic unit，简称OTU)划分[27]。从每个OTU中选取一条序列作为代表序列，将其与NCBI数据库中的同源氨基酸序列进行比对，将相似性最高的已知同源氨基酸序列选取为参考序列，使用BioEdit软件将参考序列和代表氨基酸序列对齐、修剪后，导入MEGA 7.0软件构建系统发育树。该研究中测定的克隆序列已经递交至GenBank中，获得登录号为MK441756–MK441836。
1.5 统计分析 根据前人研究方法[23]，soxB基因克隆文库的覆盖度使用公式C = 1–n/N计算(其中C为覆盖度，n为文库中只出现一次的克隆数量，N为该文库克隆总数)。使用PAST(http://folk.uio.no/ohammer/past/)进行聚类分析、Mantel检验、克隆文库多样性指数分析硫氧化细菌群落组成及其与环境变量的相关关系。另外，使用SPSS 22.0分析环境变量的相关性。
2 结果和分析 2.1 水体理化性质 西藏热泉样品的温度为28.6–90 ℃，pH为3.0–9.1。其他主要理化参数如表 1所示。在5个采样地区中，除色米(SM)地区仅有1个样点外，其余4个采样地区曲色涌巴(QSYB)、打加(DG)、曲才(QC)、曲卓木(QZM)的热泉样点在区内都各自形成了一定的pH和温度范围。另外，仅DG02为酸性热泉，QC02、QC04、QC05、DG07、DG12、SM01、QZM02、QZM04这8个热泉水体pH在7左右，其余16个样点热泉水体偏碱性(表 1)。另外，Spearman相关性分析显示，电导率与总溶解固体(TDS)、pH、温度存在显著相关性(P < 0.05)；pH与溶解有机碳(DOC)和TDS以及温度与TDS也存在显著相关性。
表 1. 西藏热泉采样点信息及地球化学参数 Table 1. Geography and geochemical parameters of water in the Tibetan hot springs
| Sample ID | GPS location/(E/N) | Altitude/m | T/℃ | pH | EC/(μs/cm) | TDS/(mg/L) | TOC/% | DOC/(mg/L) | Fe(Ⅱ)/(mg/L) | Sulfide/(mg/L) |
| QC02 | 91°35'28.46"/ 30°39'58.90" | 4497.0 | 28.6 | 7.5 | n.a. | n.a. | 0.1 | n.a. | n.a. | 0.0 |
| QC04 | 91°35'28.10"/ 30°40'0.52" | 4500.0 | 69.5 | 6.8 | 2170.0 | 1064.0 | 4.8 | 1.9 | 0.00 | 0.02 |
| QC05 | 91°35'44.27"/ 30°38'53.56" | 4495.0 | 40.8 | 7.0 | 1888.0 | 925.7 | 0.7 | 2.8 | 0.00 | 0.02 |
| DG02 | 85°44'52.33"/ 29°36'11.23" | 5084.0 | 36.7 | 3.0 | 439.8 | 216.0 | 0.2 | 0.3 | 0.56 | 0.00 |
| DG07 | 85°44'48.44"/ 29°36'13.64" | 5073.0 | 82.1 | 7.0 | 1872.0 | 909.0 | n.a. | n.a. | 0.02 | 0.11 |
| DG12 | 85°44'52.22"/ 29°36'28.83" | 5077.0 | 77.8 | 7.0 | 1805.0 | 884.8 | 0.3 | 0.1 | 0.01 | 0.15 |
| SM01 | 86°24'17.06"/ 29°12'55.62" | 4263.0 | 85.9 | 7.2 | 2307.0 | 1109.0 | 0.1 | n.a. | 0.82 | 0.06 |
| QSYB08 | 81°34'50.66"/ 30°35'4.92" | 4620.0 | 84.0 | 8.3 | 2077.0 | 998.4 | 0.0 | 15.6 | 0.04 | 0.06 |
| QSYB09-2 | 81°34'49.98"/ 30°35'5.17" | 4620.0 | 70.0 | 8.9 | 1848.0 | 906.1 | 0.0 | 21.3 | 0.00 | 0.35 |
| QSYB09-3 | 81°34'49.98"/ 30°35'5.17" | 4620.0 | 70.0 | 8.9 | 1828.0 | 896.3 | 0.1 | 28.4 | 0.03 | 0.43 |
| QSYB10 | 81°34'49.65"/ 30°35'4.45" | 4622.0 | 90.0 | 9.1 | 1845.0 | 904.7 | 0.0 | 10.3 | 0.02 | 0.22 |
| DG01-1 | 85°45'03.37"/ 29°35'53.80" | 5057.0 | 77.0 | 8.2 | 1951.0 | 956.6 | 0.0 | 18.4 | 0.03 | 0.07 |
| DG01-2 | 85°45'3.37"/ 29°35'53.80" | 5057.0 | 71.0 | 8.6 | 1837.0 | 900.7 | 0.1 | 29.0 | 0.02 | 0.10 |
| DG01-3 | 85°45'3.37"/ 29°35'53.80" | 5057.0 | 60.0 | 8.7 | 1834.0 | 899.3 | 1.0 | 21.9 | 0.03 | 0.19 |
| DG01-4 | 85°45'3.37"/ 29°35'53.80" | 5057.0 | 55.2 | 8.7 | 1855.0 | 909.6 | 0.7 | 8.1 | 0.16 | 0.03 |
| DG01-5 | 85°45'3.37"/ 29°35'53.80" | 5057.0 | 50.0 | 8.8 | 1840.0 | 902.3 | 8.3 | 18.8 | 0.07 | 0.03 |
| DG01-6 | 85°45'3.37"/ 29°35'53.80" | 5057.0 | 46.0 | 8.6 | 1835.0 | 899.8 | 2.9 | 23.5 | 0.00 | 0.05 |
| DG02-1 | 85°45'2.45"/ 29°35'55.74" | 5058.0 | 70.0 | 8.6 | 1864.0 | 914.0 | 0.2 | 4.7 | 0.05 | 0.03 |
| DG02-2 | 85°45'2.45"/ 29°35'55.74" | 5058.0 | 63.0 | 8.6 | 1842.0 | 903.1 | 15.6 | 8.0 | 0.12 | 0.02 |
| DG02-3 | 85°45'2.45"/ 29°35'55.74" | 5058.0 | 57.0 | 8.6 | 1856.0 | 909.8 | 1.0 | 6.3 | 0.01 | 0.02 |
| DG02-4 | 85°45'2.45"/ 29°35'55.74" | 5058.0 | 48.5 | 8.7 | 1847.0 | 905.5 | 2.6 | 5.8 | 0.00 | 0.03 |
| DG02-5 | 85°45'2.45"/ 29°35'55.74" | 5058.0 | 43.0 | 8.7 | 1851.0 | 907.6 | 2.0 | 13.0 | 0.00 | 0.03 |
| QZM02 | 91°48'39.12"/ 28°14'36.53" | 4519.0 | 65.0 | 6.5 | 1670.0 | 819.0 | 0.4 | 21.2 | 1.56 | 0.02 |
| QZM04 | 91°48'45.88"/ 28°14'11.94" | 4853.0 | 72.0 | 6.9 | 2037.0 | 998.4 | 4.7 | 18.3 | 0.88 | 0.02 |
| QZM06 | 91°48'26.10"/ 28°13'45.80" | 4743.0 | 71.0 | 8.3 | 1071.0 | 996.5 | 3.0 | 18.4 | 1.09 | 0.02 |
| n.a. is not detected. | ||||||||||
表选项
2.2 soxB基因克隆文库分析 本研究共筛选出644个有效soxB基因克隆子，25个热泉样点的所有检出的soxB基因克隆序列可划分为83个OTU。其中，QC05热泉样点具有10个OTU，QZM4热泉样点具有8个OTU，DG01_2和QSYB08热泉样点各有7个OTU，DG07、QSYB09_2和QSYB10热泉样点各有6个OTU，SM01热泉样点具有5个OTU，DG01_1、DG01_5、QSYB09_3和QZM02热泉样点各有4个OTU，DG01_3和DG12热泉样点各有2个OTU。DG01_4、DG02_4和QC04热泉样点各有1个OTU。所得25个克隆文库的覆盖度范围为87%–100%。多样性指数(Chao_1、Shannon_H、Simpson_1-D)分析结果如表 2所示。
表 2. 25个西藏热泉soxB基因克隆文库的多样性指数 Table 2. Diversity indices of the twenty-five soxB gene clone libraries from the studied Tibetan hot springs
| Clone libraries | Library size (No. of clones) | Observed OTUs | Coverage/% | Chao_1 | Shannon_H | Simpson_1-D | Equitability |
| DG01_1 | 22 | 4 | 100 | 4.0 | 1.4 | 0.7 | 1.0 |
| DG01_2 | 37 | 7 | 100 | 7.0 | 1.8 | 0.8 | 0.9 |
| DG01_3 | 17 | 2 | 100 | 2.0 | 0.6 | 0.4 | 0.9 |
| DG01_4 | 13 | 1 | 100 | 1.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| DG01_5 | 38 | 4 | 97 | 5.0 | 1.3 | 0.7 | 0.8 |
| DG01_6 | 22 | 3 | 100 | 4.0 | 1.3 | 0.7 | 0.9 |
| DG02_1 | 15 | 3 | 93 | 3.0 | 0.8 | 0.5 | 0.7 |
| DG02_2 | 18 | 3 | 88 | 4.0 | 0.4 | 0.2 | 0.4 |
| DG02_3 | 24 | 3 | 100 | 3.0 | 0.9 | 0.5 | 0.8 |
| DG02_4 | 22 | 1 | 100 | 1.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| DG02_5 | 20 | 3 | 90 | 5.0 | 0.9 | 0.5 | 0.7 |
| DG07 | 43 | 6 | 94 | 9.0 | 0.9 | 0.4 | 0.5 |
| DG12 | 19 | 2 | 94 | 2.0 | 0.2 | 0.1 | 0.3 |
| DG02 | 33 | 3 | 100 | 3.0 | 0.6 | 0.3 | 0.5 |
| QC02 | 9 | 3 | 100 | 3.0 | 1.0 | 0.6 | 0.9 |
| QC04 | 21 | 1 | 100 | 1.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| QC05 | 29 | 10 | 86 | 13.0 | 2.1 | 0.9 | 0.9 |
| QSYB08 | 31 | 7 | 87 | 11.0 | 1.6 | 0.7 | 0.8 |
| QSYB09_2 | 31 | 6 | 93 | 6.5 | 1.5 | 0.7 | 0.8 |
| QSYB09_3 | 38 | 4 | 100 | 4.0 | 1.1 | 0.6 | 0.8 |
| QSYB10 | 39 | 6 | 97 | 7.0 | 1.7 | 0.8 | 0.9 |
| QZM02 | 10 | 4 | 90 | 4.0 | 1.2 | 0.7 | 0.9 |
| QZM04 | 36 | 8 | 97 | 8.3 | 1.7 | 0.8 | 0.8 |
| QZM06 | 14 | 3 | 100 | 3.0 | 1.0 | 0.6 | 0.9 |
| SM01 | 29 | 5 | 96 | 5.0 | 1.0 | 0.5 | 0.6 |
表选项
系统发育分析显示西藏热泉沉积物中的硫氧化细菌分属于α-proteobacteria、β-Poteobacteria和γ-Proteobacteria三个纲，属于α-Proteobacteria纲的soxB基因OTU可分为Rhodobacterales、Rhodospirillales和Rhizobiales三个目；属于β-Poteobacteria纲的soxB基因OTU可分为Burkholderiales、Nitrosomonadales、Neisseriales和Rhodocyclales 4个目；属于γ-Proteobacteria纲的soxB基因OTU属于1个目(即Chromatiales) (图 2)。
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| 图 2 soxB基因编码的氨基酸序列系统发育树 Figure 2 Phylogenetic tree constructed by amino acid sequence translated from the soxB gene sequences in twenty five clone libraries. Maximum likelihood tree showing the phylogenetic relationships of the deduced SoxB protein sequences translated from the soxB gene clone sequences obtained in this study and their closely related sequences from the GenBank database. The numbers following OTU represent different OTUs. In the brackets, there is the number of clones of the OTU/ the number of clones of the clone library. The scale bar indicates the expected number of changes per homologous position. Bootstrap values of (1000 replicates) > 50% are shown. The SoxB amino acid sequence from Aquifex aeolicus was used as outgroup |
| 图选项 |
在纲级别的水平上，各热泉样点之间的soxB基因OTU组成没有显著地域差异(图 2和3)。在本研究的25个热泉样点中，有15个样点(QSYB10、QSYB09_3、QSYB08、QC05、QZM06、QSYB09_2、DG01_2、G01_1、DG07、QZM04、SM01、G01_4、QC04、DG02和DG12)的硫氧化细菌群落以β-Proteobacteria纲为主(相对丰度 > 53%)；而α-Proteobacteria纲在DG01_5、DG02_1、DG01_6、DG02_3、DG02_4、DG01_3和QC02等7个热泉样品硫氧化细菌群落中占优势(相对丰度 > 61%)，γ-Proteobacteria纲在DG02_2和DG02_5热泉样品硫氧化细菌群落中占优势(相对丰度 > 93%)。此外，α-Proteobacteria和β-Proteobacteria纲在QZM02热泉样品硫氧化细菌群落中各约占一半(相对丰度 = 50%)。
 |
| 图 3 西藏热泉沉积物soxB基因克隆文库聚类分析和群落组成情况 Figure 3 Cluster analysis and community compositions of the soxB gene clone libraries retrieved from the studied Tibetan hot spring sediment samples |
| 图选项 |
在目(Order)级别的水平上，各热泉样点之间的soxB基因OTU组成具有差异(图 2)。隶属于α-Proteobacteria纲的三个目的soxB基因OTU分布没有体现出明显地域差别：属于Rhodobacterales目的soxB基因OTU存在于QSYB10、QSYB09_3、DG01_1和DG01_2等9个热泉样点。这些soxB基因OTU序列与分离自西藏曲才热泉(温度65.7 ℃，pH7.0)沉积物的Rhodobacterthermarum (WP_128514891)和分离自某河口沉积物的Rhodobacter aestuarii (WP_076483094)等序列相似。R.thermarum与R. aestuarii均是光合紫色非硫细菌，能进行光合异养生长[28-30]。属于Rhodospirillales目的soxB基因OTU存在于QC05、DG01_1、DG01_5、DG02和DG07等5个热泉样点。这些soxB基因OTU序列与分离自亚速尔群岛某热泉的Tepidamorphus gemmatus (WP_114377142)序列相似，T. gemmatus最佳生长温度为45–50 ℃[31]。属于Rhizobiales目的soxB基因OTU存在于DG07、DG01_5、DG02_1、DG01_6、DG02_3、DG02_4、DG01_3和QC02等8个热泉样点。这些soxB基因OTU序列与分离油污染土壤且具有降解复杂有机质的Pseudorhodoplanes sinuspersici (WP_086090114)相似[32]。
在β-Proteobacteria纲中，属于Rhodocyclales目soxB基因OTU仅存在于DG07和SM01共2个热泉样点。这些soxB基因OTU序列与具有硫氧化功能的Azonexus hydrophilus序列相似[33]。属于Burkholderiales目的soxB基因OTU存在于QSYB10、QSYB09_3、QSYB08、QC05、QZM06、QSYB09_2、DG01_2、G01_1、QZM02、QZM04、SM01、QC04和DG02等13个热泉样点。这些soxB基因OTU序列与具有硫代硫酸盐氧化功能(GenBank描述)的Thiomonas spp. (WP_018914579)和Hydrogenophaga spp.(AGJ03162)等序列相似。属于Nitrosomonadales目soxB基因OTU存在于QSYB10、QSYB09_3、QSYB08、QC05、DG07、QZM02、QZM04、SM01、DG02_3、DG01_3、DG01_4和DG12等12个热泉样点。这些soxB基因OTU序列与分离自铀矿且具有氧化硫化合物功能的Sulfuriferula plumbiphila (ABR67374)[34]和Thiobacillus spp.等序列相似。属于Neisseriales目的soxB基因OTU存在于QSYB08、DG01_5、DG02_1、DG01_6和DG02_5等5个热泉样点。这些soxB基因OTU序列与具有硫化物氧化功能的Vitreoscilla filiformis (WP_089416040)序列相似，V. filiformis嗜微氧，通常生长在贫氧环境中，在低营养浓度下生长最好[35]。
γ-Proteobacteria纲中的soxB基因OTU都属于Chromatiales目，仅在QSYB09_3、QSYB08、QC05、QZM02、DG02_2和DG02_5等6个热泉样点特有。这些soxB基因OTU序列与源自日本某热泉(温度50 ℃)且具有硫氧化功能的Sulfurivermis fontis (WP_127477683)等序列相似[36]。
在OTU水平上，西藏各热泉沉积物样品中优势OTU(在某个样品中相对丰度大于 > 20%)差别非常大(表 3)。大部分优势OTU仅存在于唯一1个样点中，不与其他样点共享。另外，OTU03为DG01_6、DG02_3、DG02_4所共有，OTU03为DG01_3、DG01_4、DG02_3、DG02_5所共有，OTU08为QC05、QZM06所共有，OTU09为DG02_2、DG02_5所共有，OTU14为DG01_5、DG02_1所共有，OTU19为QZM02、QZM06所共有。这些优势OTU代表序列的soxB基因氨基酸序列相似性为76%–99%，主要分属于α-、β-和γ-Proteobacteria(表 3)。
表 3. 西藏热泉硫氧化细菌优势分类单元(在某一样点中丰度 > 20%)统计 Table 3. Statistics of the dominant OTUs (relative abundance > 20% in certain sample) of sulfur oxidizing bacteria in the studied Tibetan hot springs
| OTU ID | Sample ID (relative abundance) | Taxonomy(Class) | Closest relative | soxB gene identity/% |
| OTU01 | DGJ07(65.1%) | Betaproteobacteria | Azonexus hydrophilus | 93 |
| OTU02 | DGJ12(94.7%) | Betaproteobacteria | Annwoodia aquaesulis | 79 |
| OTU03 | DG01_6(40.9%)/ DG02_3(62.5%)/ DG02_4(100%) | Alphaproteobacteria | Elioraea sp. | 94 |
| OTU04 | DG02(81.8%) | Betaproteobacteria | Thiomonas sp. | 91 |
| OTU05 | DG01_3(29.4%) DG01_4(100%)/ DG02_3(29.2%)/ DG02_5(25.0%) | Betaproteobacteria | Thiobacillaceae sp. | 81 |
| OTU06 | DG02_1(66.7%) | Alphaproteobacteria | Allochromatium vinosum | 91 |
| OTU07 | QC04(100%) | Betaproteobacteria | Macromonas sp. | 91 |
| OTU08 | QC05(20.7%)/ QZM06(42.9%) | Betaproteobacteria | Curvibacter sp. | 96 |
| OTU09 | DG02_2(88.9%)/ DG02_5(65.0%) | Gammaproteobacteria | Allochromatium vinosum | 91 |
| OTU10 | QSYB09_2(32.3%) | Betaproteobacteria | Azonexus hydrophilus | 93 |
| OTU11 | DG01_6(31.8%) | Alphaproteobacteria | Thiomonas sp. | 91 |
| OTU12 | DG01_3(70.6%) | Alphaproteobacteria | Leptothrix mobilis | 85 |
| OTU13 | SM01(72.4%) | Betaproteobacteria | Macromonas sp. | 91 |
| OTU14 | DG01_5(39.5%)/ DG02_1(26.7%) | Betaproteobacteria | Thiobacillus thioparus | 82 |
| OTU16 | DG01_1(22.7%) | Alphaproteobacteria | Hydrogenophaga sp. | 93 |
| OTU18 | DG01_2(27.0%) | Betaproteobacteria | Elioraea sp. | 94 |
| OTU19 | QZM02(20.0%)/ QZM06(30.6%) | Betaproteobacteria | Sideroxydans sp. | 89 |
| OTU25 | QSYB08(41.9%) | Gammaproteobacteria | Thiothrix sp. | 90 |
| OTU27 | QSYB09_3(21.1%) | Betaproteobacteria | Thiobacillus thioparus | 78 |
| OTU32 | DG01_5(36.8%) | Alphaproteobacteria | Elioraea sp. | 94 |
| OTU38 | QSYB09_2(29.0%) | Gammaproteobacteria | Sulfurivermis fontis | 97 |
| OTU39 | QZM06(42.9%) | Betaproteobacteria | Candidimonas nitroreducens | 82 |
| OTU41 | DG01_1(22.7%) | Alphaproteobacteria | Paracoccus aestuarii | 89 |
| OTU42 | DG01_2(24.3%) | Alphaproteobacteria | Tabrizicola sp. | 96 |
| OTU43 | DG1_1(36.4%) | Betaproteobacteria | Blastomonas sp. | 93 |
| OTU44 | QZM02(50.0%) | Betaproteobacteria | Azospira oryzae | 78 |
| OTU54 | QSYB09_3(55.3%) | Betaproteobacteria | Hydrogenophaga sp. | 93 |
| OTU55 | QSYB09_2(25.8%) | Betaproteobacteria | Macromonas sp. | 91 |
| OTU58 | QZM04(36.1%) | Betaproteobacteria | Hydrogenophaga sp. | 94 |
| OTU59 | QZM02(20.0%) | Betaproteobacteria | Tibeticola sediminis | 99 |
| OTU61 | QSYB10(35.9%) | Betaproteobacteria | Comamonadaceae sp. | 95 |
| OTU62 | QSYB08(29.0%) | Betaproteobacteria | Vitreoscilla filiformis | 85 |
| OTU68 | QC05(20.7%) | Betaproteobacteria | Halochromatium salexigens | 90 |
| OTU77 | QC2(22.2%) | Alphaproteobacteria | Rhodobacter aestuarii | 90 |
| OTU78 | QC2(55.6%) | Alphaproteobacteria | Pseudorhodoplanes sinuspersici | 76 |
| OTU79 | QC2(22.2%) | Alphaproteobacteria | Pseudorhodoplanes sinuspersici | 91 |
表选项
2.3 统计分析 聚类分析的结果显示，QSYB10、QSYB09_3、QSYB08、QC02、QC04、DG02和DG12等7个热泉样点全部单独聚在一起，其他热泉样点则较为分散。Mantel检测结果显示，硫氧化细菌群落组成与温度、电导率、海拔、TDS和pH (P < 0.01)均呈显著(P < 0.05)相关性，其中海拔的相关系数最高(表 4)。
表 4. Mantel检验分析硫氧化细菌种群构成与环境参数的相关性结果 Table 4. Mantel tests showing correlation between the soxB gene community composition and environmental variables
| Environmental factor | R | P |
| T | 0.142 | < 0.015 |
| EC | 0.142 | < 0.07 |
| Altitude | 0.246 | < 0.001 |
| TDS | 0.141 | < 0.001 |
| pH | 0.196 | < 0.001 |
| DOC | 0.070 | 0.136 |
| TOC | -0.041 | 0.709 |
| Fe(Ⅱ) | 0.112 | 0.091 |
| Sulfide | 0.130 | 0.032 |
表选项
α-多样性指数(Chao_1、Shannon_H、Simpson_1-D)与环境变量的Pearson相关性分析结果显示，Shannon指数与DOC浓度(R = 0.489，P < 0.05)呈显著正相关，Simpson指数与DOC浓度(R = 0.55，P < 0.015)呈显著正相关。
3 讨论 目前针对热泉总细菌和古菌多样性研究较多，但针对热泉生境硫氧化群多样性的研究相对较少。本研究热泉样点中硫氧化细菌群落主要以α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和γ-Protobacteria三个纲为主，暗示变形菌门的硫氧化细菌是该研究热泉中硫氧化过程中的主要参与者。前人研究结果显示，携带soxB基因的硫氧化菌主要为绿菌纲(Chlorobia)、α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和γ-Protobacteria纲[8]。因此，本研究与前人的研究发现一致。
β-Proteobacteria纲硫氧化菌是本研究热泉样点的主要群落，少量热泉样点中的硫氧化细菌群落以α-Proteobacteria纲或γ-Proteobacteria纲为主(图 3)。我们研究结果与前人在其他热环境的研究结果不一致，如深海热液环境(硫氧化细菌群落以ε-变形菌纲和γ-变形菌纲为主)[37-38]。造成这种差异的原因主要是由于陆地热泉独特的地质条件和理化性质而导致。由于该研究的西藏热泉是陆地热泉，其地质条件和深海热液环境具有本质区别；而且不同热区系统具有不同的水-岩相互作用，因而导致不同热区系统的地球化学特征具有较大差异[39-40]。因此，陆地和海底热区的地球化学条件差异直接导致本研究的主要硫氧化菌群与前人研究的研究结果不同。另外，值得注意的是本研究的热泉沉积物中优势硫氧化细菌种群在不同热泉间差异较大(表 3)。该研究结果暗示硫氧化菌群敏感地响应热泉地球环境条件，因为我们研究的热泉样点在地球化学方面可能存在独立性(表 1)。此外，热泉之间的相互环境和地理隔离也有可能导致上述优势硫氧化细菌群落差异[41-42]。
该研究热泉样品的溶解有机碳含量显著(P < 0.05)影响着硫氧化菌群α多样性，即溶解有机碳含量越高，硫氧化菌群的α多样性越高。前人研究显示硫氧化菌主要以异养为主[8]。环境中有机碳可作为异养微生物的食物，因而直接影响着异养微生物的生长[43]。因此，溶解有机碳含量会影响研究热泉的硫氧化菌群α多样性。
温度、pH、电导率、总溶解性固体(TDS)、硫化物含量以及海拔对研究样品的硫氧化菌群落组成具有显著影响(表 4)。我们研究结果与前人大量研究总细菌和古菌群落组成分布的结果一致[44-47]。就温度而言，微生物个体有不同的最适生长温度和生长温度上限，温度高于或者低于最适生长温度都会抑制菌株的生长，超过生长上限菌株死亡或休眠[48-50]。其他环境中的硫氧化微生物群落组成也明显受到温度的影响[51-52]。就pH而言，极端酸度可能抑制硫氧化过程[53]。前人对Rhizobium sp.属硫氧化细菌株的研究结果表明，pH偏酸性时，菌株生长受抑制。菌株在中性条件或弱碱性条件下生长良好且能高效进行硫氧化功能，pH = 8.0时菌株硫氧化效率最高[54]。pH可能通过影响微生物细胞凋亡[55]、环境中离子浓度[56]、细胞膜完整性[57]等来影响微生物群落组成。电导率以及TDS与盐度有相关关系，因此，电导率和TDS可能均体现的是盐度对研究样品硫氧化菌群组成的影响[25]。硫化物是硫氧化的底物，因此，它影响研究样品的硫氧化菌群落组成是合理的[58]。
另外值得注意的是，海拔对研究热泉样品的硫氧化菌群落组成的影响高于其他环境参数(表 4)。该结果可能归因于海拔体现了地理和环境因素差异两个方面的综合因素。本研究热泉样点不同地区具有不同海拔平均值(表 1)。即平均海拔打加(DG) > 曲才(QC) > 曲卓木(QZM) > 曲色涌巴(QSYB) > 色米(SM)。前人大量研究揭示地理隔离对热泉微生物分布具有重要影响，不同热泉中微生物群落形成清晰不同的地理群落[45]，没有物质交换的不同地区的热泉中变形菌门存在明显的遗传学差异[59-60]。本研究也显示距离较远的曲色涌巴(QSYB)、曲才(QC)、曲卓木(QZM)、色米(SM)采样点之间，完全没有相同的OTU存在，这三个地区中存在温度、pH等其他理化条件较为相近的采样点，但它们之间仍没有相同OTU存在。同时，相距较近的打加(DG)样点之间，存在相同OTU，所有样点呈现较为明显的地理分区，所以地理隔离对西藏热泉硫氧化细菌群落差异有较大影响。另外，海拔可以影响高原热泉水体溶氧浓度[61]，即随着海拔增高，溶解进入热泉的氧气也越少。加之本研究热泉样点位于西藏高海拔地区，氧气比较稀薄。因此，溶解氧含量可能更加敏感地影响着研究热泉微生物的有氧代谢过程(如硫氧化)。由于本研究并未测试热泉溶解氧含量，所以以上推论有待后续研究证实。
4 结论 西藏地区热泉中硫氧化细菌的群落主要属于由α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria纲。且不同采样点的优势硫氧化细菌种群差异明显，大多数样点的优势硫氧化细菌群落为β-Proteobacteria，少量样点以α-Proteobacteria和γ-Proteobacteria为主。本研究中的西藏热泉硫氧化细菌群落分布特征主要受控于各种地理和环境条件，如海拔、温度、pH、总溶解固体(TDS)和电导率，其中海拔的影响强度相对其他环境因素较强。
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