郭鹤宝1#, 何山文1#, 王星1, 章俊1,2, 张晓霞1
1. 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所, 农业农村部农业微生物资源收集与保藏重点实验室, 北京 100081;
2. 广东省微生物研究所, 广东 广州 510070
收稿日期：2018-12-24；修回日期：2019-04-05；网络出版日期：2019-07-16
基金项目：国家自然科学基金（31670005）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（Y2019XK07）
*通信作者：张晓霞, Tel:+86-10-82105087, E-mail:zhangxiaoxia@caas.cn.
#共同第一作者
摘要：[目的] Pantoea菌株是广泛分布在自然界中的一类功能多样的细菌。本研究对分离自水稻种子内生的Pantoea菌株进行系统发育分析及功能评价，从而确定分类地位、种类多样性、分布特征及功能特性。[方法] 采用乙醇-次氯酸钠联合灭菌方法进行水稻种子的表面灭菌，进行内生细菌的分离与纯化；其次将纯化后的菌株进行16S rRNA基因PCR扩增及序列分析，通过MEGA 7软件构建系统发育树；将分离得到的菌株进行功能实验检测，如溶磷、产IAA、产铁载体、拮抗病原真菌等特性，最后检测菌株的溶血性；水稻分型采用SSR方法，并对水稻农学性状如分蘖数、株高、植株重及产量进行调查。[结果] 本研究对分离自8个不同基因型水稻种子中的146株内生Pantoea菌株进行系统发育分析及功能评价，结果发现所分离到的泛菌菌株主要属于Pantoea dispersa、Pantoea agglomerans、Pantoea cypripedii以及Pantoea brenneri四个种，其中P.dispersa的菌株数量最多，分布最广，并且存在于所有的8个水稻种子样品中。对其中66株菌进行功能检测，发现86.3%和69.7%的菌株具有溶磷和产IAA能力，有7株菌具有产铁载体能力，未发现对真菌病害Fusarium moniliforme有拮抗作用的菌株，并发现3株菌具有溶血性；本实验未发现泛菌组成与水稻系统发育及农学性状存在明显的相关性。[结论] 本研究首次对水稻种子中泛菌的多样性及其功能进行报道，发现不同基因型的水稻种子所含Pantoea种类及组成存在差异，种子选择性地积累了Pantoea类群，大部分菌株具有一定的促生特性。该研究结果有助于进一步探究微生物与植物的共进化、种子微生物的传播途径及作用方式。
关键词：Pantoea水稻种子内生细菌促生功能
Phylogenetic diversity and plant growth-promoting characteristics of endophytic Pantoea spp. in rice seeds
Hebao Guo1#, Shanwen He1#, Xing Wang1, Jun Zhang1,2, Xiaoxia Zhang1
1. Key Laboratory of Microbial Resources Collection and Preservation, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;
2. Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, Guangdong Province, China
Received: 24 December 2018; Revised: 5 April 2019; Published online: 16 July 2019
*Corresponding author: Xiaoxia Zhang, Tel: +86-10-82105087; E-mail:zhangxiaoxia@caas.cn.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31670005) and by the Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund (Y2019XK07)
#These authors contributed equally to this work
Abstract: [Objective] The genus Pantoea comprises 26 species that are isolated from a multitude of environments. In this study, 146 strains of Pantoea isolated from rice seeds of 8 different rice genotypes were systematically analyzed to determine their phylogenetic status, diversity, distribution and functional characteristics. [Methods] First, surface of rice seeds was sterilized by ethanol-sodium hypochlorite, and then the surface sterilized seeds were ground into a powder to isolate endophytic bacteria using the standard dilution plating technique. Second, the strains were purified and 16S rRNA gene sequencing and analyzed. Finally, the isolated strains were tested for plant growth-promoting, such as phosphorus solubilization, indoacetic acid (IAA) and siderophore production, antagonistic and hemolysis. Simple sequence repeats molecular marker technology was used to study the genetic polymorphism in five different genotypes of rice, and some agronomic traits such as tiller numbers, plant height, plant weight and rice production were studied. [Results] In total 146 endogenous Pantoea strains were isolated from 8 different genotypes of rice seeds. Pantoea strains were classed to Pantoea dispersa, Pantoea agglomerans, Pantoea cypripedii and Pantoea brenneri based on 16S rRNA gene phylogenetic analysis. Among the 4 species, P. dispersa has the largest size of population and existed in all 8 rice seed samples. Then, 66 strains were selected to test the plant growth-promoting characteristics, 86.3% and 69.7% of the strains were found to have the ability to dissolve phosphorus and produce IAA. 7 strains had the ability to produce siderophore. None of the strains was antagonistic to fungal pathogen Fusarium moniliforme. Another 3 strains had hemolytic activity. Pantoea composition did not correlate with rice phylogeny and agronomic traits. [Conclusion] The species and composition of Pantoea were different in different rice seeds. The seeds could selectively accumulated Pantoea as endophytic bacteria, and most of the strains had growth-promoting characteristics.
Keywords: Pantoearice seedsendophytic bacteriaplant growth-promoting characteristics
泛菌属(Pantoea)是一类革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科，细胞呈直杆状，大多数菌株能产生黄色素。泛菌属的模式菌种成团泛菌(P. agglomerans) 1888年被Beijerinck发现，并命名为Bacillus agglomerans，后来于1972年被Ewing and Fife命名为Enterobacter agglomerans，1989年Gavini依据现有分类标准将其定为泛菌属[1]，截止目前该属一共有26个种(http://www.bacterio.net/-allnamesmr.html)。泛菌在自然界分布广泛，主要存在于水中、土壤中，不同的寄主包括植物、人以及昆虫等也都有分布[2]。近期研究发现，泛菌还存在于多种植物的种子中，且多为优势类群[3]。本实验室前期研究发现Pantoea、Acinetobacter以及Xanthomonas为水稻的核心类群。Rahman等对来自于不同的品种、地理位置和世代的大麦内生微生物组进行研究，均检测到Paenibacillus、Pantoea和Pseudomonas相关类群，并表明在温室条件下具有促进植物生长和抵抗真菌性病害等功能[4]；连续3代的Crotalaria pumila种子中也均检测到Pantoea[5]；在连续3代的萝卜种子中，发现Pantoea和Pseudomonas也是主要类群[6]。由此可见，Pantoea可能是植物种子内生细菌的一个重要类群。
综上所述，泛菌是一类广泛存在于自然界且功能多样的微生物，在植物的种子这个特殊生境中，种子内生泛菌的研究目前多限于在种群水平上的描述，而对其系统发育、分布及功能尚缺乏系统研究。本研究将对分离自8个不同水稻基因型的种子内生泛菌菌株进行16S rRNA基因的系统发育分析、分布特征及其对植物相关促生功能进行评价。
1 材料和方法 1.1 样品来源及培养基配制
1.1.1 样品采集及处理: 水稻种子由武汉大学李阳生教授实验室所提供，来源信息如表 1所示。水稻的表型性状在2015年8月(抽穗期)进行调查，采集水稻完整植株，对每个品种采用对角线法采集三束水稻植株，即每个品种3个重复，分别测量其株高、分蘖数、植株鲜重以及植株干重，并记录。然后于2015年10月(水稻收获期)测量不同水稻品种的稻谷产量，并作相应记录。用于拮抗实验的指示菌株为F. moniliforme，ACCC 36127来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
表 1. 8个水稻品种信息来源表 Table 1. Information sources of 8 rice varieties
| Number | Variety name | Breeding site | Number | Variety name | Breeding site |
| 2 | YTA/031 | Ezhou, Hubei | 6 | 08S-23//CHAO 2R/Fengfuzhan | Ezhou, Hubei |
| 3 | S-S1//CHAO 2R/Fengfuzhan | Ezhou, Hubei | 9 | 4A/9311MUT | Ezhou, Hubei |
| 4 | Y58S//6096/CHAO 2R | Ezhou, Hubei | 19 | 4A/1410932 | Ezhou, Hubei |
| 5 | YTA// CHAO 2R/ Fengfuzhan | Ezhou, Hubei | 22 | Tianlong No. 1 | Commercial products |
表选项
1.1.2 培养基配制: (1) TSA培养基(Difico)[7]；无机磷培养基[8]；IAA检测培养基[9]；CAS蓝色定性检测固体培养基[10]。(2) PDA固体培养基：马铃薯提取液1.0 L，葡萄糖20.0 g，琼脂15.0 g，自然pH。(3)马铃薯提取液的制备：取去皮马铃薯200 g，切成小块，加水1000 mL煮沸30 min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000 mL。(4)血平板：血平板购买自北京大宏生物有限公司。
1.2 水稻种子表面灭菌 采用乙醇-次氯酸钠联合灭菌方法[11]对水稻种子进行表面灭菌。剥壳的5 g水稻种子放入无菌培养皿中，无菌水冲洗3次，无菌滤纸擦干水分，依次用70%乙醇处理3 min，1% NaClO (有效氯)处理1 min，70%乙醇处理30 s，最后用无菌水冲洗6次。最后一次水洗后吸取100 μL水涂布TSA平板上，并将表面灭菌的种子按压于TSA平板上，检测种子表面是否灭菌彻底。
1.3 水稻种子内生细菌的分离与纯化 取5 g表面灭菌后的种子于无菌研钵中研磨成粉末，然后将粉末加入装有玻璃珠的50 mL无菌水中，30℃振荡30 min摇匀，即为10–1稀释液，吸取1 mL 10–1稀释液到9 mL无菌水中，吹吸均匀，即为10–2稀释液，用无菌水稀释成10–3、10–4稀释液。然后依次从10–4、10–3、10–2、10–1稀释液中吸取100 μL稀释液涂布到TSA培养基上，每个稀释度3个重复。30 ℃下培养3–5 d。挑取不同形态的菌落平板划线并进一步纯化，并用终浓度为25%的甘油保藏菌株，于–80 ℃冰箱中放置。
1.4 水稻种子内生细菌16S rRNA基因PCR扩增及序列分析 采用煮沸法获得DNA模板，并采用通用引物27F和1492R，进行单向测序，正常序列长度约为700 bp。将测序后的结果在Ezbiocloud网站上(www.ezbiocloud.net/eztaxon)进行序列比对，通过MEGA 7.0软件进行系统发育分析。
1.5 溶磷实验 微生物通过产生有机酸类等物质溶解土壤中植物不易吸收的无机磷化合物，促使土壤中无效磷的溶解及利用。实验方法主要参照上述标注文献中，将活化的目的菌株点接到无机溶磷培养基上，30 ℃培养1周左右，测量菌落直径d1，溶磷圈直径d2，将溶磷圈直径d2与菌落直径d1的比值作为评价溶磷能力的标准，比值越大即表明菌株溶磷能力越强。
1.6 产IAA实验 色氨酸是植物生长素IAA (吲哚乙酸)的合成前体，在培养基中加入色氨酸可诱导微生物合成IAA。采用Salkowski比色法测定内生细菌分泌植物生长激素(IAA)。
1.7 产铁载体实验 依据Machuca和Milagres描述的方法进行检测目的菌株是否具备产生铁载体的能力。
1.8 拮抗试验 将活化好的细菌点接到TSA平板上，一个平板点接4个接菌点，并在4个接菌点的中央点接病原真菌F. moniliforme，30 ℃培养1周并观察结果。如果对病原真菌有拮抗作用，病原真菌就不能覆盖细菌生长，即能够形成明显的抑菌圈。
1.9 溶血实验 在每个新鲜的血平板上划线接种4个菌，30 ℃培养48 h后观察。溶血分为α溶血(不完全性溶血，产生草绿色溶血环)、β溶血(完全性溶血，呈界限分明、无色透明的溶血环)以及不溶血。
1.10 SSR分子标记技术 本研究共对8个品种的水稻进行SSR法分型并构建进化树。43对SSR PCR引物的设计、扩增的反应体系和反应条件参照文献[12]。然后将PCR产物在3%高分辨率凝胶(Metaphor Agarose)上进行凝胶电泳，电压80 V，时间80 min。读取多态性条带，并利用NTsys 2.10e软件进行聚类分析。
2 结果和分析 2.1 水稻内生细菌分离及16S rRNA基因的系统发育分析 8个不同基因型的水稻种子中共挑取241株细菌，对分离的内生菌进行16S rRNA基因初步鉴定，经Ezbiocloud比对后发现，其中146株细菌属于泛菌属(Pantoea spp.)，占分离细菌总数的60.6%。所有分离到的泛菌及其相近的模式菌菌种构建的系统发育树(邻接法)如图 1所示。所分离到的泛菌菌株主要分布在P. dispersa、P. agglomerans、P. cypripedii以及P. brenneri四个种中，各类群分布及其所占比例见图 2所示。
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| 图 1 依据16S rRNA基因构建的系统发育分离自水稻种子中泛菌属(Pantoea spp.)菌株进化树(NJ法) Figure 1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of endophylic bacteria isolated from rice seeds. GenBank accession numbers are given in parentheses; numbers in parentheses after the number of isolated strains represent the number of strains of the same group; numbers at branch points are percentage bootstrap (values based on 1000 replicates); the scale bar represents 0.01 changes per nucleotide. |
| 图选项 |
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| 图 2 分离的泛菌属菌株在8个不同水稻品种中的分布 Figure 2 Distribution of 8 different species of Pantoea in each genotype rice seeds. |
| 图选项 |
根据进化树及比对结果发现，有57株菌属于P. dispersa，分布在所有分离到泛菌菌株的8个水稻种子样品中，同时该种是本研究中数量最多、分布最广的一类。除Z4-1所代表的两株菌与模式菌P. dispersa LMG 2603 T相似性为99.78%外，其他相似性均为100%。值得指出的是，Z4-1与P. dispersa LMG 2603T 16S rRNA基因相似性最高，仅2个碱基的差异，而与P. cypripedii有6个碱基的差异，但是在系统进化树上却与P. cypripedii聚为一类，因而其确切分离地位还需通过多相分类方法进一步确定。
属于P. agglomerans的菌株一共有22株，各个菌株间的16S rRNA基因相似性均为100%，与P. agglomerans模式菌株DSM 3493T的相似性均为99.56%，分布在5、6、19、22号种子中。
P. brenneri主要分布在19号和22号样品中，共24株菌株属于该种，其中17株分离自19号样品，菌种间16S rRNA基因相似性为100%，与P. brenneri模式菌株LMG 5343T相似性为99.71%；22号样品中，分离到的7株该类群的菌株，但菌株间系统发育存在明显的分化，其中Z22-2所代表的4株菌间相似性为100%，与模式菌LMG 5343T相似性为99.72%；而Z22-27、Z22-24与模式菌株LMG 5343T相似性分别为99.85%和99.41%，二者各自单独成一个分支。
隶属于P. cypripedii的42株菌均来自于4号样品，且菌株间相似性为100%，与模式菌ATCC 29267T的相似性为99.69%。
此外，Z19-21与P. dispersa LMG 260T及P. cypripedii ATCC 29267T相似性分别是99.25%和99.26%，单独形成一个分支，具体是否属于新的类群还需要通过多相分类进行确定。
2.2 泛菌菌株的植物促生功能 本研究一共选择了66株菌进行溶磷、产植物生长素IAA、产铁载体以及抗植物真菌病害等与植物促生功能相关的试验(表 2)。
表 2. 水稻种子内生Pantoea促生功能及溶血性结果 Table 2. Growth promoting function and hemolytic results of endophytic Pantoea in rice seeds
| Number | Top-hit taxon | Phosphorus solubilization (d2/d1) | IAA/(mg/L) | Siderophore (A/Ar) | Antagonism | Hemolysis | GenBank accession No. |
| Z2-7 | Pantoea dispersa | 1.02±0.04 | – | 0.70±0.11 | – | β-hemolytic | MF176579 |
| Z3-7 | Pantoea dispersa | 1.80±0.04 | 234.10±8.09 | – | – | – | MK322438 |
| Z3-6 | Pantoea dispersa | 1.88±0.10 | 167.19±0.78 | – | – | – | MF176580 |
| Z3-5 | Pantoea dispersa | 2.25±0.06 | 139.35±1.45 | – | – | – | MF176624 |
| Z4-6 | Pantoea cypripedii | 1.45±0.06 | 174.52±0.89 | – | – | – | MK318638 |
| Z4-7 | Pantoea dispersa | 1.50±0.01 | – | – | – | – | MK318639 |
| Z4-10 | Pantoea cypripedii | 1.18±0.02 | 264.39±7.70 | 0.69±0.02 | – | – | MK312573 |
| Z4-11 | Pantoea cypripedii | 2.00±0.08 | 168.12±4.31 | 0.86±0.02 | – | – | MK312572 |
| Z4-12 | Pantoea cypripedii | 1.10±0.01 | 428.65±7.04 | – | – | – | MK327827 |
| Z4-13 | Pantoea cypripedii | 1.16±0.04 | 272.27±3.22 | – | – | – | MK312570 |
| Z4-14 | Pantoea cypripedii | 1.17±0.04 | 225.69±6.67 | – | – | – | MK281382 |
| Z4-21 | Pantoea cypripedii | 1.1±0.016 | 211.47±2.13 | – | – | – | MK312590 |
| Z4-22 | Pantoea cypripedii | 1.23±0.04 | 220.61±4.03 | – | – | – | MK312574 |
| Z4-23 | Pantoea cypripedii | 1.04±0.04 | 211.72±20.86 | 0.82±0.03 | – | – | MK312592 |
| Z4-24 | Pantoea cypripedii | 1.29±0.04 | – | – | – | – | MK312589 |
| Z4-25 | Pantoea cypripedii | 1.94±0.06 | 43.88±3.08 | – | – | – | MK322437 |
| Z4-29 | Pantoea cypripedii | – | – | – | – | – | MK312569 |
| Z5-5 | Pantoea dispersa | 1.75±0.03 | – | – | – | – | MK322471 |
| Z5-4 | Pantoea agglomerans | 1.14±0.03 | – | – | – | β-hemolytic | MK322468 |
| Z5-3 | Pantoea dispersa | 1.61±0.02 | 188.88±4.66 | – | – | – | MK322461 |
| Z5-2 | Pantoea dispersa | – | – | – | – | – | MK322442 |
| Z6-9 | Pantoea agglomerans | 1.31±0.02 | 390.57±2.89 | – | – | – | MF176633 |
| Z6-8 | Pantoea agglomerans | 1.30±0.02 | 430.19±8.42 | – | – | – | MF176632 |
| Z6-7 | Pantoea agglomerans | 2.39±0.06 | 431.11±5.14 | – | – | – | MF176512 |
| Z6-3 | Pantoea agglomerans | 1.45±0.07 | 286.59±8.38 | – | – | – | MF176630 |
| Z6-1 | Pantoea agglomerans | 1.41±0.04 | 350.20±15.36 | – | – | – | MF176629 |
| Z19-1 | Pantoea brenneri | 2.50±0.11 | 305.69±14.06 | – | – | – | MK318656 |
| Z19-2 | Pantoea dispersa | 2.07±0.04 | – | – | – | – | MK322469 |
| Z19-7 | Pantoea dispersa | 1.58±0.10 | 193.89±4.74 | – | – | – | MK322456 |
| Z19-8 | Pantoea dispersa | 1.11±0.03 | 155.20±5.71 | – | – | β-hemolytic | MK322470 |
| Z19-13 | Pantoea dispersa | 1.52±0.04 | 171.14±3.45 | – | – | – | MK322467 |
| Z19-14 | Pantoea dispersa | 1.19±0.02 | – | – | – | – | MK322441 |
| Z19-15 | Pantoea agglomerans | 1.29±0.04 | – | – | – | – | MK322462 |
| Z19-19 | Pantoea dispersa | – | 81.99±5.63 | – | – | – | MK318657 |
| Z19-33 | Pantoea dispersa | 1.14±0.07 | 391.32±13.57 | – | – | – | MK322502 |
| Z19-34 | Pantoea dispersa | 1.08±0.03 | – | – | – | – | MK322500 |
| Z19-35 | Pantoea brenneri | 0.60±0.02 | 328.35±25.52 | – | – | – | MK322503 |
| Z19-36 | Pantoea dispersa | 1.78±0.01 | 231.2±16.56 | – | – | – | MK322504 |
| Z19-37 | Pantoea brenneri | 1.09±0.03 | 379.13±4.07 | 0.80±0.05 | – | – | MK322509 |
| Z19-38 | Pantoea brenneri | 3.15±0.27 | – | – | – | – | MK318660 |
| Z19-39 | Pantoea brenneri | 1.29±0.06 | 162.59±9.67 | 0.62±0.03 | – | – | MK322510 |
| Z19-51 | Pantoea agglomerans | 1.08±0.04 | – | – | – | – | MK322508 |
| Z19-52 | Pantoea dispersa | 1.72±0.02 | 182.95±7.67 | – | – | – | MK318659 |
| Z19-56 | Pantoea agglomerans | 1.05±0.04 | – | – | – | – | MK322501 |
| Z19-59 | Pantoea dispersa | 1.18±0.03 | 328.92±7.84 | – | – | – | MK322464 |
| Z19-62 | Pantoea dispersa | 1.24±0.07 | – | – | – | – | MK322465 |
| Z19-63 | Pantoea dispersa | 1.63±0.04 | 122.76±4.35 | – | – | – | MK322466 |
| Z19-64 | Pantoea brenneri | 1.13±0.04 | 29.74±2.77 | – | – | – | MK322457 |
| Z19-67 | Pantoea dispersa | 1.26±0.06 | – | – | – | – | MK322460 |
| Z19-68 | Pantoea dispersa | 1.37±0.04 | 158.6±3.36 | – | – | – | MK322458 |
| Z19-69 | Pantoea dispersa | 1.44±0.04 | 182.81±7.16 | – | – | – | MK322459 |
| Z19-71 | Pantoea brenneri | 2.25±0.07 | 304.12±15.34 | – | – | – | MK322463 |
| Z19-73 | Pantoea brenneri | 1.04±0.03 | – | – | – | – | MK322434 |
| Z19-74 | Pantoea dispersa | 1.71±0.02 | 63.76±2.85 | – | – | – | MK322433 |
| Z19-75 | Pantoea dispersa | 1.17±0.04 | 138.43±1.64 | – | – | – | MK322435 |
| Z19-76 | Pantoea brenneri | 2.00±0.62 | – | 0.72±0.02 | – | – | MK322436 |
| Z19-77 | Pantoea dispersa | 1.00±0.02 | – | – | – | – | MK322440 |
| Z19-78 | Pantoea dispersa | 1.22±0.02 | 268.11±23.95 | – | – | – | MK322439 |
| Z19-79 | Pantoea brenneri | 1.06±0.03 | 38590±5.28 | – | – | – | MK322432 |
| Z19-80 | Pantoea brenneri | 1.13±0.10 | 388.42±16.57 | – | – | – | MK313695 |
| Z19-90 | Pantoea dispersa | 2.85±0.04 | 351.56±2.57 | – | – | – | MK313703 |
| Z19-96 | Pantoea agglomerans | 1.13±0.05 | 425.71±30.27 | – | – | – | MK313697 |
| Z22-21 | Pantoea agglomerans | 1.13±0.04 | 349.97±18.34 | – | – | – | MK313698 |
| Z22-24 | Pantoea brenneri | 2.38±0.03 | – | – | – | – | MK313700 |
| Z22-25 | Pantoea brenneri | 2.23±0.07 | 306.06±19.96 | – | – | – | MK313699 |
| Z22-26 | Pantoea dispersa | 1.21±0.03 | 166.80±2.89 | – | – | – | MK313696 |
表选项
2.2.1 溶磷功能: 溶解无机磷的菌株通过分泌一些酸性物质，并向周围的培养基中扩散，使菌落周围的磷酸盐溶解，通过溶磷圈的直径d2和菌落的直径d1的比值确定溶磷能力大小，比值越大即溶磷能力越强，溶磷能力d2/d1值在1.0–2.0属于溶磷能力中等菌株。通过培养1周后发现，共55株菌具有溶磷能力，占总筛选菌株的83.3%。另外，有43菌株d2/d1在1.0–2.0，属于中等溶磷能力菌株；d2/d1≥2.0的菌株共计有11株，属于强溶磷能力的菌株，这些菌分别属于P. dispersa、P. agglomerans、P. cypripedii 以及P. brenneri，即所分离到4个种中均有较高溶磷能力的菌株。在P. brenneri中，溶磷能力最高的菌株为Z19-38，其d2/d1为3.15；P. dispersa中，菌株Z19-90的溶磷能力较高，d2/d1为2.85；P. agglomerans中，能力较高的菌株为Z6-7，d2/d1为2.39；P. cypripedii中Z4-11菌株的溶磷能力较高，比值为2.00。
2.2.2 分泌IAA能力测定: 加入Salkowski比色液后，溶液颜色变为粉红色即为具有分泌IAA能力的菌株，颜色越深即分泌IAA能力越强，经过初筛发现46株菌具有IAA产生能力。在定性检测基础上，通过比色法进行定量检测，发现菌株分泌IAA浓度为29.74–431.11 mg/L。其中，P. agglomerans Z6-7分泌IAA能力最强，IAA的含量为431.11 mg/L；P. cypripedii Z4-12、P. brenneri Z19-80及P. Dispersa Z19-33均具有较强的分泌IAA能力，分别为428.65、388.42和391.32 mg/L。
2.2.3 产铁载体能力测定: 铁载体检测通常采用定性初筛及A/Ar比值的相对定量实验，认为A/Ar为0–0.6时产铁载体能力较强，0.6–0.8中等，0.8–1.0为较弱。经过定量和定性检测结果发现，水稻种子内生菌具有产铁载体功能的菌株数量并不多，仅有7株菌具有产铁载体的功能。其中A/Ar是0.6–0.8的菌株分别为P. brenneri Z19-39、P. cypripedii Z4-10、P. dispersa Z2-7、P. brenneri Z19-76以及P. brenneri Z19-37，表明这些菌株产铁载体能力属于中等水平，其中P. brenneri Z19-39相比于其他种来说产铁载体能力更强，即比值为0.62；P. cypripedii Z4-23和P. cypripedii Z4-11的A/Ar分别为0.82和0.86，具有产铁载体能力，但是活性相对较弱；此外，本研究中未发现产铁载体能力较强的菌株。
2.2.4 拮抗作用: 对所有菌株进行拮抗病原菌F. moniliforme的实验，并未发现抗菌活性的菌株。
2.3 溶血实验 对66株菌进行溶血实验，结果发现有3株菌呈现阳性，分别为P. dispersa Z19-19、P. dispersa Z19-35和P. agglomerans Z19-77，可以初步说明这3株具有人畜致病的风险。除溶血性之外，菌株对植物的致病风险尚需我们进行进一步深入的评价。
2.4 水稻种子SSR分子标记遗传多态性分析 利用NTsys 2.10e软件分析这8个品种的水稻遗传多态性，并构建了水稻基因型的聚类图，见图 3。从结果我们可以看出，以遗传相似系数0.68为阈值，可以将8个基因型的水稻分为两大类群。其中第一类群包含7个基因型的水稻品种，编号分别为2、3、4、5、6、9、19；而第二大类群有1个基因型的水稻品种，编号为22，该品种为市售样品，其他均为有亲缘关系的杂交稻，因此该样品与其他样品亲缘关系较远。结合图 2分析，发现泛菌的组成与水稻亲缘关系间并不存在明显的相关性。
 |
| 图 3 8个水稻品种SSR分子标记遗传多态性分析图 Figure 3 Analysis of genetic polymorphisms of SSR molecular markers in 8 rice varieties. |
| 图选项 |
2.5 不同水稻品种的表型特征分析 8个不同基因型水稻品种的株高、分蘖数、植株鲜重、植株干重以及稻谷产量记录如表 3所示。其中19号水稻样品的株高及稻谷产量最高；4号水稻分蘖数及干重最高；根据图 2可以看出，二者分离的Pantoea数量要普遍高于其他样品，但因样品数量所限，因此并不能给出明确的结论。
表 3. 8个不同基因型水稻品种的表型特征总结 Table 3. Summary of phenotypic characteristics in 8 different genotypes of rice varieties
| Number | Height/cm | Tillers | Fresh weight/g | Dry weight/g | Rice production/(kg/21 m2) |
| 2 | 93±4.50 bc | 11±0.82 c | 132.24±9.73 b | 33.45±3.98 ba | 14.7 |
| 3 | 88±6.41 c | 16±1.41 b | 192.58±1.11 a | 42.81±1.33 a | 18.1 |
| 4 | 92±2.36 bc | 19±1.70 a | 185.31±18.31 a | 43.31±4.15 a | 10.8 |
| 5 | 85±1.55 c | 15±2.62 b | 124.45±18.05 b | 29.56±4.32 b | 16.5 |
| 6 | 93±3.68 bc | 14±0.94 bc | 132.33±16.36 b | 32.74±4.30 ba | 11.2 |
| 9 | 92±2.01 bc | 11±1.25 c | 155.26±15.31 ba | 33.76±2.48 ba | 14.6 |
| 19 | 103±2.45 a | 11±2.05 c | 178.04±40.23 a | 39.86±8.05 a | 25.2 |
| 22 | 101±7.04 ba | 14±0.82 bc | 164.70±14.10 ba | 41.41±3.28 a | 10.1 |
| Different lowercase letters indicate significant difference at P＜0.05, and same lowercase letters are not significantly different at P＞0.05 level. | |||||
表选项
3 讨论 Walterson和Stavrinides对Pantoea这一类群进行了十分详细的综述性报道，Pantoea的分布极其广泛，功能具有多样性：分离自水体和土壤中的Pantoea可以修复和降解农药残留和其他有毒物质；Pantoea作为多种植内生菌具有固氮和促生功能，有些对植物病原菌具有生防作用；近年来从病人的血液尿液中分离到很多Pantoea菌株，但是其对人的致病性还存在很大的争议。已有的研究中对种子中Pantoea的组成及功能研究十分有限。
P. dispersa在本研究中分布在所有测试的水稻种子中，并发现具有溶磷、产IAA和铁载体的功能，但其中2株发现具有溶血现象。已有研究报道，在高粱、病人的血液以及土壤中分离到过该类群，并且对葡萄和甘蔗作物具有致病性，但对人的致病性还尚未确定[13]。从水稻种子分离的内生菌P. dispersa VWB2发现具有产IAA、抑制病原真菌F. oxysporum以及溶解磷的作用[14]；Selvakumar等发现分离自土壤中的一株P. dispersa具有很强的促生功能[15]。可见，P. dispersa存在是十分广泛的，并被许多研究者进行了深入探究。
P. agglomerans是泛菌中研究最为广泛的一类菌，也是泛菌属在自然界中分布最广的一类。据统计，P. agglomerans从16种植物、14种昆虫、9种动物和人的8个不同生病部位、水体以及土壤等环境中均有发现，其功能也多种多样。已发现该类群的菌株具有解磷能力和分泌IAA的能力，并且能够显著地促进水稻生长[16-18]，同时该类群也是20多种植物病害的生防菌；但同时又对许多植物种类造成严重病害，如造成水稻稻谷褐变[19-20]、玉米茎褐腐病[21]、杨树细菌性溃疡病[22]、棉花烂铃病[23]、香蕉叶鞘腐败病[24]等。此外，该类群发现与人的15种以上的疾病相关。从本研究的23株P. agglomerans中，发现大部分菌株具有产IAA和溶磷的能力，未筛选到具有拮抗真菌病原菌的功能，也未检测到产铁载体的能力。其中有一株菌具有溶血现象，可能为潜在的人畜病原菌。
P. brenneri已有报道均分离自临床材料如伤口、痰液中等，但未发现对人或者其他动植物的致病性。本研究从两个品种的水稻种子中分离到24株该类群的菌种，且发现大部分菌株具有溶磷功能，其中菌株Z19-38能力最强。同时还发现该类菌具有产IAA和铁载体的功能，并没有发现溶血现象。
P. cypripedii已有报道主要分离自植物中，并发现一株分离自Stevia rebaudiana根际土壤的该类群菌株具有高效的溶磷能力[25]，近期报道在昆虫Kerria lacca分泌的蜜汁中分离到该类群的菌株，但功能未知[26]。本研究仅从一个品种的水稻种子中分离到该类群菌株，且发现具有溶磷、产IAA和铁载体的功能，未发现溶血特性。
在此基础上，本研究还进一步分析了8个水稻品种基因型和表型性状与泛菌组成的关系，因样品的数量所限，目前尚未发现二者存在着明显的相关性。还需后续增加更多的水稻样品进行深入探究。
综上所述，Pantoea是广泛存在于自然界并且功能多样的一类细菌，结合本研究的结果及已有的报道，可以看出植物种子选择性地积累了Pantoea类群，从植物与微生物长期共进化的角度来讲，植物应该选择对本身有益的微生物类群传递给下一代并在种子萌发及成长过程中发挥重要作用[27]。本研究的创新点在于首次对分离自水稻种子内生的Pantoea菌株进行系统分析，描述其分类地位、分布特征以及其功能特性。进一步的研究将从种子中Pantoea菌株的作用方式、传播途径以及比较基因组等方面进行更深入的探究。
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