张鹏飞1, 李小连2, 王自强2, 袁向华1, 李建军2,3
, 杜昱光2,3 1.四川师范大学生命科学学院, 四川 成都 610101;
2.中国科学院过程工程研究所, 生化工程国家重点实验室, 国家生化工程技术研究中心(北京), 北京 100090;
3.中国科学院过程工程研究所, 全军生物药制造与剂型工程重点实验室, 北京 100090
收稿日期：2017-04-14；修回日期：2017-06-07；网络出版日期：2017-07-21
基金项目：国家“863计划”（2014AA093511）
*通信作者：李建军, Tel/Fax:+86-10-82545039, E-mail:jjli@ipe.ac.cn
杜昱光, Tel:+86-10-82545070, Fax:+86-10-82545039, E-mail:ygdu@ipe.ac.cn
摘要：[目的]内切甘露聚糖酶是一类重要的半纤维素酶，能够有效水解半纤维素的第二大组分甘露聚糖，已广泛应用于工业生物技术领域。[方法]本文对来源于腐生真菌构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的一个内切甘露聚糖酶在毕赤酵母中进行过表达及详细的酶学性质研究。[结果]该甘露聚糖酶在摇瓶和发酵罐条件下都成功获得表达，发酵罐条件下的蛋白质表达量高达3.9 mg/mL；该酶的最适pH和温度分别为4.0和60，在pH 5.0–9.0之间表现出了很好的稳定性；在温度≤40时，该酶非常稳定，当温度≥60，该酶的稳定性大大降低；Co2+和Zn2+促进了该酶的活性，而Pb2+、Cu2+、Mn2+等金属离子表现出了一定的抑制作用。[结论]该构巢曲霉来源的内切甘露聚糖酶能在毕赤酵母中高效表达，表现出了一定的耐酸、耐碱及耐热等性能，具有开发为商品酶的潜力，为深入开发构巢曲霉来源的其他糖苷酶奠定了基础。
关键词： 构巢曲霉 β-1, 4-甘露聚糖酶 酶学性质 二价金属离子 发酵
Overexpression and characterization of endo-β-1, 4-mannanase from Aspergillus nidulans in Pichia pastoris
Pengfei Zhang1, Xiaolian Li2, Ziqiang Wang2, Xianghua Yuan1, Jian-Jun Li2,3
, Yuguang Du2,3 1.College of Life Sciences, Sichuan Normal University, Chengdu 610101, Sichuan Province, China;
2.National Key Laboratory of Biochemical Engineering, National Engineering Research Center for Biotechnology(Beijing), Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100090, China;
3.Key Laboratory of Biopharmaceutical Production & Formulation Engineering, PLA, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100090, China
Received 14 April 2017; Revised 7 June 2017; Published online 21 July 2017
*Corresponding author: Jianjun Li, Tel/Fax:+86-10-82545039, E-mail:jjli@ipe.ac.cn
Yuguang Du, Tel:+86-10-82545070, Fax:+86-10-82545039, E-mail:ygdu@ipe.ac.cn
Supported by the National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (2014AA093511)
Abstract: [Objective]Endo β-1, 4-mannanases play important roles in hydrolysis of the β-1, 4 glycosidic linkages in mannans and heteromannans, the second most abundant hemicellulosic polysaccharides in nature.[Methods]In this study, we overexpressed and characterized an endo β-1, 4-mannanase from Aspergillus nidulans in Pichia pastoris.[Results]A β-1, 4-mannanase was successfully overexpressed in flasks and fermentor, and the yield of overexpressed protein in fermentor reached 3.90 mg/mL. The optimal pH and temperature of the enzyme were 4.0 and 60 respectively, and it was very stable over the pH ranges from 5.0 to 9.0. It was thermally stable below 40, whereas it was inactivated very quickly above 60. Its enzyme activities could be enhanced by Co2+ and Zn2+, whereas it was inhibited by Pb2+, Mn2+ and Cu2+.[Conclusion]This endo-β-1, 4-mannanase could be well produced by Pichia pastoris, and has a potential as commercial enzymes for application.
Key words: Aspergillus nidulans β-1, 4-mannanase enzymological properties divalent metal ion fermentation
甘露聚糖类物质作为半纤维素的第二大组分，在自然界里广泛存在[1-2]。甘露聚糖的主链主要是以1, 4-β-D-吡喃甘露糖苷键连接而成的线性结构，在线性多糖的侧链上有葡萄糖基、半乳糖基等取代基，形成甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖等。β-1, 4-甘露聚糖酶(β-1, 4-mannanase，EC.3.2.1.78)是一类能够水解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖等以β-1, 4-D-甘露吡喃糖为主链的甘露聚糖的内切水解酶，属于半纤维素酶类[1-6]。按照最适pH值的不同，β-1, 4-甘露聚糖酶可分为酸性、中性、碱性等[3-4]。根据氨基酸序列及蛋白质的结构特点(即按照糖活性酶数据库：CAZy Database，Carbohydrate-Active enZYmes Database)，β-1, 4-甘露聚糖酶被划分为糖苷水解酶家族5、9、26、44、113等[7]。β-1, 4-甘露聚糖酶的应用非常广泛，已被用于食品、饲料、医药、造纸、纺织印染、石油开采、生物能源、生物基化学品等诸多领域，具有很大的应用价值[1-6]。
β-1, 4-甘露聚糖酶来源广泛，主要存在于细菌、真菌、植物以及无脊椎动物中[1-6, 8-12]。微生物是β-1, 4-甘露聚糖酶的重要来源，具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等优点。但天然微生物所产的β-1, 4-甘露聚糖酶产量低，不能满足工业化生产的需要。随着分子生物学的发展，许多β-1, 4-甘露聚糖酶基因已被成功克隆并进行了异源表达(大肠杆菌、芽孢杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、克鲁维酵母等表达系统)、表征[8-9, 13-16]。
腐生真菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans)能降解多种多糖，和基因组测序的结果一致：该真菌编码多种降解多糖的基因[17-18]。来源于构巢曲霉的72个糖苷酶已被Bauer等克隆并成功在毕赤酵母中表达，但是Bauer等仅对部分糖苷酶进行了简单表征[18]。
由于β-1, 4-甘露聚糖酶的广泛应用，寻找新型、高效、稳定的β-1, 4-甘露聚糖酶一直是工业酶制剂的热点之一。构巢曲霉一共编码了4个β-1, 4-甘露聚糖酶，其中β-1, 4-甘露聚糖酶C6 (GenBank accession number AN3358.2)对刺槐豆胶(locust bean gum)和瓜尔豆树胶(gum guar)表现出了最高酶活[18]。本文对该β-1, 4-甘露聚糖酶进行了表达(摇瓶与发酵罐)与详细表征(最优pH与温度，pH与热稳定性，二价金属离子对酶活的影响)。另外，虽然构巢曲霉编码了72个糖苷酶基因，但是对构巢曲霉来源糖苷酶研究的报道还比较少。因此，本文对β-1, 4-甘露聚糖酶C6的酶学性质研究将为构巢曲霉来源其他糖苷酶的深入研究与应用开发奠定基础。
1 材料和方法 1.1 试剂 无氨基酸酵母氮源(Yeast Nitrogen Base W/O Amino acid，YNB)来自Difco公司；刺槐豆胶(locust bean gum，LBG)购自Sigma公司；其余试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 菌株与质粒 过表达来源于构巢曲霉的内切-β-1, 4-甘露聚糖酶C6 (GenBank accession number AN3358.2)的毕赤酵母来自美国真菌遗传保藏中心(Fungal Genetics Stock Center，FGSC)。
1.3 培养基
1.3.1 YPD活化培养基(g/L): 葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10；YPD平板，琼脂15。
1.3.2 BMGY生长培养基(g/L): YNB 13.4，甘油10，生物素0.0004，磷酸钾缓冲溶液0.1 mol/L，pH 6.0。
1.3.3 BMMY诱导培养基(g/L): YNB 13.4，甲醇0.5% (V/V)，生物素0.0004，磷酸钾缓冲溶液0.1 mol/L，pH 6.0。
1.3.4 发酵罐发酵培养基: (采用无机盐培养基，g/L)[19]，H3PO4 26.70，CaSO4 0.93，K2SO4 18.20，MgSO4·7H2O 14.90，KOH 4.13，甘油40 mL，PTM1 4.35 mL，pH 5.0，1.0×104 Pa灭菌30 min。
1.3.5 PTM1微量元素溶液(g/L): CuSO4·5H2O 6.00，KI 0.08，MnSO4·H2O 0.50，NaMoO4·2H2O 0.20，H3BO3 0.02，CoCl2 0.50，ZnCl2 20.00，FeSO4·7H2O 65.00，Biotin 0.20，H2SO4 5.00，混匀过滤除菌，4 ℃避光保存。
1.3.6 甘油补料培养基: 甘油50% (V/V)，PTM1 4.35 mL/L。
1.3.7 甲醇补料培养基: 甲醇100% (V/V)，PTM1 4.35 mL/L。
1.4 蛋白质的摇瓶表达
1.4.1 平板培养: 从甘油管中接菌并在YPD平板上划线，30 ℃培养3–4 d。
1.4.2 种子培养: 从YPD平板上挑单菌落并接种到BMGY中，250 mL三角瓶装50 mL培养基，30 ℃、200 r/min回转式摇床培养过夜。
1.4.3 诱导产酶: 当OD600达到3–4左右时，离心收集全部菌体，转入BMMY中，使OD600在1.0左右，250 mL挡板三角瓶(baffled flasks)装50 mL培养基，30 ℃、200 r/min培养，每24 h补加0.5 % (V/V)甲醇，诱导120 h。
1.5 蛋白质的发酵罐表达
1.5.1 种子培养: 从YPD平板上挑单菌落并接种到YPD培养基中，30 ℃、250 r/min振荡培养20 h，得到一级种子，再将一级种子10%接种到1 L的YPD培养基中，30 ℃、250 r/min振荡培养10 h，得到二级种子。
1.5.2 C6的发酵罐发酵培养: 将二级种子按10%的接种量接种至10 L发酵罐中，初始培养参数为：转速200 r/min，培养温度30 ℃，pH 5.0。随着菌体的生长，DO (Dissolved oxygen，溶氧量)逐渐下降，通过调节搅拌转速、通气量和罐压，使DO维持在20%–30%，发酵过程中采用氨水自动控制pH值在5.0。当DO回升时，按照20–36 mL/min的速度流加甘油，使菌体继续生长至湿重200 g/L左右，停止流加甘油。当DO回升至100%时，继续饥饿培养30 min，然后流加甲醇进行诱导，流加速度为：0–4 h，3.5 mL/(L·h)；5–24 h，逐渐提高流加速度到10 mL/(L·h)，并一直维持该速度至发酵结束。发酵过程中，每隔一定时间取样检测，测定发酵液的光密度OD600及菌体湿重，并留上清用于蛋白质的SDS-PAGE及活性分析和观察。
1.6 OD600及细胞湿重的测定 发酵液稀释后于波长600 nm处进行比色测定，OD600=OD600读数×稀释倍数；取4 mL发酵液在10000 r/min离心10 min，吸尽上清液后，称得的细胞重量换算为每升的克数即细胞湿重。
1.7 SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测 为了检测内切-β-1, 4-甘露聚糖酶C6的表达情况，采用SDS-PAGE检测，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%，用考马斯亮蓝G-250染色。
1.8 蛋白质浓度测定 参照Bradford的方法采用考马斯亮蓝G-250法进行可溶性蛋白质含量测定。以牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白质，配制标准溶液，制作标准曲线[20]。
1.9 酶活分析 参考饲料行业对甘露聚糖酶的酶活分析方法，对甘露聚糖酶C6进行酶活分析。使用0.3% (W/V)的LBG (locust bean gum，刺槐豆胶) (Sigma G0753)作为底物，加入一定量、稀释过的酶，反应体积为1 mL (0.5 mL LBG，0.1 mL稀释酶液，0.4 mL pH 5.5醋酸钠缓冲溶液)，在37 ℃、pH 5.5 (0.1 mmol/L醋酸钠)的条件下反应15 min，加入1.5 mL DNS (3, 5-二硝基水杨酸)试剂终止反应，沸水浴加热5 min，用自来水冷却至室温，然后加入2.5 mL蒸馏水，以标准空白样为空白对照，在540 nm处测定吸光度。根据甘露糖的标准曲线计算还原糖的含量，并计算甘露聚糖酶的比酶活。1个酶活单位U定义为每分钟释放的还原糖等同1 μmol甘露糖所需要的酶量。所有的酶活测定都进行了3次平行试验。
1.10 最适反应pH与pH稳定性 使用0.3% (W/V)的LBG作为底物，在50 mmol/L、pH 2.0–12.0的B & R (Britton and Robinson)缓冲溶液中测定C6的最优反应pH。不同pH条件下的酶活测定都在37 ℃反应15 min，分别计算比酶活。
C6的pH稳定性按照下面的过程测定：首先把C6在4 ℃、不同pH值(pH 2.0–11.0)的缓冲溶液中分别孵育1、5、24、120 h，然后立即在标准条件下(最优pH 4.0、37 ℃，反应15 min)进行酶活分析。把C6在最优pH 4.0时的初始比酶活作为100%，在不同pH、时间点的残余比酶活和pH 4.0时的初始酶活进行比较，即得到不同pH、时间点的残余酶活的百分比。
1.11 最适反应温度与热稳定性 使用0.3% (W/V)的LBG作为底物，在50 mmol/L、最优pH 4.0的B & R缓冲溶液中测定C6的最优反应温度。不同温度下的酶活分析都进行15 min，分别计算比酶活。
C6的热稳定性按照下面的过程测定：首先把C6在不同温度(40、50、60、70 ℃等)、一定pH (C6最稳定)的缓冲溶液中分别孵育15 min、30 min、1 h及2 h，然后立即在标准条件下(最优pH 4.0、37 ℃，反应15 min)进行酶活分析。如果C6在某一温度失活速度太快，将在该温度孵育5、10 min等。把C6在在标准条件下的初始比酶活作为100%，在不同温度、时间点的残余比酶活和标准条件时的初始酶活进行比较，即得到不同温度、时间点残余酶活的百分比。
1.12 二价金属离子对酶活的影响 二价金属离子对C6酶活影响的分析过程：在上述标准酶活分析体系中，分别加入1 mmol/L的二价金属离子[Pb(CH3COO)2，NiSO4，MnSO4，CuSO4，BaCl2，ZnSO4，CoCl2，CaCl2，MgCl2，FeSO4]，在标准条件下(最优pH 4.0、37 ℃，反应15 min)进行酶活分析。把C6在标准条件下的初始比酶活作为100%，在添加不同金属离子时的比酶活和标准条件时的初始酶活进行比较，即得到添加不同金属离子时比酶活的百分比。
2 结果和分析 2.1 蛋白质的摇瓶表达 首先在摇瓶中培养过表达甘露聚糖酶C6 (GenBank accession number AN3358.2)的毕赤酵母，用0.5% (V/V)的甲醇连续诱导120 h，进行SDS-PAGE分析(图 1)。结果表明，在75 kDa左右出现明显条带。基于该蛋白质的氨基酸序列预测的分子量为41.8 kDa，75 kDa左右条带的分子量远高于预测分子量，可能是由于在毕赤酵母中表达蛋白质时的糖基化所致[21]。随着诱导时间的延长，目的蛋白质的表达量也逐渐增加。并通过酶活分析进一步验证。
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| 图 1 摇瓶表达C6的SDS-PAGE分析 Figure 1 SDS-PAGE analysis of overexpressed C6 in flasks. Lane 1, 2: protein marker; lane 3: induced with methanol for 0 h; lane 4: induced for 6 h; lane 5: induced for 24 h; lane 6: induced for 36 h; lane 7: induced for 48 h; lane 8: induced for 72 h; lane 9: induced for 96 h; lane 10: induced for 120 h. |
| 图选项 |
2.2 蛋白质的发酵罐表达 我们用10 L发酵罐(5 L发酵液)对甘露聚糖酶C6进行了大量表达。菌体的生长曲线如图所示。过表达甘露聚糖酶C6毕赤酵母工程菌株的生长曲线如图 2所示，菌体湿重和OD600的结果一致，随着发酵时间的延长，两者都呈现逐渐递增的趋势。当菌体湿重达到211 g/L即第41 h时开始用甲醇诱导，连续诱导76 h。从蛋白质的浓度变化来看(图 3)，随着诱导时间的延长，蛋白质的表达量呈现逐渐递增的趋势，117 h时发酵产量达到3.9 mg/mL。并进行了酶活分析。
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| 图 2 过表达C6工程菌体的生长曲线 Figure 2 Growth curve of engineered microorganisms overexpressing C6. |
| 图选项 |
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| 图 3 蛋白质表达量随时间的变化 Figure 3 Changes of protein concentrations over time. |
| 图选项 |
2.3 蛋白质的酶学性质分析
2.3.1 最适反应pH与pH稳定性: pH-活性曲线的结果表明(图 4)，pH 4.0时C6表现出了最高酶活，pH 3.0–8.0时酶活为最高酶活的50%以上，pH 2.0时酶活为最高酶活的31%，而当pH≥9.0时酶活大大降低，pH 11.0及pH 12.0时几乎测不到酶活。因此pH对C6的活性有非常大的影响，该酶为一酸性甘露聚糖酶。
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| 图 4 pH对酶活的影响 Figure 4 Effects of pH on enzyme activity. |
| 图选项 |
pH稳定性研究发现(图 5)，C6在pH 3.0–10.0时表现出了比较高的稳定性；pH 5.0–9.0时孵育5 d后，酶活仅失去20%左右；pH 3.0和pH 10.0时孵育5 d后，酶活丢失40%左右；pH 2.0时孵育1 h后，几乎完全失活；pH 11.0和pH 12.0时的温定性也非常差，孵育1 h后，酶活就失去60%以上，孵育5 d后，只保留10%左右的活性。
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| 图 5 C6的pH稳定性 Figure 5 Effects of pH on stability of C6. |
| 图选项 |
2.3.2 最适反应温度与热稳定性: 温度对C6酶活的影响见图 6。结果发现，60 ℃时C6表现出了最高活性；40–70 ℃时酶活为最高酶活的50%以上；25–35 ℃时活性为最高酶活的40%左右；在较高温度如75 ℃和80 ℃时，活性迅速降低，仅为最高活性的20%左右。
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| 图 6 温度对酶活的影响 Figure 6 Effects of temperature on enzyme activity. |
| 图选项 |
同时也考察了C6的热稳定性(图 7)。C6在40 ℃时非常稳定，孵育2 h后，几乎没有丢失活性；在50 ℃时也比较稳定，孵育2 h后，丢失20%左右的活性；在60 ℃时，C6孵育15 min后，失去40%左右的初始活性，而孵育2 h后，C6几乎完全失活；在70 ℃时，C6的失活速度加快，孵育15 min后，几乎完全失活。
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| 图 7 C6的热稳定性 Figure 7 Thermal stability of C6. |
| 图选项 |
2.3.3 金属离子对酶活的影响: 研究了二价金属离子对C6活性的影响(图 8)。结果发现，Co2+和Zn2+促进了C6的酶活，尤其Zn2+，使酶活提高了40%左右；Pb2+、Cu2+、Mn2+表现出了一定的抑制作用，尤其Pb2+，使酶活降低了40%左右；其他金属离子对酶活没有太大影响。
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| 图 8 金属离子对酶活的影响 Figure 8 Effects of metal ions on enzyme activity. |
| 图选项 |
3 讨论 内切甘露聚糖酶作为一种重要的半纤维素酶，由于在工业生物技术领域的重要性，得到普遍重视和深入研究。从产酶菌种的筛选、诱变、诱导表达、纯化等，到利用基因工程和蛋白质工程技术，在基因克隆、蛋白质表达、酶学性质及蛋白质工程等方面进行了广泛的研究[1-6]。
文献对来源于棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、硫色曲霉(Aspergillus sulphureus)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、费氏新萨托菌(Neosartorya fischeri)、双孢叶腹菌(Bispora)等真菌内切甘露聚糖酶的研究已经非常多[10, 14-15, 22-26]。相比而言，对来源于构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的甘露聚糖酶及其他糖苷酶的研究还比较少。构巢曲霉也是一种重要的丝状真菌，能够降解多种多糖，按照基因组序列，至少编码了72种糖苷酶基因。虽然研究者们已经克隆、表达、纯化了一些来自构巢曲霉的糖苷酶，但是针对这些糖苷酶的酶学性质研究(包括最优pH与温度，pH与热稳定性，金属离子对酶活的影响，等等)还比较少[18, 27-29]。本文比较系统研究了构巢曲霉来源的内切-β-1, 4-甘露聚糖酶C6 (GenBank accession number AN3358.2)的酶学性质。
不同微生物来源的内切甘露聚糖酶表现出了不同的酶学性质。构巢曲霉来源内切-β-1, 4甘露聚糖酶C6的最适pH为4.0，属于酸性内切甘露聚糖酶，而文献报道的最适pH为5.5[18]；该酶的最适反应温度为60 ℃，和文献报道的最优温度52 ℃比较接近[18]；该酶在pH 5.0–9.0时表现出了非常高的稳定性，孵育5 d后，酶活仅失去20%左右；而在强酸和强碱条件下，尤其强碱条件下，稳定性大大降低；该酶在40 ℃时表现出了非常高的稳定性，但是在≥60 ℃时该酶的耐热性大大降低。来自嗜酸双孢叶腹菌MEY-1的内切甘露聚糖酶的最适pH及温度分别为1.0–1.5和65 ℃，表现出了很强的嗜酸性，在很宽的pH范围(pH 1.0–12.0)及温度≤60 ℃时非常稳定[15]；来源于嗜热费氏新萨托菌P1的内切甘露聚糖酶在pH 4.0和80 ℃表现出了最高活性，在pH 2.0–12.0及温度≤60 ℃时表现出了很高的稳定性[10]；纤维微杆菌属HY-13来源的内切甘露聚糖酶在50 ℃和pH 6.0时酶活最高，在pH 5.5–9.0时比较稳定，但是在50 ℃的热稳定性较差[9]。地衣芽孢杆菌DSM13来源的内切甘露聚糖酶的最优反应pH及温度分别为pH 6.0–7.0和50–60 ℃，在pH 6.0–9.0及温度≤50 ℃时比较稳定[8]。可以看出，内切甘露聚糖酶的最优pH和温度以及pH和热稳定性等性能和微生物的来源环境紧密相关，将为内切甘露聚糖酶应用于不同生物技术领域提供指导。
众所周知，金属离子作为一种辅酶因子或抑制因子对酶的水解有很大的影响。本研究发现：Co2+和Zn2+促进了C6的酶活，尤其Zn2+，使酶活提高了40%左右；而Pb2+、Cu2+、Mn2+等金属离子对C6有一定的抑制作用，Pb2+使酶活降低了40%左右。同样有研究报道Co2+促进了来源于嗜酸真菌双孢叶腹菌MEY-1及纤维微杆菌属HY-13的内切甘露聚糖酶的活性，但是对来自嗜热真菌费氏新萨托菌P1的内切甘露聚糖酶有抑制作用，而对环状芽胞杆菌CGMCC1554来源的内切甘露聚糖酶活性没有影响[15, 9-10, 29]；Zn2+促进了嗜酸双孢叶腹菌MEY-1来源内切甘露聚糖酶的酶活，而抑制了来自嗜热费氏新萨托菌P1、环状芽胞杆菌CGMCC1554及纤维微杆菌属HY-13的内切甘露聚糖酶的活性[9-10, 15, 30]；Pb2+在较高浓度(10 mmol/L)时对嗜酸双孢叶腹菌MEY-1来源的内切甘露聚糖酶有一定的抑制作用[15]；Cu2+抑制了来自嗜热真菌费氏新萨托菌P1、环状芽胞杆菌CGMCC1554、纤维微杆菌属HY-13的内切甘露聚糖酶的活性，促进了嗜酸真菌双孢叶腹菌MEY-1来源的内切甘露聚糖酶的酶活[9-10, 15, 30]；Mn2+促进来自嗜热费氏新萨托菌P1、嗜酸双孢叶腹菌MEY-1、纤维微杆菌属HY-13的内切甘露聚糖酶的活性[9-10, 15]。因此，综合上述结果表明，不同金属离子对内切甘露聚糖酶活性有不同程度的影响，同一种金属离子对不同微生物来源的内切甘露聚糖酶有不同程度的影响。但是，关于金属离子影响内切甘露聚糖酶活性的确切机制仍然不清楚[31]。
构巢曲霉来源的内切甘露聚糖酶C6在毕赤酵母中高效表达，酶活也比较高，并且表现出了一定的耐酸、耐碱及耐热等性能，因此具有开发为商品酶的潜力。同时，本研究也将拓宽人们对构巢曲霉来源糖苷酶的认识，将为构巢曲霉来源其他糖苷酶的深入研究以及应用开发提供指导。
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