刘开辉1, 丁小维1
, 张波1, 唐小飞1, 肖敏2, 鲜文东2, 李文均2 1.陕西理工大学生物科学与工程学院, 陕西 汉中 723001;
2.中山大学生命科学大学院, 有害生物控制与资源利用国家重点实验室, 广东 广州 510275
收稿日期：2017-01-13；修回日期：2017-02-19；网络出版日期：2017-03-17
基金项目：国家自然科学基金（31100017）；陕西理工大学科研项目（SLGQD16-06）
作者简介：李文均，中山大学生命科学学院****/珠江********，博士生导师。1996年于河南师范大学生物系获学士学位；1999年于云南大学生命科学学院获硕士学位；2002年毕业于中国科学院沈阳应用生态研究所获博士学位；1999–2014年曾在云南大学云南省微生物研究所工作。现任国际原核微生物系统学委员会(nternational Committee on Systematics of Prokaryotes，ICSP)国际执委；伯杰氏国际系统微生物学会(BISMiS)创始会员。兼任中国青年科技工作者协会常务理事、中国微生物学会微生物教学工作委员会副主任委员、中国微生物学会普通微生物专业委员会委员、中国微生物学会分子微生物学与生物工程专业委员会委员、微生物资源专业委员会委员。Antonie van Leeuwenhoek、Frontiers in Microbiology、BioMed Research International、The Scientific World Journal、Journal of Arid Land、BISMiS Bulletin、《微生物学报》、《微生物学杂志》等杂志编委及多个国内外期刊的通讯评审专家。主要从事高温、高盐等极端环境微生物分类及系统学，微生物生态学，极端酶学研究，实验室主页：http://www.liactlab.com/index.html
*通信作者：丁小维, Tel/Fax:+86-20-84111727, E-mail:dxw518@163.com
李文均, Tel/Fax:+86-20-84111727, E-mail:liwenjun3@mail.sysu.edu.cn
摘要：[目的]本研究揭示云南腾冲热海热泉真菌多样性及群落分布格局，探讨其理化因子对真菌群落结构的影响。[方法]利用Illumina HiSeq2500高通量测序平台对腾冲热海热泉沉积物宏基因组ITS基因进行测序，并进行生物信息分析。[结果]从5个热泉样品中共检测到343484条有效序列，包括5个真菌门，20个纲，66个目。右姐妹泉（JMQR）、左姐妹泉（JMQL）、蛤蟆嘴泉（M）、桥泉（QQ）及鼓明泉（GMQP）分别以Agaricales、Eurotiales、Capnodiales和Hypocreales等为优势目。在属水平上，共获得365个属，从JMQR中检测到212个属，以裂褶菌属（Schizophyllum）为最优势；从JMQL中挖掘到197个属，以青霉属（Penicillium）为最优势类群；从M和QQ中分别获得222个和270个属，均以枝孢属（Cladosporium）为最优势；从GMQP中发现179个属，以侧齿霉属（Engyodontium）丰度最高。NH4+含量、温度及pH影响不同优势真菌的分布，其中以pH与优势类群（OTU>1%）结构变化显著性最高（P=0.05）。[结论]云南腾冲热海高温热泉蕴藏着极其丰富的真菌物种，其不同样品真菌分布具有差异性，pH可能是影响热泉真菌群落分布的重要因素之一。
关键词： 腾冲热海热泉 真菌多样性 高通量测序
High-throughput sequencing to reveal fungal diversity in hot springs of Rehai at Tengchong in Yunnan
Kaihui Liu1, Xiaowei Ding1
, Bo Zhang1, Xiaofei Tang1, Min Xiao2, Wendong Xian2, Wenjun Li2 1.School of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723001, Shaanxi Province, China;
2.State Key Laboratory of Biocontrol, School of Life Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510275, Guangdong Province, China
Received 13 January 2017; Revised 19 February 2017; Published online 17 March 2017
*Corresponding author: Xiaowei Ding, Tel/Fax: +86-20-84111727, E-mail:dxw518@163.com
Wenjun Li, Tel/Fax:+86-20-84111727, E-mail:liwenjun3@mail.sysu.edu.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31100017) and by the Shaanxi University of Technology Project (SLGQD16-06)
Abstract: [Objective]Fungal diversity and community structures were revealed in Rehai hot springs in Tengchong, Yunnan, and effects of sediment geochemical properties on fungal distribution were analyzed.[Methods]Fungal ITS genes were detected in the sediment metagenomes by high-throughput pyrosequencing and bioinformatic analysis.[Results]Total 343484 valid reads from 5 hot springs were obtained, and these reads included 5 phyla, 20 classes, and 66 orders. The hot springs Jiemeiquan right (JMQR), Jiemeiquan left (JMQL), Hamazui (M), Qiaoquan (QQ) and Gumingquan (GMQP) were dominated by communities such as Agaricales, Eurotiales, Capnodiales, and Hypocreales. A total of 365 genera were discovered in the hot springs studied. There were total 212 genera detected in JMQR, 197 in JMQL, 222 in M, 270 in QQ, and 179 in GMQP. Schizophyllum was a dominant genus of fungal community in JMQR, and Penicillium was highly frequent in JMQL. Cladosporium dominanted fungal community in M and QQ, and Engyodontium was highly rich in GMQP. The geochemical variables such as NH4+, temperature, and pH, exerted effects on distribution of different dominant fungi in the hot springs. The pH in the hot springs had significant effect on fungal community composition.[Conclusion]Rehai hot springs in Tengchong, Yunnan, harbor surprisingly fungal diversity. Fungi in different samples had distinct community structures. The pH in the hot springs could be one of the factors determining the fungal community.
Key words: Tengchong hot spring fungal diversity pyrosequencing
真菌是全球生物多样性的重要组成部分，并在物质循环、能量流动等生态过程中发挥重要作用。据估计，地球上可能至少存在510多万种真菌[1]，这些资源无疑是人类最宝贵的财富之一。真菌几乎存在于地球的各类生态环境中，如土壤、水体、粪肥、动植物体内及大气中。由于纯培养技术的不足，人类所认识的真菌多样性非常有限，环境中大量的真菌物种仍处于“未知”的状态。由于全球环境的变化，真菌物种多样性可能在锐减。为了发现“新的”真菌资源，一方面利用免培养技术如DGGE[2]、高通量测序等探测环境微生物，另一方面可挖掘极端环境如盐碱湖[3]、深海[4]、热泉[5]等环境中蕴藏的真菌资源。
在地球上广泛分布着热泉、火山口及堆肥等极端高温环境。这些环境中的嗜热微生物在生命进化历程中，由于高温环境的选择作用，形成独特的群落结构、遗传特性及生理代谢机制，因具有重要的科学和应用价值而成为微生物学研究的热点之一[6]。近年来，研究人员利用高通量测序对热泉中的细菌、古菌群落结构进行分析，并对其微生物群落结构的影响因素进行分析[7-9]。Colman等[9]报道了美国黄石公园的浮游生物群落结构，发现pH和温度影响上述微生物的群落组成。Hou等[10]系统研究云南腾冲热海热泉沉积物细菌、古菌多样性，认为其优势群体可能受pH和温度影响。Jiang等[11]发现除温度外，腾冲热海姊妹泉中的硫、砷含量及可溶性氧气均影响细菌群落结构。目前，利用高通量测序研究热泉微生物主要集中在细菌、古菌方面，而有关嗜热真菌仍未见报道。
云南腾冲县蕴藏着丰富的地热资源，境内热泉遍布各地，其中以热海区热泉最具代表性。本研究通过高通量测序分析该地区热泉沉积物真菌群落格局及物种多样性，探测到极其丰富的真菌物种，并分析影响真菌群落结构的因素，为再认识真菌适应高温的“边界”及其资源的发掘提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 样品采集 热泉样品于2014年6月分别采自云南腾冲热海区桥泉(QQ)、左姐妹泉(JMQL)、右姐妹泉(JMQR)、鼓明泉(GMQP)及蛤蟆嘴泉(M)底沙土沉积物，并置放于50 mL无菌离心管中。采集的样品迅速放入液氮中冷冻，用干冰盒带回实验室，置于-80 ℃冰箱中保存，用于宏基因组DNA的提取。为了探究热泉一些地化因素对真菌分布的影响，本研究选择的热泉区其pH、温度、S2-及NH4+参数均呈现出明显的梯度特征，并对上述因子进行原位测定，数据如表 1所示。
表 1. 热泉样品地化信息 Table 1. Geochemical information of hot spring samples
| Sample | pH | T/℃ | c(S2-)/(μg/L) | c(NH4+)/(mg/L) |
| 6.22 | 75.6 | 4 | 0.97 | |
| M | 7.88 | 75.1 | 202 | 0.13 |
| JMQL | 9.00 | 90.4 | 4990 | 1.26 |
| GMQP | 9.05 | 84.5 | 3480 | 1.19 |
| JMQR | 9.09 | 83.4 | 3010 | 1.66 |
表选项
1.2 宏基因组DNA提取 约10.0 g热泉沙土样品经充分混匀，并于液氮中反复研磨。各称取0.5 g经研磨的样品，利用Fast DNA? Spin Kit for Soil (MP Biomedicals)土壤DNA提取试剂盒，依说明书抽提并纯化热泉沉积物微生物基因组总DNA。每个样品的DNA完成3次重复抽提，合并后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的基因组DNA。
1.3 ITS基因的扩增及Illumina HiSeq高通量测序 由于真菌ITS2区在揭示属间、属内及近似种的关系中具有十分突出的种类覆盖度和良好的多样性深度，能较准确探测出环境样品真菌的群落结构，因此本研究选用特异性引物ITS2-F：GCATC GATGAAGAACGCAGC；ITS2-R：ATATGTAGGA TGAAGAACGYAGYRAA用于扩增真菌ITS2区，用于扩增不同样品的ITS2-F引物融合了7个碱基的barcode序列，以区别不同来源的ITS序列。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。PCR反应体系(25 μL)：2×PCR buffer 12.5 μL，dNTPs (10 mmol/L) 0.5 μL，基因组DNA 100 ng，ITS2-F/R (50 μmol/L)各1 μL，Taq (5 U/μL) 0.5 μL及8.5 μL的ddH2O。同一样品的PCR产物合并后经电泳检测，通过胶回收试剂盒进行纯化。对PCR产物进行定量并均一化，构建ITS测序文库，利用Illumina HiSeq2500平台进行高通量测序。
1.4 数据分析 利用Mothur软件分别去除长度小于200 bp序列、平均质量分值低于25的序列、含有模糊碱基、化学嵌合体及barcode序列中含有错配碱基的序列以获得有效序列(tags)，并进行去冗余处理，从中挑选出unique tag序列[12]。基于Na?ve Bayesian方法的分类器RDP classifier对序列进行物种注解，选择Confidence Threshold (bootstrapping)参数为0.5进行物种分类。根据97%的序列相似度对有效序列进行同源比对，并对操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTUs)进行聚类，计算香农指数(Shannon Index)、ACE指数、Chao1指数及文库覆盖率(Coverage)。根据OTU的表达谱数据，利用R语言绘制热图。利用Canoco软件分析热泉环境因子对真菌群落的影响，利用Bray-Curtis分析环境因子对真菌群落影响的显著性。
2 结果和分析 2.1 测序结果 去除不合格序列后，5个热泉样品中共获得343484条有效序列(表 2)，其中从GMQP、JMQL、JMQR、M及QQ中分别获得80026、60813、82345、86815和33485条有效序列，基于97%相似度其OTUs数量分别为3003、3669、2689、4099和4198，组装出来的片段中位的片段长度N50为344-360 bp，ACE指数在10200.5-18936.6，npShannon指数在3.6-5.6之间，文库覆盖率在92.2%-98.0%，说明测得的OTU能基本反映所研究的腾冲热海热泉样品真菌的群落组成。
表 2. 热泉样品测序数据统计分析 Table 2. Sequencing data of hot spring samples
| Sample | Tags | OTUs | N50 | ACE | npShannon | Coverage/% |
| GMQP | 80026 | 3003 | 356 | 11268.8 | 4.1 | 97.9 |
| JMQL | 60813 | 3669 | 355 | 13757.0 | 4.1 | 96.5 |
| JMQR | 82345 | 2689 | 352 | 10200.5 | 3.6 | 98.0 |
| M | 86815 | 4099 | 360 | 14869.2 | 5.6 | 97.2 |
| 33485 | 4198 | 344 | 18936.6 | 5.6 | 92.2 |
表选项
2.2 腾冲热泉真菌多样性及群落格局分析 利用RDP classifier分类器对OTU依次进行门(Phylum)、纲(Class)、目(Order)、科(Family)及属(Genus)水平上的物种分类注释。从云南腾冲热海5个热泉样品中共检测到5个真菌门，包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌类(Zygomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)及球囊菌门(Glomeromycota)，其中以子囊菌为优势菌群，约占OTUs总数的83.6%，担子菌次之约为16.1%，其余类群丰度合计约为0.1%。从上述样品中检测到20个纲，其中座囊菌纲(Dothideomycetes)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、伞菌纲(Agaricomycetes)及酵母纲(Saccharomycetes)等为优势纲，分别占OTUs的30%、26%、22%、13%和4%。
除了未知真菌群体外，从5个热泉中共检测到66个目，在图 1-A中，从JMQR中获得47个目，Agaricales、Eurotiales、Pleosporales、Capnodiales及Trichosphaeriales为优势类群，分别占该热泉真菌OTU的27%、25%、21%、6%及5%；在JMQL泉中获得46个目，优势类群如Eurotiales (60%)、Hypocreales (8%)、Pleosporales (7%)、Capnodiales (6%)、Agaricales (6%)；热泉M中共发现45个目，优势类群Capnodiales占28%，次之为Eurotiales (16%)、Hypocreales (15%)、Pleosporales (13%)及Saccharomycetales (8%)；在热泉QQ中共检测到60个目，其中超过5%的优势类群如Capnodiales (28%)、Pleosporales (19%)、Eurotiales (13%)、Hypocreales (5%)及Agaricales (5%)；热泉GMQP中发现41个目，以Hypocreales为优势群体(45%)，次之为Pleosporales (15%)、Eurotiales (14%)、Capnodiales (9%)。
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| 图 1 热泉样品真菌类群目(A)和属(B)水平分布图 Figure 1 Order-(A), genus-level (B) distribution of fungi in hot samples from Tengchong, Yunnan. At each rank, fungal sequences that were not identified into anyone in databases were 'Unclassified'; rare groups shown as 'others'. |
| 图选项 |
从5热泉样品中共检测365个真菌属，不同样品在真菌属水平上分部格局如在图 1-B所示，热泉JMQR中获得212个属，其中优势类群包括裂褶菌属(Schizophyllum)占27%、青霉属(Penicillium) 22%、茎点霉属(Phoma) 10%、链格孢属(Alternaria) 9%、黑孢属(Nigrospora) 5%及枝孢属(Cladosporium) 5%；JMQL热泉中共检测到197个属，优势属如Penicillium占61%、侧齿霉属(Engyodontium) 6%、Schizophyllum为6%及Cladosporium为5%；在M中获得222个属，以Cladosporium (21%)、Engyodontium (13%)、Aspergillus (11%)、Saccharomyces (7%)、Penicillium (5%)及Devriesia (5%)为优势属；在QQ中获得270个属，优势属如Cladosporium (21%)、Engyodontium (13%)、曲霉(Aspergillus)占11%、酵母属(Saccharomyces)占7%、Penicillium (5%)及Devriesia为5%；从GMQP中发现179个属，优势属包括Engyodontium、Penicillium、拟盾壳霉属(Paraconiothyrium)及Cladosporium，分别占微生物OTU的46%、13%、6%和5%。上述研究结果表明在高温热泉环境中蕴藏着极其丰富多样的真菌类群。
2.3 腾冲热泉真菌群落结构相似度分析 根据OTU的丰度数据，热图可在属水平上将不同丰度的OTU分块聚类，并根据颜色梯度反映不同样品的物种群落相似性、差异性及物种聚类关系展示样本关系。本研究选择不同热泉样的丰度高的前30个真菌属，利用R语言绘制热图(图 2)，JMQL和QQ类聚为一个分支，其他3个热泉样GMQP、JMQR及M分别同该分支类聚。JMQL和QQ分别以Penicillium和Cladosporium丰度最高，GMQP以Engyodontium丰度最高，JMQR和M分别以Schizophyllum和Cladosporium最丰富。除了上述最丰富类群在不同热泉样品中显著富集外，其余多数真菌属在不同样品中的丰度具有相似性。
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| 图 2 不同热泉样品真菌的热图分析 Figure 2 Heatmap of different samples from hot springs in Tengchong, Yunnan. |
| 图选项 |
2.4 环境因子对热泉真菌群落结构的影响 为了分析腾冲热海热泉土壤沉积物理化因子对真菌群落格局的影响，本研究进行典型对应分析，结果如图 3所示。热泉沉积物S2-、NH4+、温度及pH矢量箭头之间夹角为锐角，表明这4种理化因子之间可能具有协同效应；样品JMQR、JMQL和M同NH4+相关性最高，QQ和GMQP同pH相关性最高；Alternaria、Nigrospora、Penicillium、Phoma和Schizophyllum同NH4+含量变化相关性最高，Cladosporium同温度变化相关性最高，Aspergillus、Saccharomyces和Engyodontium同样品pH值相关性最高。
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| 图 3 真菌群落与环境因子的典型对应分析 Figure 3 RDA showing associations between environmental variables and fungal genera. |
| 图选项 |
为进一步分析热泉环境因子对真菌群落结构的影响，本研究选择热泉2个关键的环境变量pH和温度分别同热泉样品中OTU丰度大于1%的所有优势属[13]进行Bray-Curtis分析，结果如图 4所示，样品pH对优势属群落结构的影响显著性最高(P=0.05)，其相关性r=0.491，然而，温度对OTU丰度大于1%的群体结构影响不显著(P=0.751)，表明pH可能是影响腾冲热海热泉真菌群落分布的重要因素之一。
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| 图 4 pH和真菌优势群体的Bray-Curtis分析 Figure 4 Bray-Curtis dissimilarity of pH and fungal dominant genera. |
| 图选项 |
3 讨论 微生物在自然界中常以群落的形式存在，承担着地球物质生物化学循环的重要角色，因此微生物群落结构及功能特征的探究已成为微生物生态学研究的热点。长期以来，由于纯培养技术的局限性使我们对微生物种类、丰度及其随环境变化的驱动规律的认识很不全面，对群落生态功能及其代谢机制方面了解更少[14]。近年来，随着高通量测序技术的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。尤其是Illumina Hiseq 2500高通量测序平台的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序分析，能灵敏地探测出环境真菌群落组成随环境因子时空变化而发生的响应。因此，该技术在微生物群落结构及多样性研究方面深受****认可[15-17]。
本研究通过高通量测序分析腾冲热海5个热泉真菌群落结构及物种多样性，共获得343484条有效序列，经分析获得5个真菌门、20个纲，以子囊菌门为最优势类群。Mouchacca[18]认为嗜热真菌主要包括Mucorales、Eurotiales、Sphaeriales、Hyphomycetes和Agonomycete这5个目，然而我们从腾冲热海样品中共检测到66个真菌目、365个属，以Schizophyllum、Penicillium及Phoma属为JMQR热泉的优势类群；Penicillium则主导JMQL热泉的真菌群落结构；Cladosporium在M热泉中丰度最高，Engyodontium和Aspergillus次之；GMQP泉以Engyodontium为最优势真菌。除了丰度最高的类群外，OTU > 1%的所有优势属在不同热泉样品中的组成及其丰度也存在差异，暗示环境变量驱动热泉真菌的群落格局，这与环境因子影响热泉原核微生物群落结构的结论一致[8-11]。Redman和Chen等研究发现Penicillium和Aspergillus是地热生态环境中可培养数目最多的微生物[5, 19]。Pan等[20]采用纯培养技术从腾冲热海3个碱性热泉中分离到8个真菌属，如Chaetomium、Coprinopsis、Malbranchea、Rhizomucor和Talaromyces等，以Talaromyces为最优势群体。其中Talaromyces和Chaetomium在该研究的5个高温热泉中均被检测到，而Coprinopsis仅在JMQL、JMQR和QQ热泉中存在，但这些真菌的丰度均较低。本研究表明高温热泉中蕴藏着极其丰富、多样的真菌物种资源。
大量研究表明，环境中某些理化因子例如pH、温度和无机盐等影响微生物群落结构[21-23]。Colman等[9]发现pH和温度是影响黄石公园的浮游生物群落结构的主要因素。而pH、温度、硫含量及可溶性氧则影响云南腾冲热泉不同细菌优势群体的分布[10-11]。除了影响细菌分布外，pH也驱动真菌的群落结构[3]。在本研究中，热泉样品的优势属Cladosporium分布受温度变化影响，Alternaria、Nigrospora、Penicillium、Phoma和Schizophyllum同NH4+含量有关，Aspergillus、Saccharomyces和Engyodontium受pH驱动。此外，Bray-Curtis分析显示OTU丰度大于1%所有优势属同样品pH显著性最高(p=0.05)，表明pH是驱动腾冲热泉真菌分布的一个重要因素。事实上，pH影响环境有机质的可溶性和酶活性，影响微生物对有机质分解、转运及其他养分的利用能力[24]，进而影响微生物生长、繁殖，导致不同种属的群落组成及丰度不同[25]。
总之，利用Illumina Hiseq 2500高通量测序技术研究云南腾冲热海热泉沉积物中真菌群落结构，全面揭示出在高温热泉中存在极其丰富、多样的真菌类群，并探究影响真菌分布的因素，发现pH、温度及NH4+含量可能是影响热泉不同真菌群落结构、物种丰度的重要环境因子，该研究工作将为热泉嗜热真菌资源的开发利用提供理论依据。
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