张天瑞1,2, 赵秋伟2, 李正华3, 李寅2, 张延平2
1.中国科学院天津工业生物技术研究所, 工业酶国家工程实验室, 天津 300308;
2.中国科学院微生物研究所, 中国科学院微生物生理与代谢工程重点实验室, 北京 100101;
3.中国科学院天津工业生物技术研究所, 天津 300308
收稿日期：2017-03-31；修回日期：2017-05-22；网络出版日期：2017-06-26
*通信作者：张延平, Tel/Fax:+86-10-64807351;E-mail:zhangyp@im.ac.cn
摘要：[目的]建立对糖化酶生产菌种黑曲霉随机突变文库进行筛选的方法，以获得糖化酶酶活提高的突变菌株。[方法]以一株可产糖化酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger X1为出发菌株，经硫酸二乙酯诱变获得突变文库，采用葡萄糖的结构类似物——2-脱氧葡萄糖进行筛选，并在筛选过程中逐渐提高2-脱氧葡萄糖浓度，定向选育具有2-脱氧葡萄糖抗性、高产糖化酶的突变株。[结果]获得的高产突变菌株DG36摇瓶发酵糖化酶产量比出发菌株A.niger X1提高22.2%-33.8%，经工业水平50 m3罐发酵测试，突变株DG36发酵128 h糖化酶活可达49094 U/mL，在相同发酵时间内，其酶活较出发菌株A.niger X1提高32.8%，发酵时间缩短16.9%。[结论]本研究开发了一种以2-脱氧葡萄糖为抗性标记选育高产糖化酶突变株的方法，所得突变株DG36遗传性状稳定，与出发菌相比具有菌丝粗壮、产酶期提前、糖化酶活高、发酵时间短、有利于发酵后处理的优点。
关键词： 黑曲霉 糖化酶 2-脱氧葡萄糖 诱变 硫酸二乙酯 工业应用
Screening of high-glucoamylase-producing strain of Aspergillus niger with 2-deoxyglucose resistance and the industrial application
Tianrui Zhang1,2, Qiuwei Zhao2, Zhenghua Li3, Yin Li2, Yanping Zhang2
1.National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China;
2.CAS Key Laboratory of Microbial Physiological and Metabolic Engineering, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
3.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China
Received 31 March 2017; Revised 22 May 2017; Published online 26 June 2017
*Corresponding author: Yanping Zhang, Tel/Fax:+86-10-64807351;E-mail:zhangyp@im.ac.cn
Abstract: [Objective]To obtain mutants of Aspergillus niger with high glucoamylase activity, we developed a screening method.[Methods]We mutagenized the starting strain A. niger X1 using diethyl sulfate, then cultured the mutant library on agar plate containing 2-deoxyglucose. By increasing the concentration of 2-deoxyglucose, we obtained mutants with high resistance to 2-deoxyglucose and then studied glucoamylase activities.[Results]In shake flask fermentation, glucoamylase activity of the mutant strain A. niger DG36 increased by 22.2% to 33.8%. In a 50 m3 fermenter, glucoamylase activity of the strain DG36 reached up to 49094 U/mL at 128 h, 32.8% higher than that of the starting strain A. niger X1. As a result, the fermentation period of the strain DG36 was reduced by 16.9% compared with A. niger X1.[Conclusion]Mutant strain DG36 exhibited higher glucoamylase activity, shorter fermentation period and more suitable for the purification treatment than the starting strain A. niger X1.
Key words: Aspergillus niger glucoamylase 2-deoxyglucose mutation diethyl sulfate industrial application
糖化酶(Glucoamylase，EC3.2.1.3) 全称为葡萄糖淀粉酶，作为淀粉原料糖化的一种重要酶制剂，广泛应用于食品、制药等工业领域，用于生产酒精、白酒、黄酒、有机酸及氨基酸等。黑曲霉(Aspergillus niger)、红曲霉(Monascus sp.)和根酶(Rhizopus sp.)等丝状真菌是糖化酶主要生产菌株。早在20世纪50年代，张树政院士就比较了不同曲霉的淀粉酶系组成，证明了黑曲霉的优越性，为我国酒精工业选用黑曲霉作为糖化酶来源提供了理论依据[1]。随后开展了大量诱变育种工作[2]，1979年报道经多年选育出的黑曲霉菌株UV-11 (AS3.4309) 在1.2 t罐上进行糖化酶发酵，最高酶活为5616 U/mL，达到了当时国际先进水平[3-4]。1982年，张树政院士在国际刊物上报道了中国在酶工程方面的进展，向世界介绍了生产糖化酶的优良菌株及糖化酶固定化方面的成果[5]。作为使用量巨大的酶制剂，生产菌UV-11及进一步诱变所得的UV-11-48[6]被广泛应用于发酵生产企业，在当时产生了巨大的经济和社会效益[7]，1985年，该研究获得国家科技进步一等奖。
随着科技的发展，基因工程技术被应用于糖化酶生产菌的改造中[8-9]，但时至今日，仍然是诱变育种改造所得菌株的糖化酶酶活和产量较高[8]。同时，转基因产物的食品安全性仍备受争议，传统的诱变育种作为经典的育种方法所选育出的生产菌株可被大众接受。但是目前传统诱变选育糖化酶生产菌株常用随机筛选的方式，选出高产糖化酶突变株的几率低，工作量大。调研发现，葡萄糖的结构类似物——2-脱氧葡萄糖(2-DG)能被己糖激酶和6-磷酸果糖激酶磷酸化而积累2-脱氧葡萄糖-6-磷酸，但不能继续代谢，从而抑制糖酵解，具有2-DG抗性的突变株可能会因激活其他糖代谢途径而增强糖代谢能力[10]。2-DG作为抗性筛选标记已被用于提高柠檬酸、葡萄糖氧化酶、β-呋喃果糖苷酶、木聚糖酶的产量[10-14]。因此，本研究拟针对生产糖化酶的黑曲霉菌株，用化学诱变剂诱变，定向筛选具有2-DG抗性的菌株。研究发现，以2-脱氧葡萄糖为抗性标记可定向选育高产糖化酶突变株。利用该筛选方法，本文获得了遗传稳定的高产突变株DG36，用于工业生产时表现出产酶期提前、糖化酶活高、发酵时间短、有利于发酵后处理等优点。
1 材料和方法 1.1 菌株 A. niger X1为工业生产菌株，A. niger A58、A. niger A82、A. niger A04、A. niger A27及A. niger A28为本实验室保藏菌种。
1.2 培养基 查氏培养基(g/L)：NaNO3 3.00，K2HPO4·3H2O 1.00，FeSO4·7H2O 0.01，KCl 0.50，MgSO4·7H2O 0.50，蔗糖20.00，琼脂20.00，pH 6.0-6.5，120 ℃灭菌15 min。
药物筛选培养基：查氏培养基(无蔗糖)添加过滤除菌的2-脱氧葡萄糖(2-DG)。
摇瓶发酵培养基1 (g/L)：葡萄糖100，豆饼粉30，玉米浆30 mL，pH 5.5，装液量30 mL/250 mL，115 ℃灭菌20 min。
摇瓶发酵培养基2 (g/L)：玉米粉100，豆饼粉40，麸皮10[15]，pH自然，装液量30 mL/250 mL，121 ℃灭菌20 min。
种子罐培养基(g/L)：玉米粉60，豆饼粉20，玉米浆10 mL，pH 5.5，120 ℃灭菌30 min。
发酵罐培养基(g/L)：葡萄糖50，玉米粉150，豆饼粉40，玉米浆20 mL，(NH4)2SO4 4，pH 5.5，120 ℃灭菌30 min。
1.3 硫酸二乙酯(DES)诱变及筛选 使用pH 7.0的磷酸缓冲液制备孢子悬浮液，加入终浓度为1%的DES，34 ℃诱变处理不同时间，加入25% Na2S2O3溶液终止反应，将诱变后的孢子使用pH 7.0磷酸缓冲液离心洗涤2-3次，梯度稀释涂布药物筛选培养基，34 ℃培养，待菌落长出后，随机挑选单菌落进行发酵并测试酶活。
1.4 发酵
1.4.1 摇瓶发酵: 挑取单菌落接种发酵培养基中，34 ℃、180 r/min培养7 d，取发酵液测定酶活。
1.4.2 发酵罐发酵: 取250 mL茄子瓶斜面4个，加入无菌水洗下菌落制成悬浮液，接入1 m3一级种子罐，装料系数0.6，控制pH 4.4，温度34 ℃，罐压6×104 Pa，通风量50 m3/h，培养48 h后接入5 m3二级种子罐，装料系数0.6，接种量7% (V/V)，控制pH 4.4，温度34 ℃，罐压6×104 Pa，通风量800 m3/h，培养60 h后接入50 m3发酵罐，装料系数0.5，接种量5% (V/V)，控制pH 4.4，温度34 ℃，罐压5×104 Pa，通风量1200 m3/h，培养160 h，定时取样测定酶活。1.5 糖化酶酶活测定 取一定体积的发酵液，用滤布除去菌丝球，得粗酶液，用于测定糖化酶活力。
酶活力定义：1 mL粗酶液在40 ℃、pH 4.6的条件下，每小时分解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖的量为1个酶活单位(U/mL)，葡萄糖量采用3, 5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定。
2 结果和分析 2.1 出发菌株的选择 将A. niger X1等6株出发菌株的孢子悬液分别涂布于查氏培养基上，34 ℃培养2-4 d，挑取菌落分别接种至发酵培养基1和发酵培养基2中，摇瓶发酵测定糖化酶的产量。6株黑曲霉在查氏培养基上的菌落形态如图 1所示，其糖化酶产量结果见表 1，从测试结果可以看到A. niger X1在两种发酵培养基中的糖化酶酶活均高于其他菌株，在发酵培养基1中糖化酶产量可达6497 U/mL，所以决定以A. niger X1为出发菌株进行糖化酶高产突变株的筛选，以发酵培养基1为测定糖化酶酶活的发酵培养基。
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| 图 1 不同黑曲霉菌株的菌落形态比较 Figure 1 Comparison of colony morphology of A. niger strains. |
| 图选项 |
表 1. 不同黑曲霉菌株的糖化酶活力比较 Table 1. Comparison of glucoamylase activity (U/mL) of different strains
| Media | A. niger X1 | A. niger A58 | A. niger A82 | A. niger A04 | A. niger A27 | A. niger A28 |
| Fermentation media 1 | 6497 | 111 | 353 | 984 | 5709 | 5808 |
| Fermentation media 2 | 6132 | 217 | 88 | 810 | 4513 | 3890 |
表选项
2.2 诱变条件的选择 使用DES对A. niger X1的孢子进行诱变，得到的致死率曲线如图 2，由于突变是随机发生，高或低的致死率都有可能产生优良的突变株，所以分别选择诱变15 min和30 min时的处理液进行突变株的筛选，这2个时刻的致死率分别为16.2%和84.4%。
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| 图 2 DES致死率曲线 Figure 2 DES lethal curve. |
| 图选项 |
2.3 高产糖化酶突变株的选育
2.3.1 出发菌株对2-DG抗性临界浓度的测定: 将A. niger X1的孢子悬浮液涂布于含有不同浓度2-DG的药物筛选培养基上，经培养后发现菌株在含有1 g/L 2-DG的培养基上不能生长(表 2)，由此可确定出发菌株对2-DG的抗性临界浓度。 表 2. 2-DG对A. niger X1生长的影响 Table 2. Effects of 2-DG on the growth of A. niger X1
| Concentration of 2-DG/(g/L) | Growth of A. niger X1 |
| 0 | + |
| 0.5 | + |
| 1.0 | - |
| +/– stands for the strain A. niger X1 can/cannot grow on the media. | |
表选项
2.3.2 突变株的筛选: 将诱变处理后的A. niger X1菌液，涂布于添加有1 g/L 2-DG的培养基上，待菌落长出后，随机挑选22个单菌落进行摇瓶发酵测定糖化酶酶活，得到酶活较高的突变株XB1，酶活为6920 U/mL，相对于出发菌株提高6.5%。将XB1再次诱变处理，涂布于含有3或4 g/L的2-DG培养基上培养，后者无单菌落生长，仅在含有3 g/L 2-DG的培养基上有单菌落长出，筛选后得到9株酶活力提高的突变株，经摇瓶发酵验证，糖化酶活力与出发菌株A. niger X1相比提高幅度在13.0%-28.4%之间，详见图 3，其中突变株DG36明显提高28.4%。
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| 图 3 摇瓶发酵测试突变株的糖化酶酶活 Figure 3 Glucoamylase activities of A. niger X1 and its mutants in shaking flask fermentation. |
| 图选项 |
在筛选的过程中观察到菌丝球的直径和糖化酶活的关系如表 3所示，发酵到达第5天时，每个突变株在摇瓶内培养时可形成大小均一的菌丝球，菌丝球直径与糖化酶酶活呈负相关，形成的菌丝球越大，其糖化酶活力越低，如菌丝球的平均直径大于1.8 mm，其酶活会小于4000 U/mL，形成的菌丝球越小，如直径小于0.9 mm，其酶活越高，大于7000 U/mL。将直径小于0.9 mm和大于1.8 mm的菌丝球分别制备压片进行显微镜观察，结果如图 4，小直径菌丝球的菌丝短粗且分叉多，而大直径菌丝球的菌丝细长且分叉较少。菌丝球的形成对于糖化酶的生成是必需的[16]，菌丝球的直径与菌丝的形态有关[17]，当菌丝短粗时形成的菌丝球较小，增大了同培养基内氧气的接触面积，能更有效地利用氧气，酶活得到提高；反之，大菌丝球同培养基内氧气接触面小，且由于菌丝球大会限制中心供氧，容易导致菌丝裂解，酶活就会低[16, 18]。 表 3. 不同产量突变株菌丝球比较 Table 3. Comparison of mycelial pellets morphology of A. niger mutants
| Morphology of mycelial pellets |  |  |  |
| Diameter/mm | < 0.9 | 1.2-1.5 | > 1.8 |
| Enzyme activity/(U/mL) | > 7000 | 6000-5000 | < 4000 |
表选项
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| 图 4 菌丝的显微镜观察 Figure 4 Microscopic observation of mycelium. A: Diameter of mycelial pellets < 0.9 mm; B: Diameter of mycelial pellets > 1.8 mm. |
| 图选项 |
2.3.3 高产糖化酶突变株遗传稳定性分析: 对突变株DG36和出发菌A. niger X1分别在查氏斜面进行连续传代，每次挑取一环菌，进行摇瓶发酵测试糖化酶酶活，共连续传代5次。结果如图 5，每次测试得到的突变株DG36糖化酶酶活结果均高于出发菌株A. niger X1，提高率分别为24.5%、22.2%、27.8%、33.8%和23.6%，说明在连续传代过程中突变株的酶活产量较为稳定。
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| 图 5 传代次数对DG36糖化酶酶活力的影响 Figure 5 Glucoamylase activities of different generations of the strain A. niger DG36. |
| 图选项 |
2.4 摇瓶发酵产酶过程比较 将突变株DG36与出发菌株A. niger X1进行摇瓶发酵，比较产酶过程，从发酵第72 h起每隔48 h取样测糖化酶活，测定结果如图 6，可以看到在72 h突变株DG36的酶活为2496 U/mL，而此时出发菌A. niger X1的酶活为982 U/mL，说明突变株DG36比出发菌株更能较快进入产酶状态，当到达120 h时，出发菌株的酶活为5997 U/mL，此时突变株DG36的酶活为7780 U/mL，相比提高29.7%，突变株DG36酶活力在168 h达到最高值8720 U/mL，此后酶活力下降，摇瓶中菌丝球减少，可能菌体开始自溶，而出发菌A. niger X1在216 h酶活到达最大值7630 U/mL，但与168 h时7448 U/mL的酶活相比提高幅度不大，说明在168 h后，出发菌株的产酶能力也在下降，从摇瓶发酵的时间来看，突变株在168 h达到最大酶活，而出发菌株需要216 h，说明突变株的摇瓶发酵产酶周期短，时间可缩短22.2%。
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| 图 6 菌株A. niger X1和DG36在摇瓶中产酶过程曲线 Figure 6 Comparison of glucoamylase activities of A. niger X1 and DG36 in shake flask fermentation. |
| 图选项 |
2.5 50 m3罐发酵测试 在江苏一家酶制剂生产企业进行突变株DG36与出发菌A. niger X1分别进行50 m3罐发酵测试，比较在工业水平下获得的改造株的发酵性，在50 m3罐中典型的产酶曲线如图 7。由于在大罐中进行发酵时可以控制溶氧和pH等参数，发酵条件比摇瓶发酵控制的要好，无论是出发菌株还是突变株的发酵时间都有缩短，产酶量可以成倍提高。从产酶曲线来看，突变株DG36产酶速度更快，在128 h酶活可达到最大值49094 U/mL，在相同发酵时间内出发菌株A. niger X1的酶活为36975 U/mL，相比之下DG36的酶活提高幅度达32.8%，出发菌株A. niger X1在154 h获得的最大酶活为40600 U/mL，突变株的最高酶活与之相比提高20.9%，从发酵时间上来看突变株DG36比出发菌株缩短16.9%。
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| 图 7 菌株A. niger X1与DG36在50 m3罐产酶过程比较 Figure 7 Comparison of glucoamylase activities of A. niger X1 and DG36 in 50 m3 fermenter. |
| 图选项 |
在发酵结束后进行板框过滤得粗酶液，因突变株DG36与出发菌A. niger X1相比菌丝粗壮，在发酵后期没有发生菌丝自溶现象，发酵液后处理时板框滤渣较干，更利于产品的回收，提高收率5%-8%。在多次测试中，突变株DG36单罐的发酵时间在缩短24 h左右的情况下，酶活还能比出发菌A. niger X1的单罐产量高或持平，这使所消耗的糖浆和电费也相应减少，达到减少原料消耗及节能的效果，变相减少了生产成本。该厂年产糖化酶2000 t，使用改进后的菌株每罐可增产酶23%，年增加利润约370万元。
3 结论 国内使用传统诱变选育糖化酶生产菌株常用随机筛选的方式，这会使科研人员的工作量大、效率低。在本研究中，使用2-DG作为筛选药物，增加优良菌株的筛出率，成功定向选育出一株具有2-DG抗性标记的糖化酶高产菌DG36，遗传性状稳定，经摇瓶发酵和50 m3罐发酵测试，突变株DG36与出发菌株A. niger X1相比均表现出产酶期提前、糖化酶酶活提高、发酵时间缩短的优点，在工业中应用时可以达到增效、节能、降本的效果。2-DG抗性菌株筛选技术已成功应用于提高黑曲霉生产柠檬酸、葡萄糖氧化酶、β-呋喃果糖苷酶、木聚糖酶等的产量，但在糖化酶生产菌株选育方面鲜有报道。
因突变株DG36与出发菌株A. niger X1相比菌丝粗壮、多分枝，形成的菌丝球较小，菌丝在发酵罐中发酵后期不易自溶，这使得在工业中应用时该菌的发酵液更有利于后处理回收酶液。黑曲霉在发酵过程中形成的菌丝球直径和菌丝状态一般和培养基成分、pH、搅拌、溶氧、温度等相关[19]，已有报道在黑曲霉生产柠檬酸时，菌丝球越小，柠檬酸的产量越高[18]。在本研究中，突变株DG36发生了以上变化说明某些有关菌丝形态的基因发生了改变，在以后的研究中可以通过蛋白质组学、基因组学进行分析，找出差异，为以后的选育菌株提供方向。
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