南极菌产琼胶酶aga3311的表达、性质及其降解特性
刘秀萌¹, 李江², 侯旭光¹, 何培青²
1.山东大学(威海)海洋学院, 山东 威海 264200;
2.国家海洋局第一海洋研究所, 海洋生物活性物质重点实验室, 山东 青岛 266061

收稿日期：2015-12-11；修回日期：2016-02-10；网络出版日期：2016-03-14
基金项目：南北极环境综合考察与评估专项（CHINARE2014-01-05）；国家海洋局海洋生物活性物质与现代分析技术重点实验室开放基金（MBSMAT-2015-06）；青岛市应用基础研究计划项目（14-2-4-14-jch）

_*通信作者：何培青, Tel/Fax:+86-532-88966520;E-mail:lijiang@fio.org.cn


摘要： [目的]本文通过对具有琼胶降解能力的南极菌Pseudoalteromonas sp. NJ21全基因组进行生物信息学分析，筛选获得琼胶酶疑似序列aga3311，采用基因工程手段对该基因的功能和性质进行了验证和分析。[方法]首先对aga3311进行克隆和表达；采用Ni-NTA对重组酶进行纯化；DNS-还原糖法测定重组酶的酶学性质；用薄层层析（TLC）和质谱（MS）技术对Aga3311的酶解产物进行分析。[结果]构建的重组表达质粒pET-30（a）+aga3311能够在工程菌E. coli BL21（DE3）中实现高效表达，其中可溶性表达为30%左右；纯化的重组酶Aga3311分子量为87 kDa，其最适作用温度为35℃，30-45℃的范围内稳定性较高，50℃则迅速失活，具有热不稳定的特征；最适pH为7.0，在pH 4.0-10.0的范围内仍能保持50%以上的活性；金属离子Fe³⁺、Be²⁺、Zn²⁺和Ca²⁺均能显著提高Aga3311的活性，特别是Ca²⁺使其酶活提高1倍。该酶的酶解终产物经TLC和质谱分析主要为新琼二糖。[结论]重组酶Aga3311为Glyco_hydro_42家族的外切型β-琼胶酶，能够特异性降解琼脂糖生成新琼二糖。
关键词： 琼胶酶 表达 酶学性质 新琼二糖
Expression and characterization of the agarase gene aga3311 from an Antarctic bacterium
Xiumeng Liu¹, Jiang Li², Xuguang Hou¹, Peiqing He²
1.Marie College, Shandong University, Weihai 264200, Shandong Province, China;
2.Key Laboratory of Marine Bioactive Substances, the First Institute of Oceanography, SOA, Qingdao 266061, Shandong Province, China

Received 11 December 2015; Revised 10 February 2016; Published online 14 March 2016
_*Corresponding author: He Peiqing, Tel/Fax: +86-532-88966520; E-mail: lijiang@fio.org.cn
Supported by the Chinese Polar Environment Comprehensive Investigation & Assessment Programs (CHINARE2014-01-05), by the Key Laboratory of Marine Bioactive Substance and Modern Analytical Technique, SOA (MBSMAT-2015-06) and by the Qingdao Fundamental and Applied Research Project (14-2-4-14-jch)

Abstract: [Objective]The complete genome of the agarolytic bacterium Pseudoalteromonas sp. NJ21 from Antarctic sample was analyzed by bioinformatics methods and putative agarase aga3311was screened. Expression and characterization of the putative agarase aga3311 were studied.[Methods]Gene aga3311 was cloned and expressed by genetic engineering method firstly; then, the recombinant enzyme was purified by Ni-NTA chromatography and the characterization of recombinant enzyme was determined by dinitrosalicylic acid method; the hydrolysis product of recombinant enzyme Aga3311 was analyzed by thin-layer chromatography (TLC) and mass spectrometry (MS).[Results]The recombinant expression vectors (pET-30(a)+aga3311) was overexpressed in E. coli BL21(DE3) and 30% of the recombinant protein was soluble. The purified agarase (Aga3311) revealed a single band on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, with an apparent molecular weight of 87 kDa. The optimum temperature of the recombinant agarase was 35℃, and it maintained higher activity between 30 and 45℃, but the activity declined rapidly above 50℃, typical of thermal instability enzyme. The optimum pH was 7.0, and it maintained 50% of its maximum activity between pH 4 and 10. Aga3311 was significantly activated by Fe³⁺, Be²⁺, Zn²⁺ and Ca²⁺, especially Ca²⁺ doubled the enzyme activity. The pattern of agar hydrolysis of Aga3311 is an exo-β-agarase, producing neoagarobiose (NA2) as the final main product.[Conclusion]Aga3311 is an exo-β-agarase of Glyco_hydro_42 family, producing neoagarobiose (NA2) as the final main product.
Key words: agarase expression enzymatic characterization neoagarobiose
琼胶(agar)是一种亲水性多糖，是红藻细胞壁的主要成分，是由琼脂糖(agarose)和硫琼脂(agaropectin)组成的混合物^[1]。琼胶酶(agarase)是能够降解琼脂糖和琼胶的糖苷水解酶(glycoside hydrolases)。根据其作用方式不同，可以把琼胶酶分为2类：α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶(EC3.2.1)裂解琼脂糖的α-1, 3-糖苷键，生成以β-D-半乳糖为非还原性末端和以3, 6-内醚-α-L-半乳糖为还原性末端的琼胶寡糖(agaro-oligosaccharides)系列；β-琼胶酶(EC3.2.1.81)裂解琼胶糖的β-1, 4-糖苷键，生成以β-D-半乳糖为还原性末端和以3, 6-内醚-α-L-半乳糖为非还原性末端的新琼寡糖(neoagaro-oligosaccharides)系列^[2-3]。
琼胶酶广泛应用于生化、临床、医药和食品等领域，因为其降解琼胶产生的琼寡糖具有多种对人类健康有益的生理和生物活性，如较强的抗癌、抗氧化、抗炎、抗龋齿及抗淀粉老化等，是一种极具开发潜力的低聚糖^[4]。由于酶解法降解制备低聚糖不仅反应条件温和、降解过程易于控制，而且绿色环保，因此利用琼胶酶降解琼胶制备低分子量活性寡糖，成为海藻工业高值化利用的重要方向^[5]。
琼胶酶的来源比较广泛，迄今已经有许多琼胶酶分离自海水、海洋沉积物、海藻、海洋软体动物、淡水和土壤。能够产生琼胶酶的微生物主要包括Alteromonas sp.^[6]、Pseudomonas sp.^[7]、Vibrio sp.^[8]、Cytophaga sp.^[9]、Agarivorans sp.^[10]、Thalassomonas sp.^[11]、Pseudoalteromonas sp.^[12]、Bacillus sp.^[13]、Acinetobacter sp.^[14]。虽然目前已有几十种不同的琼胶酶得到了分离纯化，并对一些琼胶酶基因进行了克隆表达，但多数已报道的琼胶酶活力低、稳定性差，无法满足工业化生产的需求，也阻碍了琼胶寡糖的构效关系研究乃至应用开发的进一步开展^[15]，因此新型琼胶酶的筛选和发现，特别是来源于特殊生境(南北极、大洋、热泉等)的新酶仍具有重要意义。南极具有独特的地理、气候及环境特征，形成了一个高盐度、高辐射、酷寒、反复冻融及特殊的光照特征的自然环境^[16]，极地特殊生境造就了微生物在基因组成、酶学特性以及代谢调控等方面独特的分子生物学机制与生理生化特性，能够产生各种具有独特生理活性的酶系^[17]。本实验室在前期的工作中，从南极沉积物中筛选获得1株琼胶酶高产菌株Pseudoalteromonas sp. NJ-21，并对琼胶酶疑似序列aga3311进行表达和性质研究，以期获得活性高、稳定性好的新琼胶酶。
1 材料和方法 1.1 菌株和基因 产琼胶酶南极嗜冷菌株Pseudoalteromonas sp. NJ-21，保存于国家海洋局第一海洋研究所菌种库(-80 °C)；琼胶酶疑似序列aga3311已提交至GenBank (KU160630)。
1.2 试剂和材料 细菌基因组提取试剂盒、质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒均购自Tiangen (北京天根科技公司)，表达型感受态细胞E. coli BL21(DE3)购自Tiangen (北京天根科技公司)，表达载体pET-30 (a)(His?Tag)购自TaKaRa (大连宝生物工程有限公司)，Ni Sepharose (GE Healthcare)，硅胶板(青岛胜海精细硅胶化工公司)。
1.3 琼胶酶aga3311的克隆
1.3.1 引物的设计 根据已知的琼胶酶基因aga3311序列, 采用在线引物设计网站http://seq.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer设计引物，在引物的5′端分别引入相应限制性内切酶位点，并在酶切位点前面加6个保护碱基，特异性引物由金斯瑞生物技术有限公司合成：上游引物：5′-GTCG TCGTCGACCTATTTCTTTAACCCTTCACGAAACG-3′，下划线部分为添加BamHⅠ酶切位点；下游引物：5′-CATAAATCTAGAATCAATCTTA CAGGTACCAA-3′，下划线部分为添加XbaⅠ酶切位点。
1.3.2 PCR扩增 以南极菌NJ21基因组为模板进行PCR扩增。PCR体系：高保真的2×MasterMix (TaKaRa) 25 μL；模板2 μL；上下游引物各1 μL；ddH₂O 21 μL；总体积50 μL。PCR反应条件：98 °C 4 min；94 °C 45 s，55 °C 45 s，72 °C 2.5 min，30个循环；72 °C 10 min。 1.4 琼胶酶Aga33111的表达
1.4.1 表达载体的构建 用BamHⅠ/XbaⅠ内切酶对上述PCR产物和表达载体PET-30 (a)分别进行双酶切，回收纯化；利用T4 DNA Ligase进行连接，并转化TOP10的感受态细胞。筛选阳性克隆，提取重组质粒，转化E. coli BL21，涂布于含卡那霉素(50 mg/L)的LB培养平皿中，于37 °C培养过夜。
1.4.2 重组质粒的鉴定 挑取阳性克隆，提取质粒，经BamHⅠ/XbaⅠ双酶切鉴定；同时对阳性克隆进行测序鉴定，测序由北京六和华大基因股份有限公司完成。 1.5 重组琼胶酶Aga3311的纯化 按1 %的接种量将重组菌接种入50 mL LB培养基中，37 °C、150 r/min摇床培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入0.8 mmol/L的IPTG分别于15 °C和37 °C条件下进行诱导。诱导后的菌液分别于4 °C、7500 r/min离心15 min弃上清；用pH 7.4的PBS缓冲液重悬菌体，高压细胞破碎仪破碎细胞，4 °C、10000 r/min离心10 min，收集上清备用。
采用Ni-NTA His Tag Kit对重组酶进行纯化，依次用含不同浓度咪唑(20、50、100、200、500 mmol/L)的洗脱液对Ni-NTA柱进行洗脱，收集、合并洗脱峰，SDS-PAGE检测蛋白纯度。
1.6 重组酶的酶学性质研究
1.6.1 酶活测定方法^[18] 反应体系为：粗酶液=1 mL，底物(含0.2 %琼脂的0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液)1 mL，35 °C反应15 min，水解产生的还原糖采用DNS法测定其吸光值。酶活力单位定义为：在35 °C、pH 7.0条件下1 mL酶液每分钟产生1 μg还原糖(以半乳糖计)所需的酶量。每组实验做3个平行，取平均值。
1.6.2 重组酶Aga3311的性质 分别以25、30、35、40、45、50 °C 6个温度梯度作为酶的反应温度，以确定其最适反应温度；分别在35、40、45、50 °C的条件下保温15、30、60 min，以测定该酶的热稳定性。分别以pH 4-6 (Na₂HPO₄-柠檬酸)，pH 6-9 (Na₂HP₄-NaH₂PO₄)，pH 9-11 (甘氨酸-NaOH)作为底物反应缓冲液，以测定其最适pH。在底物中分别加入Ca²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Be⁺、Fe³⁺，以探究金属离子对酶活的影响。 1.7 降解产物分析 将重组酶1 mL与底物1 mL (0.2 %的琼脂溶于pH 7的磷酸缓冲液)在35 °C条件下，分别反应15 min、30 min、1 h、6 h，沸水浴5 min终止反应，离心备用。

1.7.1 薄层层析法(TLC)^[19] 用毛细吸管吸取样品点于硅胶板上进行层析，展开剂为正丁醇∶乙酸∶水=2∶1∶1 (体积比)，显色剂为改进的苯胺，二苯胺。
1.7.2 质谱法(MS) 酶解产物经Amicon的超滤管(Ultra15，5 kDa)浓缩和纯化后，采用6320型离子阱质谱仪进行分析。分析条件：电喷雾(ESI)离子源(美国Agilent公司)；雾化器压力(N₂)55 psi，干燥气(N₂)流速12 L/min，干燥气温度365 °C，毛细管电压，3500 V，质量扫描范围m/z 150-500。 2 结果和分析 2.1 基因的序列分析 序列分析表明，aga3311包含1个完整开放阅读框，全序列长度为2349 bp，编码782个氨基酸，预测分子量为87 kDa。BLASTp比对结果显示，该序列编码的蛋白属于Glyco_hydro_42家族，经与Pseudoalteromonas属的琼胶酶：H9 AgaH91 (AJW83677.1)、PLSV agarase (WP_03318 6679.1)、P1-13-1a agarase (WP_055014356.1)和agarase (KDC51314.1)进行多序列比对表明，aga3311与PLSV agarase序列的相似性最高为96%，与AgH91相似性最低为61% (图 1)。由于序列分析并没有发现明显的琼胶酶家族保守区域，因此，我们仍需要结合酶学性质及降解特性对其进行归属。

图 1. 琼胶酶基因3311编码的氨基酸多序列比对 Figure 1. Multiple alignment of aga3311 amino acid sequences with known agarases

图选项

2.2 重组酶Aga3311的表达与纯化 重组酶Aga3311在终浓度为0.8 mmol/L IPTG的诱导下表达量显著提高，在15 °C诱导16 h后，重组酶的可溶性表达约占30 %左右，而当诱导温度提高到37 °C时，重组酶则主要以包涵体的形式存在(图 2-A)，其原因可能是在高温条件下，大量的重组酶积累在细胞周质不能进行正确折叠，从而形成不溶的包涵体。

图 2. Aga3311蛋白表达的SDS-PAGE分析 Figure 2. SDS-PAGE of Aga3311. M: molecular mass of the marker; lane NC: total proteins of the recombinant E. coli BL21(DE3) before induce; lane 1: total proteins of the recombinant E. coli BL21(DE3) after induce 16 hours at 15 °C; lane 2: total proteins of the recombinant E. coli BL21 (DE3) after induce 4 hours at 37 °C; lane NC1: supernatant of the recombinant E. coli BL21(DE3) before induce; lane NC2: the pellet fraction of the recombinant E. coli BL21(DE3) before induce; lane 3: supernatant of the recombinant E. coli BL21(DE3) after induce 16 hours at 15 °C; lane 4: the pellet fraction of the recombinant E. coli BL21(DE3) after induce 16 hours at 15 °C; lane 5: supernatant of the recombinant E. coli BL21(DE3) after induce 4 hours at 37 °C; lane 6: the pellet fraction of the recombinant E. coli BL21(DE3) after induce 4 hours at 37 °C; lane 7: purified Aga3311

图选项

重组酶经镍柱纯化，当洗脱液中咪唑浓度为200 mmol/L时可得到单一的蛋白条带，SDS-PAGE显示其分子量约为87 kDa，与Aga3311的预测值相一致(图 2-B)，纯化后重组酶Aga3311的比活力可达19.801 U/mg。
2.3 重组酶Aga3311的性质 如图 3-A和3-B所示，重组酶Aga3311在温度为35 °C时酶活最高，在35-45 °C的范围内仍能保持80%以上的酶活，但当温度升高为50 °C时酶活迅速丧失，表明其具有热不稳定的特性，可能与该酶来源于南极微生物具有密切的关系。温度稳定性结果显示，当作用温度为35、40、45 °C，保温30 min的条件下，该酶的热稳定性很好，酶活几乎没有下降；但当温度提高到50 °C，保温30 min的条件下，酶活迅速下降，当保温60 min后酶活几乎丧失。

图 3. 重组酶Aga3311的理化性质 Figure 3. Characterization of purified Aga3311. A: The effect of temperature on the activity of Aga3311; B: The effect of thermostability on Aga3311 at different temperatures and time points; C: The effect of pH on the activity of Aga3311; D: The effects of metal ions and metal salts on the activity of Aga3311

图选项

如图 3-C所示，该酶的最适pH为7.0 (磷酸缓冲液)，但在pH 4-10的范围内，该酶仍保持50%以上的活性，说明该酶具有较广泛的酸碱适应性。
多种金属离子能够影响重组酶的活性，如图 3-D所示，Fe³⁺，Be²⁺，Zn²⁺和Ca²⁺均能显著提高Aga3311的活性，特别是Ca²⁺使其酶活提高1倍；而金属离子Mg²⁺、Cu²⁺、Sr²⁺、Mn²⁺和Co²⁺则对该酶具有一定的抑制作用。
2.4 降解产物的分析 TLC分析结果显示，重组酶Aga3311和底物反应15 min、30 min、1 h、6 h后的降解产物与新琼二糖的迁移率相同(图 4-A)。为了进一步对酶解产物进行验证，我们对重组酶Aga3311的酶解产物进行了MS分析，如图 4-B所示，测得的离子峰(m/z)分别为： 325.2[M+H]⁺、342.3[M+NH₄]⁺、347.3[M+Na]⁺和363.2[M+K]⁺，该分析结果与新琼二糖标准品的质谱结果(图 4-C)相符。

图 4. 重组酶Aga3311的降解产物分析 Figure 4. Analysis of hydrolysis products of purified Aga3311. A: TLC of the hydrolysis products of purified Aga3311. NA2: neoagarobiose; NA4: neoagarotetraose; NA6: neoagarohexaose; lane 1: standard mixture; lane 2: reaction products of the agarose with Aga3311 for 15 min; lane 3: reaction products of the agarose with Aga3311 for 30 min; lane 4: reaction products of the agarose with Aga3311 for 60 min; lane 5: reaction products of the agarose with Aga3311 for 6 hours. B: MS of the hydrolysis products of purified Aga3311. C: MS of standard neoagarobiose

图选项

综上，我们确定重组酶Aga3311降解琼胶的终产物主要为新琼二糖，因此也可以推测出Aga3311是一种外切型的β-琼胶酶。
3 讨论 极端生境孕育着独特的微生物类群，生存在恶劣南极环境下的细菌，形成了一系列独特生理特性以获取竞争优势。这也使得南极地区成为产酶、抗生素、多糖、脂类等先导化合物菌株的潜在种源地^[20]。本研究的琼胶酶基因aga3311来自于南极嗜冷菌(Pseudoalteromonas sp. NJ-21)，而有关南极微生物产琼胶酶的研究尚不多见，琼胶酶Aga3311的酶学性质研究表明，该酶可溶性表达高、活性强、pH适应性广，因而具有潜在的应用价值。
Aga3311的最适作用温度为35 °C，且在50 °C迅速失活，该性质符合南极微生物来源的低温酶的基本特征；但该酶在40-45 °C的范围内具有与35 °C时几乎相同的酶活，该特征则非常有利于酶与底物的充分作用，因为琼胶的凝固温度为40 °C，低于40 °C琼胶就会迅速凝固，从而大大降低底物与酶的接触面积和作用效率。Aga3311的最适pH为7，但在pH在4-10的范围之内仍保持着较高的酶活，该特性与已报到的(AgaD、AgaA)的pH适应性相一致^[21-22]，由于该酶具有广泛的pH适应性，因此在以后的生产和应用中具有广阔的适用范围。金属离子Ca²⁺、Be⁺、Zn²⁺能够显著的提高该酶的酶活，其中尤以Ca²⁺的作用最明显，该结果与很多海洋微生物来源的琼胶酶在Ca²⁺的作用下酶活最高的报道相一致^[22-23]，也符合该酶产生菌的生境特征。而Mn²⁺对该酶的酶活具有较大的抑制作用，可能是Mn²⁺与Ca²⁺竞争活性中心的结合位点所致，而根据此特性可以进一步探究该酶的催化区域和空间构象，以阐明其催化机理。
琼寡糖具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种生物活性，并且与寡糖的聚合度(DP)密切相关。DP在2-4的寡糖可以抑制前列腺素E₂(PGE₂)和肿瘤坏死因子(TNF-d)的产生，从而抑制癌细胞的发生；可以通过阻止可诱导性NO合成酶(iNOs)的表达来抑制过量NO自由基的产生，从而消除NO过量造成的损伤；日本Kobayashi等发现低分子量的新琼二糖具有良好的吸湿和美白双重功效。本研究中，Aga3311降解琼胶的主要产物和终产物都为新琼二糖，而之前报道的琼胶酶的主要产物多为新琼四糖^{[7, 24-26]}，还有一些琼胶酶的主要产物是新琼六糖和新琼四糖，但终产物是新琼二糖^[27]。由于Aga3311能够高效制备新琼二糖，因而在海藻的高值化利用领域具有广阔的应用前景。

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