1. 清华大学 精密仪器系, 北京 100084;
2. 清华大学 生物医学检测技术及仪器北京市实验室, 北京 100084;
3. 清华大学 未来芯片技术高精尖创新中心, 北京 100084
收稿日期：2018-04-11
基金项目：北京市教委北京实验室资助项目
作者简介：赵精晶(1989-), 男, 博士后
通信作者：尤政, 教授, E-mail:yz-dpi@tsinghua.edu.cn
摘要：流式细胞仪是用于高通量细胞分析和分选的高端生命科学仪器，被广泛应用于科学研究和临床诊断。最新的一个发展方向是以微流体芯片为核心的高集成度、微体积、全封闭、零交叉污染的微流体流式细胞仪。该文针对微流体流式细胞仪的三维（3-D）样本聚焦、光斑整形和片上分选等3项关键技术开展了研究。3-D流体动力聚焦微流体芯片能够在每秒数米的高流速下将样本流聚焦在流道中心，聚焦后的样本流边长仅为10 μm量级。经设计的二元光学器件可将激光光斑整形为矩形准平顶光斑，比传统流式所使用的椭圆形Gauss光斑，矩形平顶光斑具有更均一的能量分布。采用电火花空化微气泡，利用空泡膨胀产生的射流实现高精度的单细胞片上分选。将整合了上述技术的微流体流式细胞仪应用于标准荧光微球的分析测试，综合性能达到或接近于现有的大型传统流式细胞仪。
关键词：流式细胞仪微流体细胞分选二元光学器件荧光检测流式细胞术
Key techniques in microfluidic flow cytometers
ZHAO Jingjing1,2,3, YOU Zheng1,2,3
1.Department of Precision Instruments, Tsinghua University, Beijing 100084, China;
2.Beijing Laboratory for Biomedical Detection Technology and Instrument, Tsinghua University, Beijing, 100084, China;
3.Beijing Innovation Center for Future Chips, Tsinghua University, Beijing, 100084, China
Abstract: Flow cytometers are biomedical instruments for high throughput analyses and sorting of single cells which are widely used in both biomedical research and clinical diagnoses. Advances in microfluidics have led to highly-integrated, compact, fully-enclosed, and no cross-contamination microfluidic flow cytometers. This study focuses on three key techniques with 3-D focusing of the sample flow, laser beam shaping, and on-chip sorting. 3-D focusing microfluidic chips confine the sample flow down to 10 micrometers at a velocity of several meters per second. Specially-designed binary optical elements (BOEs) generate micrometer-scale rectangular quasi-flat spots for exciting fluorescence that replace conventional elliptical Gaussian spots. These give an on-chip sorting mechanism based on the jet-flow by expanding spark-induced cavitation microbubbles. A microfluidic test system is developed by combining these three techniques with performance that is close to that of two commercial instruments.
Key words: flow cytometermicrofluidicscell sortingbinary optical elementfluorescence detectionflow cytometry
流式细胞仪是能够对细胞群体中每一个细胞的物理和化学信息进行快速、多参数、定量分析并将特定目标细胞分选出来的生命科学仪器[1]。以微机电系统技术(micro-electro-mechanical system, MEMS)和微流体芯片为基础的微流体流式细胞仪是其最新发展方向之一。可单次使用的全封闭的微流体芯片不仅具备高集成度、微体积的优点, 还从根本上杜绝了样品间交叉污染和气溶胶污染, 提升了检测准确性和生物安全性。本文针对微流体流式细胞仪中的样本聚焦、光斑整形和片上分选3项技术开展了研究, 并在开放式的流式系统中进行了验证。
流体动力聚焦技术是流式细胞检测中最为核心的技术, 其目的是将样本流聚焦在流道中心, 从而使得样本中的细胞获得相同的流动路径和激光照射条件。传统流式系统中采用的是由多个部件组成的锥形流动室, 利用鞘液将样本流聚焦在截面边长为200~400 μm的微流道的中心。通常, 样本流流量为10~70 μL/min, 流速为3~8 m/s, 聚焦后截面边长为6~30 μm。由于独特的平面结构, 微流体芯片难以在垂直方向实现高水平聚焦, 但在水平方向较为容易。3-D聚焦可同时完成水平和垂直聚焦。现有微流体聚焦方案包括流体动力聚焦[2]、惯性聚焦[3]、微结构约束聚焦[4]、电动聚焦(电泳[5]、电渗[6]、介电泳[7])和声波聚焦[8]。其中, 仅有流体动力聚焦能够普遍适用于不同的生物微粒和流速, 不受微粒尺寸和形态、物理性质、流量等条件的限制, 因而本文采用该原理。
流式的常规检测对象为被荧光标记的数微米至十几微米的细胞, 对激光光斑的均匀性和尺寸有很高要求。传统流式采用的是由2个柱透镜形成的椭圆形Gauss光斑[9], 短轴5~20 μm、长轴为数10~100 μm。理论上最佳的光斑应为矩形平顶光斑, 能够保证通过光斑不同的位置的细胞均受到相同的照射条件。为此, 本文利用二元光学器件将激光光斑整形成矩形准平顶光斑。对于微流体芯片, 还可用嵌入的光纤直接将激光引入到微流道实现照明[10], 但这样生成的光斑尺寸较大因而无法满足高通量流式检测的要求。
分选型流式能够将目标单细胞从液路中准确地分离。传统的分选方案类似喷墨打印机, 开放的环境会造成气溶胶污染, 危害人员健康。微流体流式细胞仪在封闭的微流体芯片内完成分选, 通过产生精准可控的脉冲力来改变目标细胞的运动轨迹, 常见的分选原理包括机械式微泵/微阀分选[11-13]、电动分选[14-16]、声波分选[17-18]、热控分选[19]、“油包水液滴”介电泳[20]、光镊/声镊分选[21-22]、微气泡分选[23-25]。其中, 微气泡分选是近几年最新发展的方法, 具备作用力强、适用性广、速度快、频率高、生物兼容性好的优点。但现有的激光空化微气泡和热空化微气泡分选方案的外设复杂、微加工要求高。对此, 本文研究了电火花微气泡分选方法, 仅用一对电极就能在确定的时间和空间上产生可控的空化微气泡。
1 3-D微流体聚焦芯片1.1 聚焦芯片的设计设计2种3-D流体动力聚焦的微流体芯片并命名为设计1与设计2, 各由3层150 μm厚的微流道结构组成, 鞘液QSH和样本流QS由注射泵通过1 mm内径的硅胶管注入, 如图 1所示。
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| 图 1 (网络版彩图)3-D聚焦芯片 |
| 图选项 |
设计1中样本流首先在区域A被鞘液从上下夹心, 并在区域B受流道高度收缩的作用而被挤压成一薄层, 从而完成垂直聚焦；而后在区域C被两侧的鞘液均匀挤压, 并随流道宽度的收紧而逐渐完成水平聚焦；最终在区域D, 截面300 μm × 150 μm的微流道内实现3-D聚焦。设计2中样本流先在区域A完成水平聚焦, 后在区域B被鞘液包裹并在区域C进行垂直聚焦, 最终在区域D完成3-D聚焦。设计1的液流始终保持层流状态, 故而可在宽流速范围内实现有效聚焦。通过设计微流道流阻能够使鞘液流中分别用于垂直聚焦和水平聚焦的流量QSHV和QSHH按照最佳比例kQ=1:8进行分配[26], 表示如下：
| $\frac{{{Q_{{\rm{SHH}}}}}}{{{Q_{{\rm{SHV}}}}}} = \left( {\frac{{{l_1} + {l_2}}}{{4{A_1}d_1^2}} + \frac{{{l_3}}}{{{A_3}d_3^2}} + \frac{{{l_4}}}{{{A_4}d_4^2}}} \right)/\left( {\frac{{{l_5}}}{{{A_5}d_5^2}}{K_1}} \right) + {K_2}.$ | (1) |
1.2 聚焦芯片的测试2种微流体芯片采用5层玻璃胶合而成, 中间3层薄玻璃为结构层, 外部2层为盖板, 微流道结构由精密机加工完成。由于加工误差, 3-D聚焦处微流道的实际截面尺寸为310 μm×167 μm。通过共聚焦显微镜Nikon A1直观地观测3-D聚焦效果, 关键区域的聚焦形貌如图 2所示, 其中样本流为红色的罗丹明B溶液, 鞘液流为绿色的荧光素钠溶液, 流量分别是60 μL/min和7.2 mL/min。测试结果与前文设计吻合, 样本流被稳定地聚焦在流道中心, 截面尺寸通过图像处理的方法测出, 其流速按照矩形流道的流场分布V计算[29], 表示如下：
| $\begin{array}{l}V\left( {y, z} \right) = \frac{{4{b^2}}}{{\mu {{\rm{ \mathsf{ π} }}^3}}}\left( { - \frac{{{\rm{d}}P}}{{{\rm{d}}x}}} \right) \times \sum\limits_{n = 0}^\infty {\frac{{{{\left( { - 1} \right)}^n}}}{{{{\left( {2n + 1} \right)}^3}}}} \cdot \\{\left\{1 - \frac{{{\rm{cosh}}\left[ {\left( {2n + 1} \right){\rm{ \mathsf{ π} }}y/b} \right]}}{{{\rm{cosh}}\left[ {\left( {2n + 1} \right){\rm{ \mathsf{ π} }}a/2b} \right]}}\right\}}{\rm{cos}}\left[ {\frac{{\left( {2n + 1} \right){\rm{ \mathsf{ π} }}z}}{b}} \right]\end{array}$ | (2) |
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| 图 2 (网络版彩图)共聚焦显微镜观测微流体芯片的聚焦效果 |
| 图选项 |
其中：(y, z)为原点在中心的微流道截面, x为垂直截面方向, P为压力, a和b为流道宽度和高度。
测试不同条件下的聚焦效果。对于设计1, 首先验证其在宽流速范围内有效聚焦的能力, 取样本QS和鞘液流量QSH分别为k×60 μL/min和k×7.2 mL/min, k取1/6、0.5、0.75、1、1.25、1.5和2, 对应样本流流速为0.7~9.1 m/s。取聚焦后样本流截面的高度和宽度的均值作为聚焦尺寸, 用以表征聚焦效果, 则对应的测试结果为18、16、17、19、18、19和19 μm。数值相近, 这是因为QS和QSH的比例恒定。测试中数据的均方差均小于1 μm(10次), 说明聚焦芯片性能稳定。另一方面, 流式检测一般是在固定流速下进行, 因而不妨取QSH为7.2 mL/min(对应4.8 m/s)并调节QS为k×60 μL/min, k取1/6、0.5、0.75、1、1.25、1.5和2。测试结果为11、15、17、19、19、20和21 μm, 截面尺寸随流量增加而增大。对于设计2, 首先确定最佳流速, 固定QS为60 μL/min并调节QSH在区间3.6~9.6 mL/min内变化(流速2.4~6.3 m/s)。在4.8 m/s时样本流的截面尺寸最小, 为直径15 μm的圆形。而后, 采用固定流速的测量方法, 结果显示截面宽度与流量成正比关系, 宽度分别为8、10、12、15、19、23和30 μm, 但是高度基本保持15 μm不变。这表明水平聚焦和垂直聚焦的过程相对独立。设计的2种微流体聚焦芯片的测试结果优于现有的片上聚焦方案[28], 且与传统流动室可比, 例如在样本流60 μL/min时商业仪器BD Calibur和C6的聚焦尺寸分别为15 μm和22 μm。
2 二元光学光斑整形器件2.1 光斑整形器件的设计二元光学器件是具有台阶状表面浮雕结构的衍射光学器件, 通过相位差对入射光每点的相位进行调制, 从而在输出焦面上形成期望的光斑形貌, 如图 3a和3b。设入射光为A(x, y)exp[iθ(x, y)]、激光光斑的幅值分布为U(u, v), (x, y)和(u, v)分别表示输入和输出平面。通过二元光学器件引入相位θBOE(x, y), 改变输入光G(x, y)为A(x, y)exp[iθ(x, y)+iθBOE(x, y)], 根据Fourier光学知其满足
| $U(u, v) = \frac{1}{{\lambda f}} \cdot F\left[ {G(x, y)} \right].$ | (3) |
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| 图 3 (网络版彩图)二元光学器件 |
| 图选项 |
其中：F表示Fourier变换, f表示聚焦透镜的焦距。设计3种整形器件, 对应输出3种矩形平顶光斑, 分别是单矩形、双矩形和三矩形, 见图 3c。检测时光斑的长边垂直于流路, 细胞沿短边方向通过。3种光斑的短边长度相同, 因而具有相同的空间分辨率。入射光为直径3 mm和波长488 nm的TEM00单模激光, 取二元光学器件上的采样点为128×128, 聚焦透镜的焦距10 mm。通过ST-GS迭代算法[30]求解的二元光学相位分布见图 3d, 输出光斑见图 3e。计算得输出光斑的效率η分别为85%、84%和89%, 幅值均匀性RmsA(相对均方根误差)分别为10%、10%和15%。
2.2 光斑整形器件的测试二元光学器件的相位θBOE(x, y)和台阶高度HBOE(x, y)的关系为θBOE(x, y)=2π×HBOE(x, y)/λ/(n-1), 其中λ和n分别激光波长和基底透明材料的折射率。二元光学器件通过4次刻蚀石英晶元加工而成, 并对表面相位进行了24阶量化, 图 3b是通过显微镜Keyence VHX-6000观测的表面形貌。测试采用光斑质量仪Thorlabs BC106N-VIS和光功率计Coherent MaxII。考虑到光斑质量仪的6.5 μm像素尺寸与光斑尺寸接近, 因而用焦距100 mm的透镜替代10 mm焦距透镜, 从而将光斑尺寸放大为实际使用值的10倍。观测图 3f中的实测结果, 光斑具有尺寸精准、边界锐利、高效率的优点。但是在均匀性方面有所下降, 可能由于以下2个原因：其一, 二元光学器件对加工精度要求较高, 加工误差会引起均匀性下降；其二, 激光光斑尺寸是设计二元光学器件的关键参数, 设计时采用的是厂家提供的3 mm的激光直径, 而实际测试中发现直径为2.8 mm, 因此光斑尺寸偏离也会导致激光能量分布的均匀性下降。
3 电火花空化微气泡片上分选3.1 片上分选的原理在微流体聚焦芯片设计2中加入一对金属电极, 如图 4a所示。待测细胞首先被激光照射并完成荧光检测, 如被判别为目标细胞, 则对电极施加脉冲电压, 当电场强度大于电极间液体的击穿电压时则产生等离子体导电通道并伴随局部高温, 进而使液体气化形成空泡[31]。在封闭空间, 膨胀气泡产生的射流冲击主流道中的目标细胞, 迫使后者改变运动轨迹并进入下游不同的流道, 从而实现分选。该方案最大的优点是简单易行。
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| 图 4 (网络版彩图)电火花空化片上分选技术 |
| 图选项 |
3.2 片上分选的可行性验证采用高速摄像机Photron FastCam SA1.1观测, 鞘液选用击穿场强5~7 kV/cm的10 mM磷酸缓冲盐溶液, 施加4 μs的630 V方波电脉冲信号, 电极为湿法刻蚀加工的不锈钢片。典型分选过程如图 4b所示, 可在250 μs内完成一次分选, 因而理论最高分选速率可达4 000个/s。但在击穿过程中会伴随产生电解氢气和氧气[32], 因而需要等待电解气体排出以及液体绝缘性的完全恢复。经测试, 分选能够在200 Hz频率下稳定工作。图 4c为高速摄像机拍摄的单个微粒在分选前、中、后的运动轨迹, 图像由ImageJ软件合成。分选作用不会影响其前后200 μs的微粒, 说明该分选方案具有良好的精准性。研究表明[24, 32], 通过调整液体介电性、增加脉冲电压、增加更新液流等方法, 能够进一步提升分选的通量。
4 微流体流式系统测试4.1 测试系统综合测试系统如图 5a所示。分析对象为聚苯乙烯(PS)标准荧光微球(上海辉质, 激发波长488 nm, 发射波长530 nm), 荧光脉冲信号由光电倍增管PMT收集。3种光斑对应的荧光信号如图 5b所示, 信号具有出色的信噪比和锐利的边界, 取信号的时间积分(面积)或高度表征信号强度。
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| 图 5 (网络版彩图)微流体流式测试系统 |
| 图选项 |
4.2 检测通量与CV值流式系统中最为常用的两个评价指标是检测通量和检测稳定性, 后者即信号强度的变异系数(coefficient of variation, CV)。系统在4.8 m/s流速下的检测通量可达40 000个/s, 达到了传统流式的检测通量(多为1~4万个/s), 能够满足常规的检测要求(一般 < 1 000个/s)。测定CV值时, 采集12 000个以上的荧光信号并绘制强度分布直方图, 如图 5c所示, 而后按照90%圈门以排除明显偏离的数据并计算门内数据的CV值。
测量不同情况下的CV值。第1组实验, 采用微流体聚焦芯片设计1、单矩形光斑和5 μm荧光微球, 在0.7~9.1 m/s的流速下测量CV, 如表 1所示。流速低则CV值小、稳定性好, 这是由于低流速时增加了激光对细胞的照射时间。但在0.7 m/s时CV偏高, 通过显微镜观测这是由于注射泵控制精度下降导致液路振荡而造成的。
表 1 不同流速下的CV
| 编号 | QS | QSH | VS | CV | |||
| μL·min-1 | mL·min-1 | m·s-1 | % | ||||
| 1 | 10 | 1.2 | 0.73 | 7.3 | |||
| 2 | 30 | 3.6 | 2.4 | 6.8 | |||
| 3 | 45 | 5.4 | 3.6 | 7.2 | |||
| 4 | 60 | 7.2 | 4.8 | 8.1 | |||
| 5 | 75 | 9.0 | 5.8 | 8.5 | |||
| 6 | 90 | 10.8 | 6.9 | 9.3 | |||
| 7 | 120 | 14.4 | 9.1 | 12.4 |
表选项
第2组实验采用设计1聚焦芯片、3种矩形光斑和5 μm荧光微球, 固定鞘液流量7.2 mL/min, 即4.8 m/s, 调节样本流量, 结果如表 2所示。同时采用BD Fortessa和BD Accuri C6测量, 流量分别为12、35、60 μL/min和14、35、66 μL/min, CV分别为6.8%、6.9%、6.8%和8.0%、8.8%、8.8%。可知：1)三矩形光斑的CV最优, 双矩形次之, 再次是单矩形, 这再次说明了增加照射时间能够提升检测稳定性；2)整体上样本流量增加会使得CV增大, 这是由于聚焦后样本流的截面面积增大而使得微粒分布变大, 但在90 μL/min以下基本能保持稳定；3)系统的CV检测效果优于C6、与Fortessa可比, 表明微流体流式系统具有优良的稳定性。
表 2 不同样本流量下的CV
| 编号 | QS | 单矩形 CV/% | 双矩形 CV/% | 三矩形 CV/% |
| μL·min-1 | ||||
| 1 | 10 | 7.4 | 6.7 | 5.2 |
| 2 | 30 | 7.8 | 6.7 | 5.1 |
| 3 | 45 | 7.3 | 6.7 | 5.5 |
| 4 | 60 | 8.1 | 7.0 | 5.3 |
| 5 | 75 | 8.2 | 6.9 | 5.3 |
| 6 | 90 | 8.0 | 6.9 | 5.3 |
| 7 | 120 | 8.6 | 7.6 | 5.7 |
表选项
第3组实验, 采用设计2聚焦芯片、单矩形光斑和不同尺寸的荧光微球, 固定鞘液流量7.2 mL/min, 调节样本流量, 结果如表 3所示。可知：1)与第二组实验相同, 样本流量增加则CV增大；2)在微流体流式系统中, 大的微球的CV更低, 因为大微球在惯性作用下更容易保持在流道中心位置进而使激光激发条件更为一致；3)对比表 4和5, 微流体流式系统性能整体优于C6、与Fortessa可比。
表 3 不同尺寸荧光微球的CV
| 编号 | QS | 3 μm微球 CV/% | 5 μm微球 CV/% | 7 μm微球 CV/% |
| μL·min-1 | ||||
| 1 | 10 | 8.9 | 6.2 | 5.0 |
| 2 | 30 | 8.6 | 6.5 | 5.1 |
| 3 | 45 | 9.0 | 6.3 | 5.5 |
| 4 | 60 | 9.6 | 7.3 | 5.8 |
| 5 | 75 | 10.5 | 8.1 | 5.5 |
| 6 | 90 | 11.0 | 8.5 | 6.1 |
| 7 | 120 | 11.3 | 8.5 | 6.1 |
表选项
表 4 BD Fortessa测量不同尺寸荧光微球的CV
| 编号 | QS | 3 μm微球 CV/% | 5 μm微球 CV/% | 7 μm微球 CV/% |
| μL·min-1 | ||||
| 1 | 12 | 5.6 | 6.8 | 9.7 |
| 2 | 35 | 5.8 | 6.9 | 9.2 |
| 3 | 60 | 5.9 | 6.8 | 9.9 |
表选项
表 5 BD C6测量不同尺寸荧光微球的CV
| 编号 | QS | 3 μm微球 CV/% | 5 μm微球 CV/% | 7 μm微球 CV/% |
| μL·min-1 | ||||
| 1 | 14 | 12.1 | 8.0 | 13.4 |
| 2 | 35 | 13.0 | 8.8 | 14.7 |
| 3 | 66 | 13.7 | 9.1 | 14.8 |
表选项
4.3 微球测试与尺寸测量由于采用了独特的矩形准平顶光斑, 测试系统还能够提供更为丰富的检测信息。利用光斑尺寸精准的特点, 使用双矩形和三矩形光斑对同一微球多次激发, 能够对微球的流速进行实时测试。流速计算为(L/T1+L/T2)/2, 其中L为2个50 μm×10 μm单矩形的间距, T1和T2为2个脉冲信号上升沿和下降沿的时间差。取QS和QSH分别为k×60 μL/min和k×7.2 mL/min, k取1/6、0.5、0.75、1、1.25、1.5和2, 单次测试样本量不少于2 000个, 测试结果如图 6所示，实测值与理论和仿真结果吻合度高；双矩形和三矩形光斑的测量结果一致, 证明了该方法的普适性；各组测试中流速的CV在1%~5 %之间, 说明聚焦稳定性良好。
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| 图 6 (网络版彩图)利用双矩形和三矩形光斑测量微球速度 |
| 图选项 |
得益于二元光学整形所成的边界清晰的矩形光斑, 通过分析荧光信号的宽度能够得出微球的绝对尺寸, 其原理为：信号宽度=(光斑宽度+微球直径)/速度。测量3、5、7和10 μm标准荧光微球各5 000个以上, 测试结果分别为(3.2±1.7) μm、(4.8±0.9) μm、(5.8±1.1) μm和(9.0±1.6) μm。这种方法的测量稳定性和准确度还有待提高, 特别是小尺寸微球的测量偏差大。但是该方法的实用性明显, 具备测量细胞绝对尺寸的潜力。
4.4 分选对检测的影响将具备分选功能的微流体芯片加装在测试系统中进行测试。按照200 Hz的频率稳定工作, 发现分选开启前后, 荧光信号面积的CV略有恶化, 分别为7.8%和8.7%, 而信号高度的CV保持不变, 分别为2.4%和2.1%。这说明分选会扰动微球通过光斑的时间但不会影响信号幅值, 总体影响较为有限。另一方面, 对分选过程对细胞活性的影响进行了分析。收集7 779个没有被分选冲击的Hela细胞和6 143个被冲击的相同Hela细胞。利用0.4%的台盼蓝溶液染色, 通过细胞计数器Fisher Countless Ⅱ测定细胞活性分别为95%和85%。这说明分选冲击会在一定程度上影响细胞活性, 这也是分选型流式中的一种常见现象。
5 总结本文对微流体流式细胞仪的3项关键技术分别进行了系统的研究, 并对整合这3项技术的微流体芯片进行了流式检测的系统性验证。实验结果表明：样本聚焦技术达到了传统流式的效果；基于二元光学器件整形的矩形光斑不仅能够满足常规流式检测需求, 还能够得到样本颗粒的尺寸信息；此外, 采用电火花空化微气泡片上分选技术实现了对单细胞的精准分选。微流体流式细胞仪具有结构简单、容易集成的优点, 系统整体性能可与商用大型流式仪器相比。未来, 将进一步提升分选的速度和通量, 重点研究微光学分光检测技术、数据解析算法、微流体芯片加工技术, 以求研制功能丰富、性能优异、操作稳定、便捷小巧的分选型微流体流式细胞仪。
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