, 吴永贵1,2,3
, 王晓睿1, 杨开智1, 王铁运11. 贵州大学资源与环境工程学院, 贵阳 550025;
2. 贵州大学应用生态研究所, 贵阳 550025;
3. 贵州喀斯特环境生态系统教育部野外观测研究站, 贵阳 550025
收稿日期: 2020-06-09; 修回日期: 2020-07-24; 录用日期: 2020-07-24
基金项目: 国家重点研发计划项目(No.2018YFC1903501);国家自然科学基金委员会-贵州喀斯特科学研究中心项目(No.U1612442);贵州省百层次创新人才培养计划项目(No.黔科合平台人才(2020)6002);贵州省科技计划项目(No.黔科合LH字(2018)7289)
作者简介: 谢荣(1994-), 男, E-mail: xier1149@163.com
通讯作者（责任作者）: 吴永贵, 男, 教授, 博士生导师, 主要从事污染生态效应, 污染生态控制及环境生态修复方面的教学研究工作.E-mail: ygwu72@126.com
摘要：以斑马鱼（Danio rerio）为受试鱼种，研究了磷石膏浸出液对水生生物的急性毒性及亚致死浓度下对斑马鱼肝脏、肌肉和鳃中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和丙二醛（MDA）的影响，以及96 h后肝脏和鳃组织病理变化.结果表明，磷石膏浸出液中总磷、氟化物和Cd、Cr、Pb、Hg浓度超出地表水Ⅴ类水标准，其对斑马鱼的毒性较强，96 h半数致死浓度（LC50）为6.5%（体积分数）.慢性毒性实验显示，随暴露时间延长，各组织内3种抗氧化酶活性变化趋势不完全一致，但高浓度（0.65%和3.25%）暴露后期（72 h和96 h）几乎均受到显著抑制，其中，SOD对浸出液的敏感性最高；MDA含量变化规律较为一致，随浸出液浓度增加而升高，肝脏、肌肉和鳃中MDA最高含量均出现在72 h，分别是空白对照组的1.8、1.6和2.1倍，至96 h时略有降低，但仍显著高于对照组.各浓度组暴露96 h后，肝细胞窦间隙扩大，肝巨噬细胞增多，细胞核固缩，部分细胞质空泡化，组织水肿；鳃组织出现上皮细胞增生、脱落，鳃丝充血，鳃小片弯曲变形等现象.综上，未加处理的磷石膏浸出液已超出斑马鱼耐受极限，任其排入环境具有潜在的生态风险.
关键词：磷石膏浸出液斑马鱼急性毒性抗氧化酶组织损伤
Acute toxicity and oxidative stress damage of phosphogypsum leachate to zebrafish (Danio rerio)
XIE Rong1
, WU Yonggui1,2,3, WANG Xiaorui1, YANG Kaizhi1, WANG Tieyun11. School of Resources and Environmental Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025;
2. Institute of Applied Ecology, Guizhou University, Guiyang 550025;
3. Guizhou Karst Environmental Ecosystem Observation and Research Station, Ministry of Education, Guiyang 550025
Received 9 June 2020; received in revised from 24 July 2020; accepted 24 July 2020
Abstract: The zebrafish as the test organism was used to study the toxicity of phosphogypsum leachate to aquatic organisms. The changes in superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and malondialdehyde (MDA) in zebrafish liver, muscle and gill tissue and the pathological changes of their liver and gill tissues were measured. The results showed that the concentration of total phosphorus, fluoride, Cd, Cr, Pb, and Hg in the phosphogypsum leachate exceeded the Class V standard for surface water, which exhibited a highly toxic to zebrafish, and its 96-hour median lethal concentration (LC50) was 6.5%. The changing trends of the three antioxidant enzyme activities in each tissue are not completely consistent as the exposure time increased. However, almost all of them were significantly inhibited, and SOD was highest sensitive to phosphogypsum leachate in the high concentration (0.65% and 3.25%) and the later period of exposure (72 h and 96 h). The MDA exhibited a similar change trend that increased with the concentration of the leachate increased. The highest contents of MDA in liver, muscle and gills all appeared at 72 h and their contents were 1.8-, 1.6- and 2.1-time of the blank control group, respectively. The MDA contents decreased slightly at 96 h but they were still significantly higher than that of the control group. The hepatocyte sinusoid space expanded, the liver macrophages increased, the nucleus was pykeptic, some of the cytoplasm was vacuolated, and the tissue was edema after the zebrafish were exposed to different concentrations of leachate for 96 hours. The phenomena of epithelial cells were proliferated and fall off in the gill tissue, gill filaments were congested, and gill pieces were bent and deformed were observed. In summary, the toxicity of the untreated phosphogypsum leachate exceeded the tolerance limit of zebrafish, which will caused a potential ecological risks after the leachate discharge into the environment without taking any measures.
Keywords: phosphogypsum leachatezebrafishacute toxicityantioxidant enzymetissue damage
1 引言(Introduction)中国是一个农业大国, 农业经济发展带动了磷肥产业发展, 2005—2018年, 我国磷肥产量(折P2O5)由1125万t增长至1696万t, 年均递增3.2%(纪罗军等, 2006；中国磷复肥工业协会, 2019).磷肥的生产离不开磷酸, 而超过90%的磷酸是通过湿法工艺制得, 磷石膏是该工艺的主要副产物, 也是化工行业排放量最大的固体废渣之一, 每生产1 t磷酸会带来4~5 t磷石膏(Tayibi et al., 2009；Yang et al., 2013；Yang et al., 2016).据统计, 2018年中国磷石膏产量约7800万t, 但资源化综合利用率不足40%, 目前国内磷石膏堆存量已超过5亿t(叶学东, 2019；马丽萍, 2019).磷矿粉经硫酸处理后排放的磷石膏因富含氢离子而呈强酸性(pH为2~4.5), 并含有较高浓度的磷和氟化物及多种重金属污染物质(Nizevi?ien? et al., 2018).王萍等(2019)在研究分析贵州岩溶山地磷石膏堆场排水、侵蚀冲沟水和洼地积水时发现, Pb、Cd、Cr、As和Hg等重金属浓度超出地表水Ⅲ类水标准.研究表明, Pb的摄入会损伤血脑屏障, Cd与Ca存在拮抗作用会破坏骨钙, Cr和Cd具有协同作用, As和Hg均可对生物神经系统产生干扰, 从而影响机体的正常生化和生理活动(Johnson, 2001；李敏等, 2006；宋志慧等, 2011；Li et al., 2018).因此, 磷石膏不仅在堆存方面占用大量土地资源(郑磊等, 2017), 且其中多种有害物质经雨水淋溶、冲蚀作用随浸出液通过地表或地下径流向堆场以外区域扩散, 进而可能对周边及下游的生态环境及水生生物造成危害.近年来, 中央和地方政府相继出台了磷石膏“以用定产”政策(国务院办公厅, 2018；贵州省政府, 2018；云南省安宁市政府, 2019), 争取实现磷石膏产消平衡, 以减少磷石膏露天堆存对生态环境的破坏, 包括对水生生物的毒害.严峻的磷石膏污染致使水体生物遭受毒害的问题虽已受到重视, 但目前关于磷石膏对水生生物的毒性效应及氧化应激损伤方面的研究报道却相对缺乏.
斑马鱼(Danio rerio)具有体型小、易于饲养、繁殖周期短等优点, 被经济合作与发展组织(OECD)推荐用于各种类型的生态毒理学测试(OECD, 2013).当生物受到逆境胁迫时, 体内酶活性水平会出现较大的波动, 丙二醛(MDA)含量也会随之升高或降低, 现代毒理学研究常将这些物质作为反映生物氧化应激的标志物(徐湘博等, 2014；罗妮娜, 2016).基于此, 本研究拟采用斑马鱼为试验对象, 探讨磷石膏样品浸出液对斑马鱼的半数致死浓度(LC50)、亚致死浓度下对斑马鱼的组织损伤及肝脏、肌肉和鳃中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性及MDA含量的影响, 综合分析磷石膏浸出液对斑马鱼的毒性效应, 为评价大型磷石膏露天堆场的潜在生态风险和对水生生物的危害提供数据支撑.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 实验材料2.1.1 磷石膏浸出液本研究所用磷石膏样品来自贵州省福泉市马场坪镇某大型磷石膏露天堆场, 采集磷石膏鲜样, 风干后混合均匀.浸出液提取参考《固体废物浸出毒性浸出方法—水平振荡法》(HJ 557—2010), 用具盖坩埚盛装磷石膏, 在105 ℃下烘干至恒重, 计算含水率为13.2%, 称取100 g磷石膏样品置于2 L提取瓶中, 按液固比10 ∶ 1(L/kg)加入1 L浸提剂后盖紧瓶盖, 将提取瓶垂直固定在水平振荡器上, 设置频率为115次· min-1、振幅为40 mm, 室温下振荡8 h再静置16 h, 最后经压力过滤器抽真空收集得到浸出液备用.
2.1.2 实验生物实验用斑马鱼购自贵阳市某花鸟市场, 暴露实验开展前驯化培养1周, 每日换水(1/2)并投饵1次, 随后停止投饵2 d, 筛选健康活泼且体长范围在(3.0±0.25) cm的斑马鱼.
2.1.3 主要仪器与试剂使用仪器有电子分析天平、水族箱、高速离心机、紫外分光光度计、多功能酶标仪、共聚焦荧光显微镜、匀浆器等；SOD、CAT、GPx和MDA试剂盒.
2.2 实验方法2.2.1 磷石膏浸出液成分测定pH测定采用玻璃电极法；总磷测定采用钼酸铵分光光度法；氟化物测定采用离子电极法；重金属(As、Cd、Cr、Cu、Ni、Pb、Zn、Hg)测定采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES, 美国赛默飞).
2.2.2 浸出液对斑马鱼的暴露实验急性毒性测试参照《水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》(GB/T 13267-91), 采用静水方式进行, 暴露时长为96 h.根据预实验结果, 按照等比设置浸出液浓度, 用标准稀释水将磷石膏浸出液分别稀释为5.0%、6.2%、7.9%、10.0%、12.6%和15.8%(体积分数, 下同), pH依次为5.5、5.2、5.0、4.8、4.7、4.6.每组设置3个平行, 同时设置1个对照组, 分别投放25条斑马鱼, 实验在水族箱中进行, 实验期间持续曝气, 分别在24、48、72及96 h时记录斑马鱼死亡数量并及时清除死鱼(用玻璃棒轻触斑马鱼躯体, 斑马鱼无任何反应即确认死亡).
根据急性毒性实验结果, 设置1个对照组和4个实验组(0.11%(1/60 96 h LC50)、0.22%(1/30 96 h LC50)、0.65%(1/10 96 h LC50)和3.25%(1/2 96 h LC50)), pH分别为7.6、7.2、7.0、6.9、6.9.同样每个水族箱投放25条经筛选后的健康斑马鱼, 水温保持在(25±2) ℃, 光暗比14 h ∶ 10 h, 实验期间不喂食, 持续96 h.每24 h更换一次溶液并随机选取斑马鱼, 在冰袋上放置玻璃片解剖分离肝脏、肌肉和鳃组织备用, SOD、CAT、GPx及MDA测定按照试剂盒说明书操作, 另取各组织固定于4%多聚甲醛中.
2.2.3 斑马鱼各组织形态学观察取固定48 h后的斑马鱼肝脏和鳃组织, 经10%EDTA脱钙, 梯度酒精(85%→95%)脱水, 石蜡包埋, 切片, H-E染色, 二甲苯透明, 中性树胶封固, 最后置于Nikon ECLIPSE 80i共聚焦荧光显微镜下观察并拍照.
2.3 数据处理磷石膏浸出液处理斑马鱼后, LC50采用Probit回归模型计算, 采用SPSS软件对慢性毒性实验结果进行单因素方差分析(one-way ANOVA), 采用LSD检验, p < 0.05.使用Origin2017绘图, 分析各组间差异的统计学意义, 最终结果以均值±标准偏差(SD)表示.
3 结果(Results)3.1 磷石膏浸出液的污染特性磷石膏浸出液水质特征如表 1所示, pH为3.7, 酸性较强, 非重金属类污染物有总磷和氟化物, 浓度分别是《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)Ⅴ类水标准的86.6倍(湖、库)和5.7倍；8种重金属类污染物中, Zn浓度最高(743.8 μg · L-1), Hg浓度最低(7.6 μg · L-1), 其中, Cd、Cr、Pb和Hg属于高致毒性重金属且超出地表水Ⅴ类水标准.磷石膏浸出液中污染物成分复杂, 含有多种潜在生态风险因子.
表 1(Table 1)
| 表 1 磷石膏浸出液水质特征 Table 1 Water quality characteristics of phosphogypsum leachate | ||||||||||||||||||||||||||||||
表 1 磷石膏浸出液水质特征 Table 1 Water quality characteristics of phosphogypsum leachate
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3.2 浸出液对斑马鱼的急性毒性实验期间主要观察斑马鱼的游动和呼吸行为, 以及鱼鳃和体表颜色等身体变化特征.斑马鱼在不同浓度磷石膏浸出液暴露下呈明显的中毒症状, 除5.0%组外, 其余浓度组在8 h内均出现异常反应, 包括身体翻转失衡、急促游动、呼吸频率加快(鳃盖张合频繁), 随暴露时间持续, 斑马鱼行为变缓, 反应迟钝, 对外界刺激回应减弱(如敲击水箱壁或玻璃棒碰触鱼身), 鳃盖张合无力, 身体侧翻, 逐渐下沉, 随后卧躺于水箱底部, 直至死亡；死亡后斑马鱼体表有白色丝状絮体附着, 鱼鳃水肿, 呈紫红色.整个实验阶段对照组斑马鱼体征良好, 能自如游动, 保持平衡, 对外界刺激有明显回避行为.
磷石膏浸出液对斑马鱼的急性毒性实验结果与半数致死浓度分别如表 2和表 3所示, 24、48、72和96 h的LC50分别为10.8%、8.5%、7.1%、6.5%.
表 2(Table 2)
| 表 2 磷石膏浸出液对斑马鱼的急性毒性实验结果 Table 2 Acute toxicity test results of phosphogypsum leachate to zebrafish | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 2 磷石膏浸出液对斑马鱼的急性毒性实验结果 Table 2 Acute toxicity test results of phosphogypsum leachate to zebrafish
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表 3(Table 3)
| 表 3 磷石膏浸出液对斑马鱼的LC50 Table 3 LC50 of phosphogypsum leachate to zebrafish | ||||||||||||||||||||
表 3 磷石膏浸出液对斑马鱼的LC50 Table 3 LC50 of phosphogypsum leachate to zebrafish
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3.3 磷石膏浸出液对斑马鱼生理指标的影响3.3.1 磷石膏浸出液对斑马鱼SOD活性的影响如图 1a所示, 随暴露时间的持续, 各浓度组肝脏SOD活性先被诱导后逐渐受到抑制.0.11%组肝脏SOD活性在24、48和72 h时显著增加(p < 0.05), 分别是对照组的1.4、1.1和1.6倍；0.65%和3.25%组肝脏SOD活性在所有时间点均受到显著抑制(p < 0.05).24 h时, 肌肉SOD活性仅在0.65%组显著低于对照组(p < 0.05)；0.11%组SOD活性在48 h和96 h时显著升高(p < 0.05), 两者分别比对照组的1.6和1.3倍；72 h时, 除3.25%组外, 其余组SOD活性均受到显著抑制(p < 0.05)(图 1b).各浓度组鳃SOD活性在24 h和96 h时大部分受到显著抑制(p < 0.05)；鳃SOD活性在48 h时的0.22%组和72 h时的0.65%组则被显著诱导(p < 0.05), 分别为对照组的1.3和1.5倍(图 1c).
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 斑马鱼肝脏(a)、肌肉(b)和鳃(c)SOD活性的变化 (同一时间点不同处理间没有相同小写字母表示差异显著(p < 0.05), 下同) Fig. 1Changes of SOD activity in liver (a), muscle (b) and gill (c) of zebrafish |
3.3.2 磷石膏浸出液对斑马鱼CAT活性的影响从图 2a可以看出, 短期(24 h和48 h)暴露, 肝脏CAT活性先增加后降低, 两个时间点的0.65%组CAT活性被显著诱导(p < 0.05)；72 h和96 h时的0.65%和3.25%组CAT活性显著降低(p < 0.05).24 h时, 肌肉CAT活性无明显规律；但第48 h时, CAT活性均高于对照组, 仅0.65%组无显著差异(p>0.05)；0.65%、3.25%组CAT活性在72 h和96 h时较对照组显著降低(p < 0.05)(图 2b).4个时间点的鳃CAT活性变化相似, 随暴露浓度增加先升高后降低, 并且各浓度组CAT活性在72 h和96 h时几乎均受到显著抑制(p < 0.05)(图 2c).
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 斑马鱼肝脏(a)、肌肉(b)和鳃(c)CAT活性的变化 Fig. 2Changes of CAT activity in liver (a), muscle (b) and gill (c) of zebrafish |
3.3.3 磷石膏浸出液对斑马鱼GPx活性的影响由图 3a可知, 各时间点肝脏GPx活性变化均呈现随浓度增加先升高后降低的趋势.0.11%组肝脏GPx活性受到显著诱导(p < 0.05)；96 h时, GPx活性在0.22%、0.65%和3.25%组显著降低(p < 0.05).0.11%组肌肉GPx活性仅72 h时显著降低(p < 0.05), 其余时间点的GPx活性较对照组均显著增加(p < 0.05), 72 h时GPx活性在0.22%组显著增加(p < 0.05)；各时间点的0.65%和3.25%组GPx活性受到显著抑制(p < 0.05)(图 3b).鳃GPx活性总体上先升高后降低, 0.11%组在24 h和48 h时与0.22%组在24 h和72 h时的GPx活性受到显著诱导(p < 0.05)；0.65%、3.25%浓度组GPx活性在24、48和96 h时显著降低(p < 0.05)(图 3c).
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 斑马鱼肝脏(a)、肌肉(b)和鳃(c)GPx活性的变化 Fig. 3Changes of GPx activity in liver (a), muscle (b) and gill (c) of zebrafish |
3.3.4 磷石膏浸出液对斑马鱼MDA含量的影响图 4a为斑马鱼肝脏中MDA含量的变化, 24 h时, 肝脏MDA含量先降低后升高；除24 h外, 其余时间点所有暴露组MDA含量几乎均显著增加(p < 0.05), 最高含量为对照组的1.8倍.肌肉MDA含量变化在24 h和48 h时规律不明显；72 h和96 h时MDA含量随浓度增加而持续升高, 差异性显著(p < 0.05), 最高含量分别是对照组的1.6和1.5倍(图 4b).鳃组织MDA含量变化与肝脏和肌肉相似, 最高含量出现在72 h时的3.25%组, 是对照组的2.1倍(图 4c).
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 斑马鱼肝脏(a)、肌肉(b)和鳃(c)MDA含量的变化 Fig. 4Changes of MDA content in liver (a), muscle (b) and gill (c) of zebrafish |
3.4 磷石膏浸出液对斑马鱼肝脏和鳃组织解剖结构的影响从图 5可以看出, 对照组(图 5a)斑马鱼的肝细胞多呈近圆形的多角形, 可见中心细胞核及细胞质, 各细胞间边界明显, 排列有序形成肝板, 肝血窦少且窦间隙较小.在0.11%浓度下(图 5b), 少数肝细胞出现肿大, 肝血窦增加且窦间隙轻微扩张, 并有少量肝巨噬细胞存在.随暴露浓度增加(0.22%), 肝脏细胞逐渐出现轻微水肿、空泡化, 细胞形状失去原有形态, 个别细胞核发生偏移且变形、核固缩变小, 肝细胞无序排列, 细胞边界模糊, 少量细胞核融合(图 5c).0.65%和3.25%组中, 肝细胞窦间隙扩张, 细胞核固缩变小, 核融合明显, 肝巨噬细胞增多, 细胞边界完全消失(图 5d、5e).
图 5(Fig. 5)
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| 图 5 磷石膏浸出液对斑马鱼肝脏组织结构的影响(H-E, 400×) (HC：肝细胞, HS：肝血窦, HP：肝板, HM：肝巨噬细胞, OE：组织水肿, PN：核固缩, V：空泡化, CV：细胞质空泡化；◆：血窦扩张, ■：肝细胞无序, ▲：细胞融合) Fig. 5Effect of phosphogypsum leachate on liver structure of zebrafish (H & E stain, 400×) |
如图 6所示, 空白组(图 6a)鳃丝结构完整, 其上鳃小片由粘液细胞与鳃丝相连, 各鳃小片呈梳状排列, 上皮细胞紧贴于鳃小片上, 未见病变症状.96 h不同浓度磷石膏浸出液暴露后, 各组鳃组织出现一定的病症, 包括鳃丝出血, 上皮细胞增生、脱落等(图 6b、6c).0.65%组上皮细胞增生呈棒状, 且出现一定程度扭曲, 3.25%浓度下鳃小片发生断裂与鳃丝分离, 其他细胞质趋于透明(图 6d、6e).
图 6(Fig. 6)
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| 图 6 磷石膏浸出液对斑马鱼鳃组织结构的影响(H-E, 400×) (PiC：柱细胞, EC：上皮细胞, GF：鳃丝, MC：粘液细胞, SF：鳃小片；▲：鳃丝充血, ■：上皮细胞增生, ◆：上皮细胞脱落, ●：鳃小片断裂, ▲▲：鳃小片扭曲) Fig. 6Effect of phosphogypsum leachate on gill structure of zebrafish (H & E stain, 400×) |
4 讨论(Discussion)外源性污染物对鱼类的毒性强弱一般以LC50作为效应终端来初步判断, 不同污染物在相同暴露时间下对鱼类的LC50越小, 说明该污染物毒性越强(张陆伟等, 2013).本研究结果显示, 斑马鱼死亡率随浸出液浓度增加而升高, 存在明显的剂量-效应关系, 24、48、72和96 h的LC50依次为10.8%、8.5%、7.1%、6.5%.经对比发现, 磷石膏浸出液对斑马鱼的96 h LC50与同类物质较为接近, 如垃圾渗滤液、硫酸锰废渣及铀尾矿浸出液(对斑马鱼的96 h LC50分别为13.2%、2.8%和2.9%)(高静等, 2011；Geng et al., 2012；梅丹等, 2013), 可知磷石膏浸出液仍具有较强毒性.
SOD是生物体抗氧化防御系统最主要的抗氧化酶, 广泛存在于生物体各组织内, 它能歧化超氧阴离子(O2·-)转化为H2O2和O2, 对减轻氧自由基对机体的危害有着重要作用(刘硕等, 2008).许多研究表明, 短时间内低浓度污染物与生物体内SOD活性水平成正比, 可诱导SOD活性升高, 但随暴露时间延长, 高浓度污染物胁迫机体产生的氧自由基超出SOD的清除极限, 对SOD活性产生抑制, 即“毒物兴奋效应”(Stebbing, 1982；江天久等, 2006).本研究结果显示, 肝脏、肌肉和鳃组织SOD活性变化并不完全符合“毒物兴奋效应”, 其中, 0.11%和0.22%组肝脏SOD活性在24 h时显著增加, 而鳃SOD活性显著降低.因为肝脏作为解毒器官, 对进入体内的有毒有害物质能迅速响应, 产生大量的SOD清除氧自由基；鳃是鱼的呼吸器官, 解毒能力弱且有害物质直接作用于鳃, 易被氧自由基攻击.与此类似, 邓思平等(2012)在研究Cd2+暴露对尖紫蛤(Sanguinolaria acuta)抗氧化酶活性的影响时发现, 消化盲囊中SOD活性处于对照水平时鳃SOD活性受到显著抑制, 推测这种差别与消化盲囊对Cd2+的敏感性高于鳃有关.0.65%组鳃SOD活性在72 h时显著诱导, 与肝脏和肌肉SOD活性变化正好相反, 出现这一异常现象可能是由于肝脏和肌肉SOD活性受到过度抑制时, 机体为避免氧化应激而上调鳃SOD相关基因的表达, 补偿其余受损组织, 降低了生物毒性效应(高静等, 2011).96 h时, 肌肉和鳃组织SOD活性在0.65%、3.25%浓度下均受到显著抑制, 肝脏SOD活性则出现恢复趋势, 可能是肝脏对磷石膏浸出液已有一定适应性, 但这并不意味着肝脏损伤减轻, 因为SOD活性仍显著低于对照组, 说斑马鱼体内的SOD不足以清除累积的氧自由基, 细胞受损开始出现坏死.
CAT与GPx同样是抗氧化酶系统的重要组成, CAT能催化经SOD歧化后产生的H2O2分解为O2和H2O, GPx是一种硒(Se)依赖酶, 可将有毒的过氧化物还原成无毒的醇类, 同时促进H2O2的分解(Das et al., 2017).CAT属血红素酶, 不同来源对其影响较大(Sikkema et al., 1994), 肝脏CAT活性在24 h时大部分显著高于对照组, 而肌肉和鳃CAT活性分别仅在0.22%和0.65%浓度下显著高于对照组, 对比图 1a发现此时肝脏SOD活性显著增加, 因此, 肝脏CAT活性被由O2·-转化生成的H2O2所诱导.赵凤元等(2002)在Cd2+对鲢鱼CAT活性的影响研究中也发现类似规律, 不同浓度暴露下肝脏CAT活性显著增加的频率较肌肉和鳃组织更高.各组织GPx活性变化总体呈低浓度诱导-高浓度抑制的趋势, 但24 h和48 h时GPx活性与CAT活性有一定负相关性, GPx受抑制明显比CAT提前.这可能与磷石膏浸出液中含有的有毒重金属种类有关, 其中, Pb、Cd和Hg与GPx活性中心(硒半胱氨酸)的重要构成元素Se存在拮抗作用, 这些重金属可与Se形成多种配合物, 降低了重金属生物毒性, 但GPx也因活性中心被破坏而失活, 因此, GPx比CAT对磷石膏浸出液胁迫更敏感.这与马京津等(2012)的研究报道相似, 其将河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)在Pb2+溶液中暴露15 d, 结果显示, 29.4、58.8 mg · L-1组的卵巢组织GPx活性在第10天就开始被显著抑制, 而CAT活性变化明显较GPx滞后, 58.8 mg · L-1下仅在第15 d受到显著抑制.本研究中CAT活性和GPx活性与SOD活性变化趋势存在差异, 可能因为H2O2并不完全来源于O2·-的歧化反应, 还可由氨基酸或细胞色素P450氧化酶激活产生(王重刚等, 2003；王隽媛等, 2009).本研究中多个时间点的肝脏、肌肉和鳃CAT活性和GPx活性在0.65%和3.25%浓度暴露下均显著低于对照组, 说明过量的H2O2已超出机体的清除极限, 细胞内酶受损, 脂质过氧化物将持续累积.但也有研究表明, 淡水螺(Lymnaea natalensis)分别暴露于0.1、0.1和0.2 mg · L-1的Cu2+、Cd2+和Pb2+溶液中28 d, 期间未检测到淡水螺体内CAT活性和GPx活性水平显著低于对照组(Mnkandla et al., 2019).不同实验观察到的结果不一致, 这可能与暴露污染物种类、浓度、暴露时长、物种特异性及组织特异性差异等有关.
所有细胞成分都可能受到氧自由基的破坏, 尤其是含有多个双键的长链多不饱和脂肪酸更易受攻击, 形成带过氧基的脂质(Kirici et al., 2017).MDA是最终代谢产物之一, 它能与细胞质膜上的大分子(如氨基酸和蛋白质)结合, 导致细胞凋亡甚至器官功能衰竭, 因此, 生物体内MDA含量常被视为脂质化程度高低的标志(刘林等, 2015；李宝典等, 2016).24 h时, 斑马鱼各组织MDA含量变化趋势存在差异, 肝脏和肌肉MDA含量分别在3.25%和0.65%组显著增加, 分别比对照组高28.4%和25.9%；鳃MDA含量随浓度增加升高, 3.25%处理组MDA含量较对照组增加61.9%.鳃组织明显受影响最严重, 并且此时鳃中SOD、CAT和GPx活性显著低于对照组, 说明磷石膏浸出液胁迫抑制了抗氧化酶的活性, 导致氧自由基积累过量, 造成鳃组织的氧化损伤, 脂质过氧化产物MDA含量也增加.与此类似, 王学锋等(2010)研究了Hg2+对红鳍笛鲷(Lutjanus erythopterus Bloch)的抗氧化胁迫及神经系统的干扰, 发现Hg2+暴露下首先是鳃组织受到损害(6 h左右), 肝脏组织在12 h时才开始出现明显损伤.随暴露时间延长, 各组织MDA含量均较24 h时高, 肝脏、肌肉和鳃MDA含量最高点出现在72 h, 分别是对照组的1.8、1.6、2.1倍.可知肝脏和肌肉中氧自由基积累也超出了机体的清除能力, 并且肝脏MDA含量高于肌肉, 这是因为有毒有害物质由鳃进入血液作用到很多靶组织细胞, 这些组织受损产生的代谢紊乱产物同未被清除的有害物质一同汇集到肝脏(杨丽华等, 2003), 因此, 肝脏细胞脂质过氧化程度高于肌肉.Polat等(2016)在土耳其耶西尔马克河靠近制糖厂和固体废物倾倒点附近水域至下游采集两种鲤鱼科鱼类和水样, 分析发现肝脏重金属(Pb、Cd)浓度与水体重金属浓度呈显著正相关, 从下游到上游, 肝脏MDA含量呈现与重金属浓度相同的上升趋势, SOD、CAT活性与重金属和MDA含量的变化规律正好相反.
肝脏是鱼类重要的解毒和代谢器官, 也是有毒有害物质的主要靶器官.有研究报道, 外界污染物胁迫会诱导机体产生氧自由基并攻击肝细胞, 表现为细胞膜溶解, 细胞核裸露(细胞质空泡化), 细胞间边界模糊甚至消失, 细胞核发生融合, 肝脏细胞无序化排列, 肝血窦间隙扩张, 肝巨噬细胞增多等现象(Abdelmoneim et al., 2012；Dane et al., 2015), 这与本研究观察到的现象相似, 存在明显的组织学损伤.鳃是鱼类的主要呼吸器官, 承担渗透调节、呼吸、排泄等功能, 与外部环境保持密切联系, 同时也是水体中污染物进入鱼体内的初始点位.鱼类生存环境的恶化可导致鳃组织损伤, 其表现一般分为两类(Cengiz et al., 2006)：一是因防御反应出现的鳃组织上皮细胞增生、水肿等；另外则是有害物质直接作用于鳃组织造成的损伤, 如鳃丝充血、鳃小片断裂、上皮细胞坏死和脱落等.本研究中, 磷石膏浸出液暴露后, 鳃组织两种损伤均有出现, 最高暴露浓度(3.25%)下以直接损伤为主, 但各暴露组间病变程度没有明显的浓度效应关系.
磷石膏浸出液中污染体系的组分众多, 各组分浓度不一且作用机理复杂, 本研究结果显示斑马鱼在浸出液胁迫下出现了明显的氧化应激反应和组织损伤.因此, 磷石膏中污染物迁移至河流、湖库等水域不仅会降低受纳水体质量, 并将减少水生生物多样性和种群数量, 其引起的环境污染问题应得到进一步重视.时瑶等(2020)研究发现, 长江流域上游磷石膏堆场相关基础设施不完善, 大部分堆场未安装防渗处理设施及渗滤液收集装置, 并且缺乏对地下水、周边河流及土壤环境的有效监测, 致使磷石膏堆场的存在对周边生态环境造成破坏.针对目前磷石膏堆场存在的问题, 首先是响应国家政策, 综合利用磷石膏, 努力实现“产消平衡”, 争取“消大于产”, 减轻磷石膏堆场维护压力；其次, 堆场缺乏的相关应有基础建设, 应以法规、标准为准绳要求相关企业落实；最后, 对未被资源化利用的磷石膏应采取有效措施降低生态风险, 如物理、化学钝化及植被改良等.
5 结论(Conclusions)1) 磷石膏浸出液中非重金属类污染物总磷、氟化物和重金属类污染物Cd、Cr、Pb、Hg浓度超出《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002)Ⅴ类水标准, 其对斑马鱼的毒性较强, 24、48、72和96 h的LC50分别为10.8%、8.5%、7.1%、6.5%.
2) 磷石膏浸出液胁迫可使斑马鱼体内抗氧化酶系统发生紊乱, 3种酶对浸出液的敏感程度为SOD>GPx>CAT；高浓度(0.65%和3.25%)下3种组织酶活性均受到显著抑制, MDA含量显著高于对照组, 机体脂质过氧化加剧.
3) 磷石膏浸出液能引起斑马肝脏和鳃组织织病变, 其中, 肝脏组织出现肝血窦间隙扩张, 细胞质空泡化, 组织水肿, 细胞核固缩、融合等现象；鳃组织出现上皮细胞增生、坏死脱落, 鳃丝充血, 鳃小片弯曲、断裂等.
4) 磷石膏堆场的安全防护措施建设和磷石膏的资源化利用应受到同等重视.
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