刘闪¹, 曹星星^1,2, 吴攀^1,2, 杨诗笛¹, 费学海^1,2, 陈满志¹, 廖家豪¹
1. 贵州大学资源与环境工程学院, 贵阳 550025;
2. 贵州大学喀斯特地质资源与环境教育部重点实验室, 贵阳 550025
收稿日期: 2020-04-03; 修回日期: 2020-05-26
基金项目: 国家自然科学基金（No.U1612442）；贵州省科技计划项目（No.黔科合平台人才[2016]5664，黔科合[2016]支撑2835）；贵州省人才基地项目（No.RCJD2018-21）
作者简介: 刘闪(1997-), 女, E-mail:2743253524@qq.com
通讯作者（责任作者）: 吴攀, E-mail:pwu@gzu.edu.cn

摘要：为揭示酸性矿山废水（Acid mine drainage，AMD）影响下水库水体中细菌群落结构特征及影响因子，对贵州省兴仁市3座受AMD影响与1座未受AMD影响水库样品进行了对比研究，利用16S rDNA高通量测序技术分析揭示细菌群落结构特征，并通过冗余分析（Redundancy analysis，RDA）探明影响水体细菌群落变化的主要环境因子.结果表明，受AMD影响水库水体中各主要阳离子（Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺）、SO₄^2-浓度及电导率值均高于未受AMD影响的水库，而DOC和pH值均低于未受AMD影响的水库.变形菌门（Proteobacteria）是受AMD影响水库水体的主要细菌门类，在3个受影响的水库中均占比95%以上.在属分类水平上，红杆菌属（Rhodobacter）、不动杆菌属（Acinetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）和铁氧化细菌属（Ferrovum）是受AMD影响水库水体中的主要菌属；未受AMD影响水库水体细菌群落中，放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）为主要细菌门类，占比分别为48%和29%，主要菌属为发光杆菌属（Ilumatobacter）、不动杆菌属（Acinetobacter）.分析表明，受AMD影响水库细菌群落结构特征与未受AMD影响水库细菌群落存在明显差异，推测DOC、pH及Na⁺浓度对此差异起主导作用.本研究可为科学认识受AMD影响水体微生物群落与环境因子之间的关系提供依据.
关键词：酸性矿山废水高通量测序水库细菌群落结构环境因子
Characteristics of bacterial community structure in the reservoir affected by acid mine drainage and its relationship with environmental factors
LIU Shan¹, CAO Xingxing^1,2, WU Pan^1,2, YANG Shidi¹, FEI Xuehai^1,2, CHEN Manzhi¹, LIAO Jiahao¹
1. College of Resources and Environmental Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025;
2. Key Laboratory of Karst Geological Resource and Environment, Ministry of Education, Guiyang 550025
Received 3 April 2020; received in revised from 26 May 2020;
Abstract: To uncover the structure and composition of bacterial communities in the reservoir influenced with acid mine drainage (AMD),water composition analysis,the Illumina MiSeq high-throughput sequencing and redundancy analysis (RDA) were applied on samples from 3 AMD- affected and 1 non-AMD- affected reservoirs in Xingren City,Guizhou. The results showed that the contents of main cation (Ca²⁺,Na⁺,Mg²⁺,Fe²⁺,Mn²⁺,Cu²⁺,Zn²⁺ and Ni²⁺) and SO₄^2- ion,as well as value of electrical conductivity in the water from the reservoir influenced with AMD were higher than those of the reservoir without AMD influence,while the values of dissolved organic carbon (DOC) and pH lower than those without AMD influence. Proteobacteria was the dominant bacterial phylum in the water in all three reservoirs influenced with AMD,accounting for more than 95% of bacterial phylum,while at the level of genus,Rhodobacter,Acinetobacter,Pseudomonas and Ferrovum were the dominant bacterial genera. Actinobacteria and Proteobacteria were the main bacterial phylum in the control reservoir,accounting for 48% and 29%,respectively,while the dominant bacterial genera were Ilumatobacterter and Acinetobacter. The bacterial community structure in the reservoir affected by AMD was significantly different from that in the control reservoir,and this difference was mainly attributed to the differences in pH and the concentrations of DOC and Na⁺. This study provides the basis for scientific understanding of the relationship between microbial communities and environmental factors such as AMD influences in the reservoirs.
Keywords: acid mine drainagehigh-throughput sequencingreservoirbacterial community structureenvironmental factors
1 引言(Introduction)微生物是湖库生态系统中重要的组成部分, 其中, 浮游细菌是最为敏感且数量巨大的一类微生物群体, 其组成和变化与水环境质量有着密切关系(朱亮等, 2013).细菌在生物地球化学和能量流动中扮演着重要的角色(Walliams et al., 1981；De et al., 2010), 能对水体中有机物进行分解和转化, 将水体中颗粒态有机碳分解转化成溶解态有机碳, 转化后的溶解态有机碳最终形成能支撑浮游植物生命活动的营养物质, 从而使细菌成为食物网中重要的一环(Reynolds, 2008；Christian et al., 2009).国内外对不同纬度、不同大小的湖、库水体细菌群落结构组成开展了大量的研究工作(Zhang et al., 2015；Moitra et al., 2015；Borsodi et al., 2016；祝亚楠, 2018；Xu et al., 2018；佘伟钰等, 2019), 但主要集中在中性或碱性水库, 对酸性水库细菌群落结构组成的研究鲜见报道.
煤炭资源的开采过程中, 煤及顶底板中伴生的黄铁矿等硫化物通过与水、大气及细菌相互作用形成酸性矿山废水(Acid mine drainage, AMD).因AMD具有低pH、高重金属、高硫酸盐等特征, 不经处理而直接排放, 常造成受纳水体的酸化, 低pH值及大量重金属离子会抑制浮游细菌的生长, 阻碍水体自净(王丽华等, 2014；鲁艳春, 2017；包艳萍, 2018).贵州兴仁市煤矿资源丰富, 尤以高砷煤产出而有名, 境内不少水库受AMD的影响.现有研究主要聚焦于对受AMD污染的水库的酸化特征(谢欢欢等, 2011)和金属元素迁移转化规律(Sun et al., 2013;朱健, 2017)等方面, 对水库酸化后细菌群落结构的变化尚未涉及.
基于此, 本研究对贵州兴仁市矿集区范围内3座受AMD影响水库和1座未受AMD影响水库水体进行样品采集, 使用第二代高通量测序技术之一的MiSeq测序技术, 通过扩增细菌16S rDNA的方法, 对比研究受AMD影响的水库水体中细菌群落结构特征, 并运用冗余分析揭示影响水体中细菌群落结构变化的主要环境因子.以期为矿山废水的治理提供基础支撑数据, 并为水库治理提供参考数据.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 研究区及环境概况研究区位于贵州省西南部的兴仁市南部, 属亚热带温和湿润季风气候区, 年均降水量约为1400 mm, 年均气温为22.1 ℃.所选择4个水库基本信息见表 1, 它们的空间距离相对较近, 地质背景条件相对一致(图 1), 特别是有含煤地层(P₃l)的出露.该地区目前有一定规模的煤矿开采活动, 矿山排出的酸性废水使得下游水库水体产生不同程度的酸化.野外调查发现, 除鲁皂(LZ)水库外, 其余3个水库均不同程度受到AMD的影响.
表 1(Table 1)

表 1 4个研究水库的基本信息 Table 1 Basic information of the four reservoirs for research

表 1 4个研究水库的基本信息 Table 1 Basic information of the four reservoirs for research 水库名称(简称) 地理坐标 汇水面积/km2 库容/万m3 水库类型 建成时间 功能 是否受AMD影响 青树子(QSZ) 105°13′53.1″E, 25°23′12.7″N 15.2 398.0 小(一)型 1958年 农灌+防洪 受影响 马家屯(MJT) 105°08′35.3″E, 25°22′36.3″N 10.1 225.0 小(一)型 不详 农灌+防洪 受影响 高峰(GF) 105°11′17.0″E, 25°23′39.0″N 1.50 24.0 小(二)型 2003年 农灌+防洪 受影响 鲁皂(LZ) 105°14′16.3″E, 25°22′50.7″N 14.7 704.0 小(一)型 2016年 农灌+供水 不受影响

图 1(Fig. 1)

图 1 研究区地质环境及采样位置分布图 Fig. 1Map of geological environment and sampling sites in the study area

2.2 样品采集与分析2019年9月在4座水库库首利用2.5 L有机玻璃采水器采集水库表层水.采样点位于水库中心, 采集深度约为5~15 cm, 采样位置分布图如图 1所示.青树子水库、马家屯水库、高峰水库及鲁皂水库各采集一个样点, 分别命名为QSZ、MJT、GF及LZ.水体温度(T)、pH、溶解氧(DO)和氧化还原电位(ORP)等参数在现场用多参数水质测定仪(WTW, 德国)测定.水样存储于500 mL棕色聚氯乙烯瓶中水样, 参照《水和废水监测分析方法》(第四版)(国家环境保护总局, 2002)测定水样总氮(TN)、氨氮(NH₄⁺-N)、总磷(TP)及叶绿素a(Chl a)含量.现场用0.45 μm滤膜过滤原水存储于50 mL离心管中, 用于阴、阳离子和溶解性有机碳(DOC)测试, 其中, 阳离子样品加硝酸保存, DOC样品加入磷酸保存.另取1.5 L原水存储于已灭菌处理的聚乙烯瓶中, 而后用0.22 μm(Milipore, 美国)无菌微孔滤膜过滤水样, 用以收集细菌, 将滤膜置于无菌离心管于干冰筒中低温(约-20 ℃)保存, 运回实验室后进行后续处理.水样中K⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、总铁(Fe)、Fe²⁺、Mn²⁺采用原子吸收测定(AFS-8510, 美国赛默飞世尔), Cu²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Ni²⁺采用电感耦合等离子质谱仪测定(ICP-MS, 美国赛默飞世尔), SO₄^2-和Cl^-使用离子色谱仪(ICS-1100, 美国)测定, 水体中DOC采用TOC分析仪(Analytikjena, 德国)测定.
2.3 DNA提取、PCR扩增及高通量测序将带有浮游细菌的微孔滤膜经液氮冷冻后进行破碎, 再按照E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒(Omega, 美国)的说明, 提取过滤水样中的总DNA, 并利用1%琼脂糖凝胶检测提取后DNA完整性, 并于-80 ℃条件下保存.
采用高通量测序通用引物341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)及805R(5′-GACTA CHVGGGTATCTAATCC-3′)扩增样品中16S rDNA基因片段的V3~V4区.其中, 上述引物341F有一段barcode的序列, 用以区分不同的样品.PCR扩增分为两轮, 第一轮扩增体系为：2×Taq master Mix 15 μL、Bar-PCR primer F(10 μmol·L^-1)1 μL、Primer R(10 μmol·L^-1)1 μL、Genomic DNA 10~20 ng、H₂O 30 μL, 扩增反应条件为：94 ℃初始变性3 min；94 ℃变性30 s, 45 ℃退火20 s, 65 ℃延伸30 s, 此过程有5个循环；94 ℃变性20 s, 55 ℃退火20 s, 72 ℃延伸30 s, 此过程有20个循环；最后, 在72 ℃下延伸5 min.第二轮扩增体系为：2×Taq master Mix 15 μL、Primer F(10 μmol·L^-1)1 μL、Primer R(10 μmol·L^-1)1 μL、PCR products(上一轮)20 ng、H₂O 30 μL, 扩增反应条件为：95 ℃初始变性3 min；94 ℃变性20 s, 55 ℃退火20 s, 72 ℃延伸30 s, 20个循环；最后, 在72 ℃下延伸5 min.PCR产物进行1%琼脂糖电泳检测后, 利用Life公司的Qubit3.0 DNA检测试剂盒回收.扩增纯化后的样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司采用Illumina Miseq测序仪进行测序.
2.4 数据处理与分析Illumina MiSeq测序得到的下机数据(Raw Data)经处理后得到Tags序列, 与数据库(Silva：http://www.arb-silva.de/)进行对比分析, 检测并去除其中的嵌合体序列, 得到最终的有效数据(Effective Tags).采用QIIME(v1.8.0)进行生物信息学分析, 根据序列的相似度, 将序列归为多个OTU(操作分类单位, Operational Taxonomic Unit).为了得到每个OTU对应的物种分类信息, 采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析, 并在各个分类水平统计每个样品的群落组成.本文以OTU为单位, 利用Mothur(v1.30.1)软件(王丽娜等, 2016;王慎等, 2019)进行群落多样性指标的统计分析；利用Canoco 5.0软件(金笑等, 2017；丁翠等, 2019)对细菌群落物种信息进行冗余分析(RDA)来研究细菌群落与环境因子之间的关系, 并结合IBM SPSS Statistics 22做皮尔森相关性分析评价细菌群落结构与水环境因子间的相关性.运用Origin9.1绘制门水平物种结构分布图, 采用R的gplots包绘制属水平的物种相对丰度分布图.
3 结果与分析(Results and analysis)3.1 水库水体理化特征研究区4座水库水样样品理化参数如表 2所示.受上游酸性矿山废水的影响, QSZ、MJT、GF水库水体pH值为4.78~6.13, 呈酸性, 而LZ水库pH为7.55, 水体呈中性.QSZ、MJT、GF水库电导率(EC)明显高于LZ水库, 最高值为1177.00 μS·cm^-1, LZ水库电导率仅为130.40 μS·cm^-1.QSZ、MJT、GF水库SO₄^2-离子浓度变化范围为384.13~718.66 mg·L^-1, 超过我国地表水质量标准(250 mg·L^-1)(中华人民共和国环境保护部, 2002)的限值, 也高于未受AMD影响的LZ水库(0.99 mg·L^-1).金属离子方面, Fe²⁺在4个水库中含量都较低, 为0.04~0.12 mg·L^-1, QSZ、MJT、GF水库中的Fe²⁺含量值略高于LZ水库.4个水库水体中重金属离子Mn²⁺和Zn²⁺含量高于Pb²⁺、Ni²⁺和Cu²⁺, 其中, Mn²⁺含量最高为1830 μg·L^-1, Zn²⁺含量最高值为415.91 μg·L^-1, Pb²⁺含量最高值为67.66 μg·L^-1, Ni²⁺含量最高值为52.06 μg·L^-1, Cu²⁺含量最高值为23.07 μg·L^-1, QSZ、MJT、GF水库Mn²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺含量明显高于未受AMD影响的LZ水库, Pb²⁺与Cu²⁺含量无明显差异.QSZ、MJT、GF水库Ca²⁺、Mg²⁺、Na⁺浓度也高于LZ水库.QSZ、MJT、GF水库DOC浓度为0.69~0.90 mg·L^-1, 而LZ水库为2.28 mg·L^-1, 明显高于受AMD影响的3座水库.上述结果表明, 4座水库表层水易变参数及离子组成存在明显差异.
表 2(Table 2)

表 2 各水库水体主要理化参数 Table 2 Physicochemical parameters of the reservoir water

表 2 各水库水体主要理化参数 Table 2 Physicochemical parameters of the reservoir water 样点 pH EC/(μS·cm-1) Eh/mV DO/(mg·L-1) T/℃ Chl a/(μg·L-1) NH4+-N/(mg·L-1) TN/(mg·L-1) TP/(mg·L-1) DOC/(mg·L-1) Fe/(mg·L-1) SO42-/(mg·L-1) Cl-/(mg·L-1) K+/(mg·L-1) Ca2+/(mg·L-1) Na+/(mg·L-1) Mg2+/(mg·L-1) Fe2+/(mg·L-1) Mn2+/(μg·L-1) Cu2+/(μg·L-1) Zn2+/(μg·L-1) Pb2+/(μg·L-1) Ni2+/(μg·L-1) QSZ 4.78 598 328.8 7.11 23.8 B.D 0.07 0.87 0.02 0.69 0.07 543.27 6.08 2.47 52.86 15.04 17.28 0.05 1120 23.07 415.91 25.93 52.06 MJT 6.13 1177 174.7 6.84 23.0 B.D 0.57 1.02 0.02 0.87 0.13 718.66 5.27 4.40 81.27 69.24 41.16 0.12 1830 8.24 88.59 67.66 49.96 GF 4.98 399 166.7 7.18 22.9 1.14 0.07 0.96 0.03 0.90 0.06 384.13 3.67 1.64 36.12 4.76 7.65 0.05 890 10.84 37.98 31.67 26.38 LZ 7.55 130 223.6 6.63 26.4 B.D 0.17 0.42 0.03 2.28 0.05 0.99 3.78 1.72 16.06 3.54 3.53 0.04 B.D 8.07 17.21 55.28 12.38 注：B.D代表低于检出限.

3.2 细菌群落结构特征及其与环境因子关系所有样品的菌群丰富度指数(Chao/Ace)、多样性指数(Shannon/Simpson)及测序深度指数(Good′s Coverage)见表 3.4个样品一共获得6214个OTUs.其中, MJT水库的OTUs数最多, 为2234个, 样品LZ的OTUs最少, 为1042个.本文采用的高通量测序技术分析每个样品的序列覆盖度均在98%以上, 个别点可达99.9%, 表明高通量测序技术可较好地反映细菌群落的总体结构.QSZ、MJT、GF、LZ 4个水库香农(Shannon)指数依次为1.85、2.64、2.84、4.11, 呈现随pH值的升高和DOC的增加而增大的趋势.辛普森(Simpson)指数依次为0.35、0.15、0.12、0.05, 随着pH与DOC的增大而降低.Simpson多样性指数和Shannon多样性指数呈相反趋势.
表 3(Table 3)

表 3 各水库浮游细菌群落多样性评估表 Table 3 Estimation of bacterioplankton community diversity

表 3 各水库浮游细菌群落多样性评估表 Table 3 Estimation of bacterioplankton community diversity 样点 OTUs Good′s Coverage 丰富度和多样性指数 Ace Chao Shannon Simpson QSZ 1266 0.99 3038.80 2118.58 1.85 0.35 LZ 1042 0.99 2035.83 1560.65 4.11 0.05 MJT 2234 0.99 5055.19 3582.34 2.64 0.15 GF 1672 0.99 2694.74 2484.91 2.84 0.12

4个样点中均发现了变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria), Proteobacteria在QSZ、MJT及GF中占较大比例, 分别占门水平的97.97%、97.07%、95.32%, 而在LZ中占比仅为28.88%.Bacteroidetes是QSZ与GF中第二丰富的细菌类群, 而在LZ中为第五丰富细菌类群.Actinobacteria是LZ中最丰富的类群, 所占比例为48.22%, 其在QSZ和GF中比例较低, 门水平占比分别为0.06%和0.18%, 具体见图 2a.
图 2(Fig. 2)

图 2 不同样品中细菌门水平细菌群落结构与分布(a)及属水平上物种相对丰度分布(b) Fig. 2The structure and distribution of bacterial communities at the level of phylum(a) and relative abundance distribution of bacterial at the genus level(b) in different samples

4座水库浮游细菌群落组成在属分类水平上如图 2b所示.Heatmap可以将数据进行物种或样品间丰度相似性聚类, 将聚类后数据表示在图上, 通过颜色梯度及相似程度来反映各样品在不同分类水平上群落组成的相似性和差异性.从图 2b可以看出, GF水库中细菌群落结构特征与QSZ、MJT水库较为接近, LZ水库与其余3个水库相差较远.经分析发现, 各水库样品中主要属类差异明显.值得注意的是, 未分类细菌(Unclassified bacteria)在各位点具有较高比例.红杆菌属(Rhodobacter)在QSZ、GF和MJT样品中占较高比例, 分别为55.96%、14.22%、23.59%, 而在LZ样品中低于0.6%, 是QSZ样品的第一大菌属, 属于Proteobacteria的α变形菌纲(Alpha Proteobacteria).不动杆菌属(Acinetobacter)属于Proteobacteria的γ变性菌纲(Gama Proteobacteria), 在4个样品中都占有较高比例, 是MJT中的第一大菌属, 所占比例为27.95%.假单胞菌属(Pseudomonas)属于Proteobacteria的γ变性菌纲(Gama Proteobacteria), 在4个样品中均占较高比例, 在GF中为第二大菌属, 比例为10.65%, 在QSZ中为第三大菌属, 所占比例为11.88%.铁氧化菌属(Ferrovum)属于Proteobacteria的β变形菌纲(Beta Proteobacteria), 是GF样品的第一大菌属, 所占比例为26.02%, 在QSZ中占5.04%, 然而, 在MJT中所占比例为0.25%~2.38%, 在LZ中所占比例低于0.25%.发光杆菌属(Ilumatobacter)属于放线菌门(Actinobacteria), 在LZ样品中占比为9.35%, 是LZ中的第二优势种类, 而在QSZ、GF样品中, 所占比例几乎为0, 在MJT样品中占比为0.25%~0.6%.综上, 受AMD影响水库中主要的细菌属是Rhodobacter、Acinetobacter、Ferrovum和Pseudomonas, 未受AMD影响水库中主要细菌属除了Acinetobacter, 还发现了Ilumatobacter.
细菌多样性与环境因子之间的联系对于促进水生生态系统健康和恢复力的发展至关重要.本研究利用Canoco 5.0软件对水库水体中细菌门分类水平丰度进行除趋势对应(DCA)分析, 结果表明, 3个采样区所有轴中最长梯度均小于4, 适合选用基于线性的RDA分析细菌群落结构与环境因子间的响应关系, 结果如图 3所示.受AMD影响的QSZ、MJT、GF水库水体细菌群落可以跟未受AMD影响的LZ水库水体细菌群落明显区分开, 集中分布在双序图左侧(图 3), 说明受AMD影响的水库细菌群落结构与未受AMD影响水库细菌群落结构存在明显差异.箭头越长说明相关性越大, 箭头连线之间锐角表示正相关, 钝角表示负相关.QSZ、MJT、GF水库水样中细菌群落结构受DO、TN、EC、SO₄^2-、K⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺等金属离子及Fe影响较大, 呈正相关, 其中与TN、Fe和Na⁺呈显著相关关系(p < 0.05).未受AMD影响的LZ水库水样中细菌群落结构受T、DOC、TP、pH影响较大, 呈正相关, 其中与DOC为显著相关关系(p < 0.01), 与T、TP、pH为显著相关关系(p < 0.05)(表 4).
图 3(Fig. 3)

图 3 门水平细菌群落与主要环境因子的RDA分析结果 (注：Proteobc: Proteobacteria (变形菌门); Chlamydi: Chlamydiae(衣原体门); Firmicut: Firmicutes(厚壁菌门); CandSacc: Candidatus Saccharibacteria(糖念珠菌门); Actinobc: Actinobacteria(放线菌门); Planctom: Planctomycetes(浮霉菌门); Verrucom: Verrucomicrobia(疣微菌门); Acidobac: Acidobacteria(酸杆菌门); Bacteroi: Bacteroidetes(拟杆菌门)) Fig. 3RDA analysis results of bacterial communities at the level of phylum and main environmental factors

表 4(Table 4)

表 4 门水平主要细菌与环境因子Pearson相关系数 Table 4 Pearson correlation coefficient of major bacteria and environmental factors at the level of phylum

表 4 门水平主要细菌与环境因子Pearson相关系数 Table 4 Pearson correlation coefficient of major bacteria and environmental factors at the level of phylum pH T TN TP DOC Fe Ca Na Proteobacteria -0.88 -0.96* 0.97* -0.89 -0.99** 0.62 0.75 0.43 Chlamydiae -0.43 -0.89 0.89 -0.61 -0.69 0.81 0.77 0.70 Firmicutes -0.06 -0.62 0.67 -0.61 -0.46 0.97* 0.89 0.96* Planctomycetes 0.90 0.97* -0.97* 0.87 0.99** -0.61 -0.73 -0.41 Actinobacteria 0.89 0.97* -0.97* 0.87 0.99** -0.60 -0.73 -0.40 Verrucomicrobia 0.89 0.97* -0.98* 0.87 0.99** -0.61 -0.74 -0.42 Candidatus Saccharibacteria 0.96 0.937 -0.93 0.81 0.98* -0.45 -0.60 -0.24 Bacteroidetes 0.22 0.53 -0.62 0.86 0.58 -0.94 -0.97* -0.92 Acidobacteria 0.67 0.66 -0.73 0.98* 0.85 -0.67 -0.83 -0.55 注：*p < 0.05；**p < 0.01.

4 讨论(Discussion)受AMD影响与未受AMD影响的水库水样中细菌优势类群和多样性存在差别.从门水平来看, 受AMD影响的3个水库(QSZ、MJT、GF)中Proteobacteria相对丰度占比均在95%以上, 是3个水库中最大的优势细菌门类.蔺朋武(2017)在对广东云浮(YF)硫铁矿、江西德兴(DX)铜矿和江西永平(YP)铜矿等不同来源AMD废水样品分析时发现, 丰度最高的优势门类也是Proteobacteria.曹子敏等(2019)在安徽某铁矿AMD废水库水样的分析中也得到相同结论.Proteobacteria作为铁硫氧化的重要参与者, 可能是构成AMD中细菌群落的核心物种之一(鲁力, 2010).而Actinobacteria是未受AMD影响的LZ水库中占比最大的细菌门类.这与前人对类似水库细菌门类分布的研究一致, 如北京密云水库常年pH为7~8之间, 为中碱性水库(杜桂森等, 2001；于一雷, 2008), Actinobacteria在1、4、9月为生长高峰期, 其中以9月密度最大(原媛等, 2007).
从属水平来看, 受AMD影响的水库中Rhodobacter和Ferrovum是占比最大的两类菌属.由于矿山排水处的酸性废水在汇入水库过程中, Fe²⁺会逐渐转变为Fe³⁺, 并以铁氢氧化物胶体形式进入河流和水库沉积物中(周国华等, 2012), 致使水库坝前水体中Fe²⁺等离子浓度比较低, 在这种环境条件下Letosirillum、Ferrolasma和Acidithiobacillus等在酸性矿山废水中通常占据优势地位的嗜酸菌已不适宜生长, 而此类菌属是与酸性矿山废水形成有关的重要化能自养铁硫氧化菌(Bond et al., 2000；Druschel et al., 2004).曹子敏等(2019)研究发现, 此类细菌属在pH低于2.5的极端酸性环境中广泛存在, 而本研究中4座水库水体的pH均大于4, 环境条件不利于嗜酸菌的生存.受AMD影响水库水体主要细菌属中Rhodobacter具有囊泡光合膜, 可利用硫化氢作为电子供体进行光自养生长(Imhoff et al., 1984).Ferrovum属于化能自养型细菌且在全球各地含铁的酸性废水中都可以被大量检出(Heinzel et al., 2009).未受AMD影响水库中的优势菌属Ilumatobacter为化能异养菌.由此可见, 受AMD影响水库中主要菌属生长方式为异养, 未受AMD影响水库中菌属则以自养生长为主.DOC是异养型细菌必需的营养物质, 自养型细菌不需要DOC也能正常生长(侯瑞等, 2014).异养细菌不能直接把无机物合成有机物, 必须摄取现成的有机物来维持生长, 自养细菌可以通过光合作用或化能合成作用获得能量, 以二氧化碳作为主要或唯一的碳源.DOC中含有羧基、胺基和酚羟基、氨基、烷氧基等大量络合和螯合基团(贾陈忠等, 2012), 可以与水体中的重金属通过络合或螯合作用, 形成有机-金属配合物.AMD环境中大量形成的金属氧化物会对DOC进行吸附, 并在铁离子作用下催化DOC的光氧化, 进而减少受AMD污染水体中的DOC含量水平(Yuan et al., 2019).此外, Ferrovum和Ilumatobacter属在各水库中的相对丰度与水体pH呈显著相关关系, Ferrovum的相对丰度随着pH的增大而降低, Ilumatobacter的相对丰度随着pH的增大而升高(图 4).pH对细菌细胞体内某些酶类的活性会造成影响, 碱性系统易于捕获大气中的CO₂, 较高的生产力通常出现在中碱性系统中(刘春光等, 2005).Na是微生物生长的重要营养元素, 在维持细胞渗透压等方面发挥着关键的作用.pH较低的水体中, 为了维持细菌细胞的中性环境, 受AMD污染的水库水样中Na元素含量高于未受AMD污染的水库.由此可见, DOC、pH及Na是造成受AMD污染与未受AMD污染水库浮游细菌群落结构差异的重要环境因子.
图 4(Fig. 4)

图 4 属水平细菌相对丰度与pH相关性 Fig. 4Correlation between relative abundance of genus-level bacteria and pH

RDA及Pearson相关性分析显示, 除DOC、pH和Na⁺外, T、TN、TP、Fe同样对水库细菌群落变化产生很大影响.水温显著影响未受AMD影响水库水样中细菌群落结构, 通过影响细菌酶的活性而控制其新陈代谢速率(季凤云等, 2017), 未受影响的水库水温明显高于受AMD影响的3个水库.N、P是细菌生长繁殖必须的营养成分(冯胜等, 2006), 本研究中总氮、总磷和氨氮与细菌相对丰度的关系并不一致, 总氮、总磷与细菌群落分布呈现出相反关系, 说明水库由于水交换量大或其他因素, 细菌相对丰度与营养盐之间的关系较复杂.重金属Fe对细菌细胞结构会造成影响, 但本研究中各水库Fe元素含量较低, 且差异并不明显.由于研究的局限性, T、TN、TP、Fe对于细菌群落结构的影响仍需长期且深入的调查研究.
5 结论(Conclusions)1) 与未受AMD影响的水库相比, 受AMD影响的水库水体具有低pH值、高EC值、低DOC、高Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺和SO₄^2-含量, 但Fe²⁺含量在各水库水体中差异较小, 且含量较低.
2) 门分类水平上, 受AMD影响的水库水体中变形细菌(Proteobacteria)是主要细菌门类, 而未受AMD影响水库则以放线菌门(Actinobacteria)为主；属分类水平上, 红杆菌属(Rhodobacter)和铁氧化菌属(Ferrovum)相对丰度在受AMD影响的3个水库中均占一定比例, 而在未受AMD影响水库相对丰度占比接近于0.不动杆菌属(Acinetobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas)亦为受AMD影响水库中的优势菌属.
3) 水库水样中细菌群落受环境因子的影响较大.RDA分析及Pearson相关分析表明, 受AMD影响水库中, 影响细菌群落结构变化的关键环境因子为TN、Fe和Na⁺, 未受AMD影响的水库水体中细菌群落结构多样性主要受到DOC、TP、pH、T的显著影响.DOC、pH、Na⁺是导致受AMD影响水库与未受AMD影响水库水体浮游细菌群落结构差异的主要环境因素.

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