, 高碧霄1, 潘杨1,2
, 冯鑫11. 苏州科技大学环境科学与工程学院, 苏州 215009;
2. 江苏省环境科学与工程重点实验室, 苏州 215009
收稿日期: 2019-06-10; 修回日期: 2019-07-23; 录用日期: 2019-07-23
基金项目: 国家自然科学基金(No.51778390);国家重点研发计划项目(No.2016YFC0401103);江苏省自然科学基金项目(No.BK20171219)
作者简介: 章豪(1994-), 男, E-mail:1442273765@qq.com
通讯作者（责任作者）: 潘杨, E-mail:panyang@mail.usts.edu.cn
摘要: 在同步去除并富集磷的基础上，探究采用前期不排泥、后期排泥的挂膜方式对聚磷生物膜反应器的运行效能、微生物特征及群落结构的影响.结果表明，经过驯化运行，聚磷生物膜的蓄磷能力明显提升.在挂膜阶段，生物膜厚度及EPS含量出现一定程度的增长；PN/PS上升至3.12，PN/PS比值增加有利于微生物粘附在填料上.在好氧出水达标的情况下，富集液中磷酸盐浓度提升至89.5 mg·L-1，达到了鸟粪石回收标准.高通量测序结果表明，经过富集培养，微生物群落多样性呈下降趋势，群落组成变化明显.优势菌门为变形菌门（Proteobacteria），其丰度从33.6%增长至75.3%；反应器中的聚磷菌属丰度明显增加，从11.8%上升至23.2%，红环菌属（Rhodocyclaceae）、UKL 13-1为反应器中的优势聚磷菌.
关键词:生物膜膜厚聚磷菌高通量测序
Rapid start-up of phosphorus biofilm and its microbial community characteristics
ZHANG Hao1
, GAO Bixiao1, PAN Yang1,2 , FENG Xin1 1. School of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009;
2. Jiangsu Key Laboratory of Environment Science and Engineering, Suzhou 215009
Received 10 June 2019; received in revised from 23 July 2019; accepted 23 July 2019
Abstract: On the basis of simultaneous removal and enrichment of phosphorus, the effects of different operation mode, such as pre-discharging and post-discharging, on the treatment efficiency, microbial community structure of the biofilm reactor were investigated. The results show that after the biofilm development, the phosphorus storage capacity of the biofilm was significantly improved. At the biofilm growing stage, the biofilm thickness and EPS content increased; the PN/PS ratio rose to 3.12, which is beneficial to the adhesion of microorganisms to the carrier. When the aerobic effluent reaches the standard, the phosphate concentration in the enrichment liquid is raised to 89.5 mg·L-1, which meets the standard of struvite recovery. High-throughput sequencing results show that the microbial diversity dropped after the culture enrichment, and the community population changed significantly. The dominant phylum was Proteobacteria, which increased from 33.6% to 75.3%. The abundance of PAOs (phosphorus accumulating organisms) in the reactor increased significantly from 11.8% to 23.2%. Rhodocyclaceae and UKL 13-1 are the dominant PAOs in the reactor.
Keywords: biofilmfilm thicknesspolyphosphate bacteriahigh-throughput sequencing
1 引言(Introduction)磷是一种不可再生资源, 也是支持全球粮食生产所必需的关键元素.许多报告表明, 全球磷量在未来100年将消耗殆尽, 因此, 磷的回收至关重要(Rittmann et al., 2011；Hutnik et al., 2013；Mayer et al., 2016).本课题组曾提出城市污水全面资源化的概念, 主要是将废水中的有机物和磷资源以可有效利用的能源或产品方式进行回收, 而后利用低能耗的厌氧氨氧化工艺进行脱氮.对于磷回收工艺, 污水处理厂是潜在的磷回收场地, 但从污水处理厂回收磷的主要困难是磷浓度较低(磷浓度＜10 mg·L-1)(Parsons et al., 2008；Yuan et al., 2012), 现有的磷回收技术仅适用于高磷浓度液体(磷浓度＞50 mg·L-1)(Cornel et al., 2009).同时, 现有的磷回收工艺均从污泥中进行磷回收, 其中主要有生物法(Xia et al., 2014；Martí et al., 2010)、化学法(Bl?cher et al., 2012；Xu et al., 2012), 但上述方法分别需要消耗大量有机物及进行强酸强碱处理, 因而尚未被广泛应用.在此基础上, 本课题组采用生物膜法直接在主流工艺中富集磷酸盐, 且前期研究证明了利用生物膜法富集磷酸盐的可行性(孟璇等, 2018).在生物膜工艺中, 在生物膜稳定运行前会有前期的挂膜阶段, 能够迅速挂膜成功是聚磷菌驯化成功的关键.而现有文献仅是针对脱氮菌的挂膜研究, 即循环法和排泥法(俞汉青等, 1992), 极少有关于聚磷菌的生物膜挂膜方式研究.
基于此, 本文以悬浮填料作为生物膜载体, 采用合成废水在主流工艺中进行生物膜驯化培养实验, 采用前期不排泥、后期排泥的方式进行挂膜, 对循环交替厌氧/好氧运行模式下的磷溶液去除和富集情况进行研究.同时, 探究了此种驯化培养方式下生物膜反应器中的吸磷及释磷规律, 以及微生物种群丰度变化, 以期为聚磷菌的富集培养提供思路, 并为未来城市污水处理厂中聚磷菌的挂膜及富集提供技术支撑.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 生物反应器与实验条件2.1.1 反应器装置本实验接种污泥取自苏州某污水处理厂, 在挂膜阶段, 先将填充比为40%的悬浮填料浸没于污泥沉降比为40%的反应器中曝气24 h, 而后直接进行好氧/厌氧交替运行.实验装置如图 1所示, 系统由一个6 L的反应容器H, 悬浮填料(填充比为40%)、一个180 L好氧进水容器A和一个30 L的厌氧富集罐E组成, 所有装置的开闭由计时器控制.
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 实验装置示意图 (A.好氧罐；B、G、I.调节阀；D.曝气装置；E.厌氧富集罐；F、J.泵；H.反应器；J.搅拌机；K.厌氧基质罐) Fig. 1Schematic diagram of the Experimental device |
挂膜阶段：在好氧阶段, 打开阀B, 综合废水在重力作用下从好氧罐流入反应器, 空压机D曝气以促进有氧环境, 打开搅拌机C使水质均匀, 在好氧阶段结束前15 min, 关闭空压机D与搅拌机, 污泥自然沉降15 min, 打开阀I, 上清液在重力作用下排出, 污泥未排出.在好氧段结束时, 系统切换到厌氧阶段, 在厌氧过程中, 通过泵F将厌氧进水泵入反应器中, 同时将厌氧基质罐K的碳源通过泵J泵入反应器中, 厌氧基质与厌氧进水以1:99的比例混合, 在好氧阶段结束前15 min, 关闭空压机D与搅拌机, 泥自然沉降15 min, 打开阀G, 上清液在重力作用下流回至厌氧富集罐, 污泥未排出.
驯化阶段：好氧/厌氧进水段同挂膜阶段, 但好氧段废水全部排出, 厌氧段废水全部流回至富集罐.通过好氧/厌氧重复交替操作, 富集罐中的磷酸盐浓度越来越高.
2.1.2 进水条件好氧、厌氧进水为合成废水, 采用乙酸钠作为碳源.好氧进水PO43--P为10 mg·L-1, NaHCO3为400 mg·L-1, NH4+-N为40 mg·L-1, 同时含少量CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、EDTA·2Na和微量元素(Liu et al., 1997)；厌氧进水COD为200 mg·L-1, 其余药剂同好氧阶段.调节pH至7.5±0.3.
2.1.3 运行时间和条件反应器厌氧/好氧交替运行, HRT为6 h, 驯化过程主要分为2个阶段(阶段Ⅰ、阶段Ⅱ), 其中, 阶段Ⅰ为泥膜复合培养期(挂膜期), 阶段Ⅱ为排泥后富集聚磷菌期(驯化期), 反应器进水流量为500 mL·min-1, 进水时间约为10 min.同时, 在厌氧/好氧段均打开搅拌机使废水均匀混合, 溶解氧控制在4~6 mg·L-1.
2.1.4 取样计划与常规监测项目研究中所有进水或出水水样取自反应器样品进水及出水口.监测指标COD、PO43--P、NH4+-N、VSS均采用标准方法测定, DO采用Inlab OXI7300溶氧仪测定, pH采用Inlab OXI7300 pH计测定, ORP采用HQ14D ORP测定仪.根据文献方法(王琰等, 2015)进行EPS的提取, 蛋白质含量采用Lowry法(Adav et al., 2008)测定, 多糖浓度采用苯酚-硫酸法(Luo et al., 2014)测定.
2.2 微生物分析本实验使用样品均来自悬浮生物膜反应器, 分别于系统运行的第0 d(M1)、13 d(M2、M3)、47 d(M4)取厌氧段污泥, 置于离心管中, 经离心机在1007 r·min-1下离心5 min, 去除上清液, 将污泥置于-80 ℃环境下保存.采用试剂盒(Fast DNA Spin kit for soil, MP, USA)对污泥进行DNA提取.提取后的DNA通过NanoDrop2000测量核酸浓度及纯度, 而后通过1%的琼脂糖凝胶电泳在电压为5 V·cm-1的环境中运行20 min, 进行检测.
PCR扩增采用细菌的16S rDNA V3~V4区通用引物(338F、806R), PCR体系采用20 μL的反应体系, 包括4 μL 5×Buffer、2 μL dNTP、2 μL DNA模板、引物各0.8 μL(10 μmmol·L-1)、0.5 μL Taq酶, 补水至20 μL.PCR扩增采用ABI Gene Amp? 9700型PCR仪, 程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s, 低温退火55 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 共27个循环；72 ℃延伸10 min.扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测.将DNA样品置于-20 ℃冷冻保存, 而后将DNA样品送出检测.
2.3 数据分析本研究使用卡方检验(Chi-aquare test), 对两个样本间的物种丰度差异进行比较, 通过此分析可获得物种在两个对比样本中的差异显著性, 同时根据双尾t检验检测微生物物种和基因相对丰度在95%置信区间下的群落组成差异.以上分析均通过R语言vegan及stats程序包完成.
3 结果与讨论(Results and discussion)3.1 聚磷生物膜的快速启动如图 2a所示, 在0~16 d, 采用不排泥的方式进行挂膜, 磷去除率从最初的28.1%上升至49.9%, 且好氧出水磷浓度最低为3.75 mg·L-1, 在除磷系统中, 系统存在着磷蓄量限制情况(Yadav et al., 2016), 初期系统无法吸收过量的磷, 导致好氧出水磷浓度不达标.但随着泥膜复合系统的运行, 第6~16 d, 好氧出水磷浓度趋于稳定, 此时膜厚度为8 μm(图 4a)；悬浮污泥与生物膜上污泥存在竞争(万金保等, 2009), 在厌氧阶段会竞争碳源, 而PAOs不能充分利用碳源, 导致污泥不能较好地粘附在悬浮填料上, 生物膜上污泥厚度的增长速率从初始的0.6 μm·d-1下降至0.5 μm·d-1, 为了使污泥能粘附在填料上, 在第16 d进行排泥处理.在16~49 d, 聚磷生物膜反应器在好氧/厌氧交替下运行, 磷去除率从开始的49.9%上升至95.9%, 出水磷浓度达到0.2 mg·L-1, 且第26 d后好氧出水磷浓度稳定在0.5 mg·L-1以下, 符合国家《污水综合排放标准》一级A标准, 说明经过49 d的驯化培养, 聚磷菌已经逐渐富集及繁衍在生物膜上, 好氧吸磷过程中依旧没有突破磷蓄量限制, 说明依旧没有突破反应器中的最大蓄磷水平.而且随着厌氧富集液中磷浓度的不断提升, 在厌氧阶段末有残留液体粘附在生物膜上, 导致好氧实际进水磷浓度升高, 但好氧出水磷浓度均保持在0.5 mg·L-1以下, 在生物膜厚度不改变的情况下, 说明生物膜中聚磷菌的吸磷能力得到提升, 聚磷菌也不断富集在生物膜上.利用生物膜反应器进行除磷实验, 经过44 d的初期培养运行, 磷去除率为71%, 出水磷浓度为1.5 mg·L-1左右(郑蓓等, 2007), 证明本实验采用的驯化方式更有利于聚磷生物膜的快速富集.
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 好氧阶段常规数据监测 Fig. 2Phorsphorus concentration variation in the aerobic phase |
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 生物膜特性变化 (a.生物膜厚度, b. EPS含量) Fig. 4The characteristics variation of biofilm |
为了更好地探究聚磷菌的富集效能, 在第10、25、34、44 d测定了好氧阶段的磷浓度(图 2b), 随着反应器运行, 好氧出水开始达标, 平均吸磷速率与最大吸磷速率也相应提高, 分别从最初的2.48 mg·L-1·h-1与3.58 mg·L-1·h-1上升至4.5 mg·L-1·h-1与5.45 mg·L-1·h-1, 性能提升了1.81倍, 且在好氧段的运行过程中, 聚磷菌不断被富集, 且PAOs丰度也得到较大提升(图 5), 聚磷菌含量从最初的11.8%上升至22.3%.
图 5(Fig. 5)
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| 图 5 微生物种群分布 (a.门水平, b.属水平；M1：种泥；M2：活性污泥(13 d)；M3：生物膜(13 d)；M4：生物膜(47 d)) Fig. 5Distribution of bacterial community |
通过好氧/厌氧交替运行, 厌氧富集液中的磷酸盐浓度逐步提升, 如图 3a所示, 经过49 d的运行, 磷酸盐浓度提升至89.5 mg·L-1, 远远高于鸟粪石法回收磷的标准(磷浓度＞50 mg·L-1)(Artan et al., 2002).但随着厌氧富集液中磷酸盐浓度的逐渐提高, 厌氧阶段的释磷量逐渐降低, 从最高的13.85 mg·L-1下降至4.4 mg·L-1, 表明在高浓度磷酸盐的胁迫下, 聚磷菌的释磷特性会受到抑制.任皓甜等(2018)研究表明, 外界高浓度磷酸盐会与聚磷菌形成较大的渗透压, 根据双膜理论, 在好氧不加碳源的情况下, 可能没有足够的能源物质从而使聚磷菌不能充分释放体内的磷酸盐, 导致厌氧释放量越来越少, 但在好氧阶段依旧可以吸收磷酸盐, 更说明了系统依旧没有出现磷蓄量限制情况.通过在厌氧阶段添加碳源, 使其转化为PHB并在好氧阶段作为能源物质吸收磷酸盐, COD去除率从最初的47.4%上升至72.2%.研究表明, 在厌氧/好氧交替运行的条件下, 聚磷菌可以更好地富集(冉治霖等, 2017), 反应器中聚磷菌等异养菌大量繁殖, 利用碳源作为自身生长的内源物, 从而消耗了更多的碳源.
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 厌氧阶段常规数据监测 Fig. 3Phorsphorus concentration variation in the anaerobic phase |
为了探究聚磷菌在厌氧段的释磷能力, 分别在第10、25、34、44 d测定厌氧阶段的磷浓度, 结果如图 3b所示.由图可知, 磷释放速率从挂膜阶段的1.6 mg·L-1·h-1上升至3.7 mg·L-1·h-1, 而后下降至1.325 mg·L-1·h-1, 与文献报道的4.2 mg·L-1·h-1相当(郑莹等, 2017).由于前期聚磷菌活性及丰度不高, 厌氧段的磷释放较少, 而当聚磷菌富集在生物膜上后, 释磷能力得到提升, 但随着反应器的运行, 厌氧罐中的磷酸盐浓度升高, 导致聚磷菌与外界液相的传质受到抑制.
3.2 生物膜特性在49 d的运行过程中, 采用文献方法(刘雨等, 2000)测定生物膜厚度.截取一段悬浮填料, 用显微镜法测量其厚度, 结果如图 4a所示.由图可知, 生物膜厚度变化表现为初始附着及生物膜形成期(1~16 d)、生物膜积累期(16~41 d)、生物膜稳定期(41~49 d).在初始附着期, 污泥需适应生物膜的存在环境, 微生物会利用鞭毛、纤毛等细胞器粘附于悬浮填料上(Bullitt et al., 1995), 膜厚度增长率为0.62 μm·d-1, 膜厚度增长至8 μm；在生物膜积累期, 微生物会分泌EPS增强与悬浮填料之间的粘附(Fr?lund et al., 1996), 由于EPS间架桥作用, 促进了微生物的聚集, 膜厚度增长率提升至0.89 μm·d-1, 在膜厚度上升至最大值33 μm；生物膜稳定期, 微生物会脱落但会重新繁殖, 膜厚度保持相对稳定, 稳定在32 μm左右.
EPS被认为是构成生物膜骨架的关键因子(Fr?lund et al., 1996), 其存在有利于污泥在载体上进行粘附并形成生物膜(宋悦等, 2017).悬浮污泥及生物膜中EPS含量及组成变化如图 4b所示.在1~13 d, EPS含量(以VSS计)从最初的54.15 mg·g-1上升至64.48 mg·g-1, 但EPS含量增长率从0.88 mg·g-1·d-1下降至0.59 mg·g-1·d-1, PN/PS从1.25上升至1.79.随着聚磷菌不断被富集, 反应器的除磷性能得到提升, 活性污泥分泌了较多的EPS；而在EPS含量增长到一定程度后, 活性污泥与生物膜上的污泥会产生竞争, 两者在厌氧阶段竞争碳源, EPS在基质匮乏时会充当能源物质被消耗, 导致EPS增长率下降.但EPS的增长会增强细胞间的架桥作用, 有利于细胞聚集(Abbasnezhad et al., 2011), 可使活性污泥发生聚集现象而形成颗粒污泥, 这样不利于在生物膜上富集聚磷菌.因此, 本研究在第16 d进行排泥.在第16~49 d, EPS含量从64.48 mg·g-1上升至84.6 mg·g-1, PN/PS从1.79上升至3.12, 这是因为无活性污泥与生物膜竞争碳源, 聚磷菌富集在生物膜上, 导致EPS逐渐增加至84.6 mg·g-1.研究表明, EPS的主要成分为蛋白质和多糖, 蛋白质含量增加能够降低污泥之间的排斥力, 更好地粘附在生物膜上(宋悦等, 2017).在第41 d后生物膜处于稳定期, 细胞裂解, 细胞EPS中多糖水解酶分解多糖类物质, 导致EPS含量减少, 胞外蛋白与多糖的比值增加.
3.3 微生物种群结构分析3.3.1 微生物多样性分析各样品的α多样性指数如表 1所示.随着聚磷菌的挂膜及富集培养, Chao1指数及香农指数均逐渐下降, Chao1指数由初期的1309.1下降至601.4, 香农指数由初期的5.25下降至3.86.随着好氧/厌氧交替运行, 聚磷菌被不断富集在生物膜上, 群落组成逐渐专一化, 导致种群多样性下降.
表 1(Table 1)
| 表 1 细菌群落α多样性 Table 1 The α-diversity indices of bacterial community | |||||||||||||||||||||||||
表 1 细菌群落α多样性 Table 1 The α-diversity indices of bacterial community
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3.3.2 微生物群落结构变化培养过程中微生物群落结构变化结果如图 5所示.从图 5a中可以发现, 物种丰度在1%以上的门类共10类, 其中, 变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)为主要的优势菌门.变形菌门的物种丰度从初期的33.64%上升至75.28%, 远高于文献报道的污水处理厂中45%的变形菌门物种丰度(王海燕等, 2006).拟杆菌门与绿弯菌门的物种丰度分别从初期的19.97%、18.3%下降至17.14%、1.25%.其他门类的物种丰度也出现大幅度下降, 厚壁菌门(Firmicutes)由启动初期的11.74%下降至2.55%.Proteobacteria是常见的聚磷菌Candidatus Accumulibacter、假单胞菌及红环菌所在的门类, 随着反应器的运行, 聚磷菌被不断富集, 含量逐渐增加.而绿弯菌门一般需要通过光合作用获得能量和进行生物合成(Lin et al., 2010), 实验室环境的光照不充分, 可能不利于绿菌门的生长, 导致其含量降低.
在属水平上对物种丰度大于2%的微生物进行分析, 结果见图 5b.由图可知, Candidatus competibacter、Rhodocyclaceae、Flavobacterium、Saprospiraceae、UKL 13-1为主要的优势菌属, 在稳定期其相对丰度分别为31.1%、5.1%、4.8%、2.1%、13.1%.在生物膜富集过程中, Candidatus competibacter增长极其明显, 由初期的1.42%上升至31.1%.研究表明, Candidatus competibacter是一种聚糖菌, 会与PAOs竞争碳源, 但其会分泌一种胞外多糖, 这种多糖可形成更具粘性的EPS (Meyer et al., 2003), 从而利于污泥絮体粘结成较大的菌胶团并粘附于生物膜上.而生物膜中EPS含量从初期的54.15 mg·g-1上升至81.6 mg·g-1, 生物膜厚度上升至32 μm, 证明了此菌在生物膜形成过程中扮演着至关重要的角色.Rhodocyclaceae、Saprospiraceae、UKL 13-1均被报道与除磷相关(Tian et al., 2016；Driscoll et al., 2017).Rhodocyclaceae与UKL 13-1的物种丰度分别从初期的1.0%、0.5%上升至5.1%、13.1%, 而Saprospiraceae的丰度从初期的10.3%下降至2.1%, 聚磷菌的丰度从初期的11.8%上升至23.2%.说明在好氧/厌氧交替运行下, 部分聚磷菌发生富集, 而不适应此工艺流程的聚磷菌将受到抑制, 聚磷菌进行了高效筛选及富集.此外, 系统中存在Candidatus_Accumulibacter、Thauera等除磷微生物, 在生物膜稳定期分别占1.7%、1.2%.在富集48 d后, 在属水平上聚磷菌丰度达到了23.2%.
根据物种丰度数据, 检测活性污泥样品M2和生物膜样品M3中丰度排名前15的物种, 进行假设性检验, 进而评估差异的显著性, 结果如图 6所示.由图可知, 两者在属水平上存在较大的丰富度差异, 除unclassified_f_Burkholderiaceae菌无明显差异外, 其他14个属均存在差异(p＜0.001).相较活性污泥而言, 生物膜中Candidatus_Competibacter、Flavobacterium、norank_o_Micavibrionales、Zoogloea、UKL13-1、Candidatus_Accumulibacter均发生相对增长, 分别增长了0.3、3.9、65.0、1.1、2.2、2.8倍.Candidatus_Competibacter可分泌多糖促进微生物在填料上富集, 而Zoogloea、UKL13-1、Candidatus_Accumulibacter为系统中的聚磷菌, 证明在同一时期生物膜上的聚磷菌较活性污泥多.为了使生物膜上的聚磷菌发生富集, 排走活性污泥使附着态微生物得到优势增长.
图 6(Fig. 6)
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| 图 6 活性污泥与生物膜微生物差异性分析 Fig. 6Analysis of microbial difference between activated sludge and biofilm |
4 结论(Conclusions)1) 本研究采用悬浮填料, 接种活性污泥后, 经过26 d的驯化培养快速、成功地启动了聚磷生物膜, 工艺稳定后好氧段磷的去除率稳定在95%以上, 富集液中磷酸盐浓度上升至89.5 mg·L-1, 达到了鸟粪石法回收磷的标准.
2) 在驯化过程中, 生物膜厚度增加并稳定于32 μm, EPS含量及PN/PS分别上升至81.6 mg·g-1与3.12, EPS含量及PN/PS比值的增加有利于微生物粘附在生物膜上.
3) 在驯化过程中, 细菌多样性降低, 物种更专一化.变形菌门(Proteobacteria)的物种丰度从33.6%增长至75.3%；反应器中的聚磷菌属丰度明显增加, 从11.8%上升至23.2%, 红环菌属(Rhodocyclaceae)、UKL 13-1为反应器中的优势聚磷菌.
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