肠道除了发挥消化和吸收功能外，还是被认为是机体内最大的内分泌器官。这是因为肠道的各个区段都分布着多种内分泌细胞（Enteroendocrine Cell，EE），它们感知外界信号刺激，并通过分泌多种神经内分泌肽调节食欲、代谢、肠蠕动等多种重要的生理过程。但是由于EE细胞的种类繁多，区域分布复杂，对其类型和分化机制的全面了解一直是一个巨大挑战。
北京生命科学研究所袭荣文实验室长期利用果蝇模型研究研究肠道干细胞的调节和EE细胞的分化机制，先后发现从肠道干细胞到EE分化过程中的关键调控因子（Wang, et al., Development,2015）、分化时的命运决择机制 (Chen et al., Nature Cell Biology,2018) 及命运执行机制（Yin and Xi, Stem Cell Reports, 2018）。在本课题中，研究人员通过单细胞转录组分析（scRNA-seq）技术，完成了对果蝇EE细胞亚型的全面鉴定。共鉴定出一个特定的EE前体细胞群体，以及10个成熟EE细胞亚群（图1）。发现它们一共可以表达14种不同类型的神经内分泌肽，并完成了各EE细胞亚型的神经内分泌肽表达谱的绘制。虽然每个EE细胞的位置信息在组织消化和细胞分选过程中丧失，但是研究人员巧妙运用区域特异性基因富集分析获得各EE亚型在肠道中不同区段的偏向性，并结合对各亚型特异性标记的神经肽或GPCR基因的敲入品系（果蝇Chemoconnectome library）进行免疫荧光染色分析，最终确定了EE细胞各亚型在整个中肠不同的区段的分布情况。
图1. Ten mature EE subtypes revealed byscRNA-seq.
研究人员进一步对神经内分泌肽受体在EE细胞中的表达模式进行了分析，发现EE细胞表达的绝大多数神经内分泌肽，其受体并不在EE细胞中表达；而EE细胞表达的绝大多数受体，其相应的配体也表达于其他组织中，提示EE细胞主要介导器官-器官间的信号传递，系统性的调控机体生理过程的功能。有趣的是，某些EE细胞表达的神经内分泌肽，其受体也表达在临近的或远距离的EE细胞亚型中，提示EE细胞之间可能存在旁分泌或远距离交流机制。
接下来，研究人员进一步探索了EE细胞不同亚型的分化机制。基因表达谱的分析提示绝大多数亚型表达AstC或Tk的其中一个，所以可以通过AstC/Tk的表达与否把EE细胞分为两大类：Class I（AstC）和Class II（Tk）。在前段肠道区域中存在一类AstC和Tk均不表达的EE细胞，且这些EE细胞表达另一种神经内分泌肽sNPF，这类EE被命名为Class III EE。 通过在EE前体细胞或成熟细胞中激活或抑制Notch信号通路，证明了Notch通路在EE前体细胞中的活性决定了Class I 或 Class II EE的分化。
图2. EE subtypes and their spatialdistribution.
在转录因子调控方面，以往发现的转录因子仅参与由肠道干细胞分化为EE细胞的过程，而进一步调控EE细胞亚型的转录因子到目前为止尚未被发现。研究人员通过分析EE细胞各亚型中转录因子的表达模式，获得可以区分每个亚型的特异性转录因子组合，并通过RNA干扰技术功能性验证这些转录因子对EE细胞亚型分化的作用。最终发现转录因子Mirr和Ptx1分别调控Tk+ Class II EE和AstC+ Class I EE的分化。另外，一些区域特异性表达的转录因子，如Esg，Drm等，决定了相应肠道区段特异的EE亚型的分化。最后，研究人员进一步探索了与神经内分泌肽的表达模式高相似性或互斥性的转录因子，并从中发现了hbn, NK7.1，nlp等转录因子对EE多个细胞亚型的分化作用，最终构建了调控EE亚类分化的转录因子代码（图3）。
图3. The transcription factor code for EEsubtypes.
总之，本研究结果提示果蝇肠内分泌细胞的多样性是由Notch 信号通路的侧抑制作用及发育过程中建立的不同的体节身份共同决定的。这种细胞多样性机制在哺乳动物和人中很可能是保守的。果蝇的肠内分泌细胞各亚类的全面鉴定及转录因子代码的解析为进一步利用果蝇模型理解肠内分泌细胞的功能及分子调节机制奠定了重要基础。研究人员同时建立了一个在线可检索资源库（FlyEE-seq: https://xilab.shinyapps.io/database/）以便于肠内分泌细胞单细胞资源的进一步开发和利用。我所袭荣文实验室的郭兴庭博士，殷畅博士，杨斧博士和研究助理张永超为本文共同第一作者。本文的其他作者还包括NIBS核酸测序中心的黄焕伟、王家文和蔡涛博士，以及北京大学生命科学院的邓博文博士和饶毅博士，袭荣文博士为本文通讯作者。该研究由国家重点研发计划、973项目、及北京市政府资助，在北京生命科学研究所完成。
