脑连接图谱研究是神经生物学主要的研究课题之一。以往研究主要注重于描绘大脑中的不同脑区之间以及不同位置神经元类群之间的连接。虽然这些脑连接图谱揭示了神经系统的基本结构，但由于缺乏单细胞精度，脑区水平或神经元类群水平的连接图谱并不能准确反映神经系统的精细结构。目前，有两个因素限制了单神经元连接谱的研究进展：一方面，为了清晰分辨单神经元的结构，需要对神经元进行稀疏高亮标记；另一方面，需要高精度高通量的成像系统来获得全脑成像，并需要特殊图像处理技术进行神经元重构。
针对第一个问题，罗敏敏实验室开发了一种基于AAV的表达系统，可以稀疏、高亮地标记特定类型的神经元。这一标记系统由两个AAV载体两组成：1）控制子（Controller），由TRE启动子与Cre依赖的转录模块组成。Cre依赖的转录模块中包含3’-5’反向的FLPo编码序列；2）放大子（Amplifier），由TRE启动子和FLP依赖的转录模块组成。FLP依赖的转录模块中包含3’-5’反向的GFP-IRES-tTA编码序列（图1左）。
这两个病毒需混合后进行脑内注射。混合病毒侵染神经元后，若神经元内无Cre表达，则标记不发生。当病毒感染Cre阳性神经元后，控制子中的Cre依赖的转录元件会被翻转。由于此时神经元内没有tTA表达，TRE启动子转录活性低。在大多数被病毒侵染的Cre阳性神经元中FLPo表达量极低，无法触发放大子中FLP依赖的转录模块的翻转。随机的，在某些Cre阳性神经元中，FLPo表达量达到一定的水平，触发放大子中FLP依赖的转录模块的翻转。由于放大子同样使用TRE启动子，转录活性低，只有少量的GFP和tTA表达。此时，在极少量细胞内tTA的表达量达到一定水平，足以结合TRE启动子并启动其后基因的转录，正反馈回路被触发：细胞表达更多的FLPo对剩余的放大子组件进行翻转，并使更多的GFP和tTA被表达出来，标记强度得到增强（图1右）。
该系统的设计有两个优点：1）由于标记的触发依赖于Cre，通过将该稀疏标记系统与Cre转基因小鼠联用，能够实现细胞类型特异性的稀疏标记；2）通过调整控制子和放大子的混合比例，能够控制标记的稀疏程度。
图一 稀疏标记系统工作原理
基于这一标记系统，罗敏敏课题组与华中科技大学国家光电研究中心fMOST课题组合作，建立了“稀疏标记-样本包埋-fMOST成像-神经元重构-数据校准-量化分析”的流水线，实现了稳定高通量的全脑成像和图像分析。借助这一流水线，研究人员在DAT-Cre小鼠中重构了15个中脑多巴胺神经元的完整形态。通过单细胞形态学分析，研究人员能够将重构的多巴胺神经元分为两类：一类多巴胺神经元只有单个投射目标，轴突在终点处会形成密集的末端树状分支（图二左）；另一类投射轴突分布比较广泛，会有多个旁分支投向不同目标，少有末端树状分支（图二右）。
图二 15个多巴胺神经元的全脑投射形态重构
研究人员利用不同血清型的AAV病毒，进一步拓展了稀疏标记系统，实现了投射特异性的神经元稀疏标记。利用此方法并结合fMOST成像，研究人员成功对皮层-纹状体投射神经元进行特异性标记和完整重构（图三）。
图三 投射特异性标记策略实现皮层-纹状体PT/IT神经元完整形态重构
组织透明化是近期成像领域屡有突破的技术。研究人员将稀疏标记系统与组织透明结合，在PV-Cre和SOM-ires-Cre小鼠中特异性的标记了两类中间神经元，制成脑片后用uDISCO方法进行透明化处理。随后在共聚焦显微镜下成像，并对对神经元进行了重构。通过此方法，研究人员实现了中间神经元的快速重构，并且可以高效地对神经元树突的分支特征进行量化分析（图四）。
图四 稀疏标记策略与组织透明结合，实现中间神经元重构
该稀疏标记系统的另一大优点是可拓展性高。最初版本的稀疏标记系统中，研究人员利用了Cre和FLP这一对重组酶。通过引入新的重组酶，理论上可以构建与Cre/FLP版本相正交的新版本稀疏标记系统，以实现在同一样本内对不同种类神经元的多色标记。为了验证此策略，研究人员引入了DreO和vCre这一对新的重组酶，构建了DreO/vCre版本的稀疏标记系统（图五左）。利用Cre/FLP和DreO/vCre两个版本的稀疏标记系统，研究人员成功实现在同一鼠脑内对两群神经元进行双色稀疏标记（图五右）。
图五 引入正交重组酶实现多色稀疏标记
相比于现有的稀疏标记方法，罗敏敏课题组开发的这一稀疏标记策略具有易使用、易拓展、效率高的特点。除了文章中展示的分子特异性或投射特异性标记，理论上该系统也可以与光遗传学分子、分子探针、CRISPR/Cas9元件等联用，用于单细胞水平功能性研究。这一技术的开发将有助于将脑连接谱研究推向单细胞精度，并有希望帮助研究人员在单细胞精度下对正常及病理状态的神经元进行研究。
我所罗敏敏实验室林睿博士、PTN项目博士生王睿宇以及华中科技大学国家光电研究中心袁菁博士为本文的共同第一作者，其他作者包括罗敏敏实验室冯琦茹、周宥彤，华中科技大学国家光电研究中心曾绍群博士、任淼博士、博士生蒋思齐、倪鸿、周灿。我所罗敏敏博士及华中科技大学龚辉教授为本文共同通讯作者。该研究由科技部973、国家自然科学基金委及北京市政府资助，在北京生命科学研究所和华中科技大学国家光电研究中心完成。
