浙江大学医学院, 浙江 杭州 310058
2020-11-19 收稿, 2021-01-15 录用
基金项目: 浙江省基础公益研究计划项目（LGF20H090012）、浙江省教育厅一般科研项目（Y202043496）和中央高校基本科研业务费专项资金（2019FZA7004）资助
*通讯作者: 沈逸
摘要: 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）具有高分辨率和高光学切片的成像能力，是生命科学研究不可或缺的工具。通常采用的XY或者XYZ扫描方式成像速度慢，限制了生物研究中快速现象的追踪。本文介绍了实时快速成像的XT线扫描模式，并建立线扫描方向的识别方法。制作荧光小球样本，经过荧光小球划出不同方向的线段，使线段的一端接近荧光小球的中心而另一端远离，对线段进行XT线扫描，根据荧光信号与两端距离的远近判断扫描方向。阐述了XT线扫描在Zeiss、Nikon和Olympus共聚焦显微镜中的具体操作方法，并比较了其线扫描方向的差异。本研究建立了一套确定线扫描方向的实用方法，该方法简便易操作，具有普遍适用性，可为显微成像从业者和研究者提供借鉴。
关键词: 激光扫描共聚焦显微镜线扫描扫描方向荧光小球
Establishment and Application of Line Scan Direction Recognition Method Based on LSCM
LIU Shuangshuang, XIAO Guifeng, HONG Xiaoli, SHEN Yi
School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, P. R. China
*Corresponding author: SHEN Yi
Abstract: Laser scanning confocal microscope (LSCM) is an indispensable tool for life science research because of its high resolution and imaging ability of optical slices. The slow imaging speed of the commonly used XY and XYZ scanning methods limits the tracking of fast phenomena in biological research. This article described an XT line scanning mode for real-time fast imaging and established a method for identifying the direction of line scanning. The line segments in different directions were drawn through the fluorescent spheres, so that one end of the line segment was close to the center of the fluorescent sphere and the other end was far away. The XT line scanning was performed on the line segment, and the scanning direction was judged by the distance between the fluorescence signal and the two ends. The operating methods of XT line scanning in Zeiss, Nikon and Olympus confocal microscopes were described in detail, and the differences of the line scanning direction were compared. This method to determine the line scanning direction is simple and easy to operate, and has universal applicability, which can provide guide for application for microscopic imaging practitioners and researchers.
Key words: laser scanning confocal microscopeline scanscan directionfluorescent spheres
基础生物医学的研究主要集中在细胞、组织和模式生物中的复杂动态过程，这些过程发生在不同的时间和空间尺度范围内，其研究方向包括器官的发育和功能的变化、细胞内离子介导的信号传导、囊泡和蛋白质运输过程等。激光扫描共聚焦显微镜在解决这些问题方面起着举足轻重的作用[1, 2]。通常采用的XY或XYZ扫描方式实现了高分辨生物结构的可视化，但是高分辨率主要指的是空间分辨率，时间分辨率仍然落后于许多生物动态过程的速度。
为了实现快速共聚焦显微成像，通常采用高速扫描装置[3](如共振振镜)或者多光束扫描装置(Nipkow Spinning disk)[4, 5]，然而这些系统的灵敏度和分辨率较低，速度也只能达到每秒几百帧，仍然达不到高分辨快速成像的要求。激光扫描共聚焦显微镜的XT线扫描方式是对同一条线段重复扫描，检测一段时间里荧光信号的快速变化，XT线扫描方式能够达到每秒上千帧的扫描速度，解决了生命科学研究中追踪快速事件的难题。但有些品牌的共聚焦显微镜进行XT线扫描时，扫描方向无法识别。扫描方向不确定，则无法判断荧光信号的具体定位及快速移动信号的方向，限制了对诸多现象的深入研究。本研究建立了一套确定XT线扫描方向的实用方法，详细阐述了Zeiss、Nikon和Olympus共聚焦显微镜XT线扫描模式的具体操作方法及线扫描方向的差异。
1 制作荧光小球样品以荧光笔制成荧光小球作为研究对象。利用红色(或绿色)荧光笔在显微镜专用的活细胞培养皿底部画1~2条线段，为避免荧光小球发生重叠，线段不宜过多。加入1 mL纯净水，轻轻摇晃培养皿，将划线区域的荧光粉溶解，形成单个分散的荧光小球溶液，静止10 min后，荧光小球贴于培养皿底。将培养皿放置到共聚焦显微镜载物台上，利用60XO或者63XO物镜进行显微成像(图 1)。
图 1
 | 图 1 荧光小球样本制作和荧光小球XY二维图像(物镜：60XO) A.荧光小球样本制作; B.荧光小球XY图像 |
2 建立线扫描方向识别技术共聚焦显微镜线扫描模式通常与T时间序列结合使用，称为XT线扫描。有些品牌的共聚焦显微镜没有标注扫描方向，从图像上也无法直接识别。为了确定线扫描方向，以荧光小球为研究对象，首先采集一张荧光小球XY二维图像，然后经过荧光球画出不同方向的扫描线段，分别为水平、垂直、斜向上、斜向下，其中线段的一端靠近荧光球，另一端则远离荧光球，最后对上述线段进行时间序列扫描获得XT线扫描图像，其中线扫描图像的X轴为经过小球画出的线段，Y轴为时间，荧光信号为位于荧光小球内的线段部分。
线扫描图像的左端为扫描起始端，判断XY二维图像中扫描线段的扫描方向关键在于确定线扫描图像左端对应的扫描线段的位置。根据线扫描图像靠近荧光信号的一边对应XY二维图像中靠近荧光球的线段端，可以判断图 2中：扫描线为水平线时，扫描方向为从左边到右边；扫描线为垂直线时，扫描方向为从下端到上端；扫描线段为斜向下时，扫描方向为从左上端到右下端；扫描线段为斜向上时，扫描方向为从左下到右上(图 2)。
图 2
 | 图 2 确定共聚焦显微镜线扫描方向的示意图 |
3 不同品牌共聚焦显微镜XT线扫描技术的建立3.1 Olympus激光共聚焦显微镜XT线扫描技术(1) XT线扫描图像的采集：红色荧光笔制作荧光小球，利用Olympus共聚焦显微镜FV10-ASW软件采集图像。选择543激光器激发红色荧光小球，检测器接收范围为560~660。通过Focus x2预览图像，调节焦面、激光通过率和光电倍增管电压值等参数，采集一张XY二维图像。选择【line】扫描方式，扫描速度设为10 μs/pixel，线扫描时，【Time】默认为选中状态，【TimeScan】选择FreeRrun，【Num】选择200~2000。经过荧光球画出不同方向的线段，分别为水平线、垂直线、斜向上线、斜向下线，其中线段的一端靠近荧光球，另一端则远离荧光球，点击【capture】获取XT线扫描图像。
(2) 线扫描方向的确定：Olympus共聚焦显微镜在进行线扫描时，软件没有标注扫描方向，也无法直接识别。对上述线段进行XT线扫描，线扫描图像中靠近荧光线的一端对应XY图像中靠近荧光球的线段末端。实验发现：扫描线段为水平线时，扫描方向为从线段的左端到右端；扫描线段为垂直线时，扫描方向为从线段下端到上端；线扫描线段为斜向上时，扫描方向从左下端到右上端。扫描线段为斜向下时，扫描方向从右上到左下(图 3)，当所画线段的起点与上述线段起点相反时，线扫描方向仍然保持不变。
图 3
 | 图 3 Olympus共聚焦显微镜线扫描方向的确定 A1、B1、C1、D1是荧光球的XY二维图像，A2、B2、C2、D2是扫描线段的XT图像 |
3.2 Zeiss激光共聚焦显微镜XT线扫描技术(1) XT线扫描图像采集：绿色荧光笔制作荧光小球，利用Zeiss 880共聚焦显微镜Zen Black软件采集XT线扫描图像。设置光路，选择488激光器激发荧光小球，检测器接收范围为500~550，点击live预览图像，调节激光强度和Gain，获取XY二维图像。设置XT线扫描参数，选中【Time Series】，设置Interval为0，cycles为200~2000。【Scan Mode】选择line，选择线段按钮【Line select】，经过小球画出不同方向的线段，点击【Start Experiment】获取线扫描图像。
(2) 扫描方向的确定：Zeiss共聚焦显微镜在进行线扫描时，软件标注了扫描方向，可以直接识别。同样利用荧光小球画出上述4种线段，对线段进行XT线扫描。实验发现：所画线段的箭头方向即为扫描方向，即从所画线段的起始点到终点的方向进行扫描(图 4)，所以Zeiss共聚焦显微镜线扫描方向与所画线段的起始点有关。
图 4
 | 图 4 Zeiss共聚焦显微镜线扫描方向的确定 A1、B1、C1、D1是荧光球的XY二维图像，A2、B2、C2、D2是扫描线段的XT图像 |
3.3 Nikon激光共聚焦显微镜线扫描技术的建立(1) XT线扫描图像采集：绿色荧光笔制作荧光小球，利用Nikon A1R共聚焦显微镜NIS-Element软件采集图像。选择488激光器激发绿色荧光小球，检测器接收范围为500~550。设置扫描参数，采集一张XY二维图像；【ND Acquisition】窗口选择Time，【Interval】设置为No delay，【loop】设置为200~2000；【Alplus Scan Area】窗口选择line scan area，经过小球分别画出上述4种线段，点击run now采集XT图像。
(2) 扫描方向的确定：Nikon A1R共聚焦显微镜进行线扫描时，软件没有标注扫描方向。对上述线段进行XT线扫描后，根据荧光线与两边距离的远近，识别线扫描图像X轴两端对应扫描线段的两端位置。实验发现：扫描线段为水平线时，扫描方向为从线段的左端到右端；扫描线段为垂直线时，扫描方向为从线段上端到下端；扫描线段为斜向上时，扫描方向从左下端到右上端；扫描线段为斜向下时，扫描方向从左上到右下(图 5)。利用Nikon共聚焦显微镜进行XT线扫描时，扫描方向与扫描线段的起始点无关，与斜线倾斜角度也无关。
图 5
 | 图 5 Nikon共聚焦显微镜线扫描方向的确定 A1、B1、C1、D1是荧光球的XY二维图像，A2、B2、C2、D2是扫描线段的XT图像 |
4 XT线扫描技术在脑血管中的应用XT线扫描模式能够快速捕捉移动信号随时间的变化情况，如脑内红细胞的运动。小鼠尾静脉注射荧光染料fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran)，经血液循环到达全身血管。FITC染料仅能标记血浆而不进入红细胞，血浆被激发后发出绿色荧光，红细胞呈现黑色暗影。沿着血管管腔中心画一条扫描线，利用激光扫描共聚焦显微镜(或双光子显微镜)对血流进行XT线扫描，红细胞随着时间的变化形成黑色条纹运动轨迹，其中线扫描图像中X轴为红细胞的运动距离，Y轴为扫描时间(图 6)。每一条黑色条纹代表一个红细胞，根据红细胞单位时间内的运动距离可计算血流速度。
图 6
 | 图 6 XT线扫描在脑血管中的应用 A.脑血管二维图像; B.XT线扫描图像 |
5 讨论激光扫描共聚焦显微镜通过对细胞或生物个体高分辨率可视化检测其结构和功能的变化，在生命科学研究中有着重要作用。共聚焦显微镜的XT线扫描模式通过对一条线段进行重复扫描，捕捉这条扫描线段上荧光信号的变化，可以达到1 kHz的扫描速度，为细胞内的快速事件研究开创了新思路。XT线扫描具有以下优势：采集图像的时间分辨率高；能够同时可视化完整的细胞个体和荧光信号的快速动态变化；对共聚焦显微镜硬件配置无特殊要求，活细胞时间序列扫描模式虽然能够跟踪荧光信号的动态变化，但需要配备自动聚焦系统和活细胞培养装置[6]。
目前，XT线扫描技术已在脑微循环[7-9]、离子信号[10, 11]研究中得到应用。但是很多商业化的共聚焦显微镜没有指示线扫描方向，也无法直接识别。本研究利用荧光小球建立了识别线扫描方向的方法，用于已具有扫描方向的共聚焦显微镜后，发现本方法得到的结果与显微镜线扫描指示方向一致，如Zeiss共聚焦显微镜。对于没有指示扫描方向的共聚焦显微镜，如Olympus和Nikon共聚焦显微镜，实验发现，Olympus和Nikon共聚焦显微镜在水平线和斜线中的扫描方向一致，水平线为从扫描线的左端到右端，斜线都是从斜线的左侧到右侧，垂直线则不同，Olympus为从扫描线下端到上端，Nikon为从扫描线上端到下端。实验还发现, 没有指示扫描方向的共聚焦显微镜，线扫描方向与所画扫面线起始点无关，这一点与有指示扫描方向的共聚焦显微镜不同。
本研究建立的线扫描方向识别方法，简单易操作，且具有普适性，不仅适用于上述品牌激光扫描共聚焦显微镜，还适用于其他品牌，同时，也适用于双光子显微镜，希望本研究能为显微成像相关研究提供一定的参考。
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