张金萍^1,2, 范景彪¹, 黄艳¹, 米红宇¹, 耿建新²
1. 新疆大学 化学化工学院 石油天然气精细化工教育部&自治区重点实验室, 新疆 乌鲁木齐 830046;
2. 中国科学院 理化技术研究所, 北京 100190
2018-04-04 收稿, 2018-05-10 录用
^*通讯作者: 黄艳, E-mail: xjuchem_2012@163.com; 耿建新, E-mail: jianxingeng@mail.ipc.ac.cn

摘要: 本文设计合成了一种石墨烯/壳聚糖复合物薄膜，并将其作为电化学电极应用于选择性检测具有旋光活性的色氨酸（Trp）对映体。采用X射线衍射、红外光谱、拉曼光谱、X射线光电子能谱、透射和扫描电子显微镜表征了石墨烯/壳聚糖复合物的结构。以石墨烯/壳聚糖复合物为电极，通过示差脉冲伏安法实现了Trp对映异构体的识别，结果表明L-Trp比D-Trp具有更高的电化学响应，并且峰电流密度和Trp的浓度在0.3×10^-4~1.5×10^-4 mol·L^-1范围内有线性关系。该复合物电极具有厚度和面积可控、稳定性高等优点，可显著提高电化学检测中的电流信号，有望用于分子药物及临床医学领域中手性对映体的识别。
关键词: 石墨烯壳聚糖示差脉冲伏安法氨基酸选择性识别
Electrochemical Selective Recognition of Tryptophan Enantiomers Based on Graphene/Chitosan Composite Films
ZHANG Jinping^1,2, FAN Jingbiao¹, HUANG Yan¹, MI Hongyu¹, GENG Jianxin²
1. Key Laboratory & Ministry of Oil & Gas Fine Chemicals, Ministry of Education Xinjiang Uyghur Autonomous Region, Xinjiang University, Urumqi 830046, Xinjiang, P. R. China;
2. Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, P. R. China
^*Corresponding author: HUANG Yan, E-mail: xjuchem_2012@163.com; GENG Jianxin, E-mail: jianxingeng@mail.ipc.ac.cn
Abstract: In this research, graphene/chitosan composite films were designed and used as electrode for electrochemical enantioselective recognition of tryptophan (Trp) enantiomers. The structure of the graphene/chitosan composite films were characterized using X-ray diffraction, FT-IR spectroscopy, Raman spectroscopy, XPS spectroscopy, transmission and scanning electron microscopy. Trp enantiomers were recognized using graphene/chitosan composite electrode by a differential pulse voltammetry. Experimental data indicated that L-Trp exhibited stronger electrochemical response than D-Trp, and that a linear relationship between the current density of the oxidative peak and the concentrations of L-/D-Trp was established in a concentration span ranging from 0.3×10^-4 mol·L^-1 to 1.5×10^-4 mol·L^-1. The composite electrode had a number of advantages including controllable thickness and area, good stability, and enhanced electrochemical signals. Therefore, the graphene/chitosan composite electrodes are expected to be used for enantioselective recognition in areas such as molecular drugs and clinical medicine.
Key words: graphenechitosandifferential pulse voltammetryamino acidsenantiomeric recognition
手性是表达化合物分子结构不对称性的术语，手性广泛存在于药物、食品、生命科学等领域，赋予了物质特定的功能和性质。氨基酸是合成蛋白质的重要原料，为生物的新陈代谢、生命活动和生长发育提供了重要的物质基础。作为手性分子(除甘氨酸外)，不同构型的氨基酸在生命科学及其他领域发挥着不同的作用。如生物界中的蛋白质都是由L-氨基酸缩合得到的，D-氨基酸不能用于蛋白质的合成，两者混用可能会对生物体产生毒害作用^[1]。L-色氨酸(L-Trp)被称为第二氨基酸，其代谢产物5-羟色胺促进睡眠和精神稳定，补充L-Trp可明显缓解抑郁症患者的病情^[2]。D-色氨酸(D-Trp)是一种非蛋白质氨基酸，是抗癌和免疫药物的重要前驱体。由于L-Trp和D-Trp发挥着不同的作用，因此对Trp对映体的识别有十分重要的意义。目前，Trp对映体的检测方法包括毛细管电泳法^[3]、高效液相色谱法^[4]和电化学方法^{[5, 6]}等，其中电化学方法因成本低、灵敏度高及稳定性好等优点而引起了科研工作者的广泛关注^{[7, 8]}。纳米材料(如碳纳米管^[9]、石墨烯^[10]、金纳米粒子^[11]等)和手性识别剂(包括多糖^[12]、蛋白^[13]等)复合可显著地提高电化学传感器的灵敏度。Gu等^[14]通过电沉积法, 采用CS或磺化壳聚糖(SCS)修饰玻碳电极，实现了Trp对映异构体的电化学识别。Tao等^[15]用高度有序的CS和Cu-β-环糊精复合材料修饰玻碳电极(CS/Cu-β-CD/GCE)，通过差示脉冲伏安法(Differential pulse voltammetry, DPV)实现了Trp对映异构体的识别。结果显示，在30℃时，L-Trp的氧化峰电流与D-Trp的氧化峰电流比值高达7.26。但是，以上电化学传感器多采用玻碳电极，成本较高，且电极修饰工艺复杂、耗时长。
石墨烯(graphene)具有高导电性、高热传导性、高透明度、高强度、大比表面积和易化学修饰等优点^{[16, 17]}。壳聚糖3位和5位氧原子形成的分子内氢键使其与DNA分子类似，分子链呈螺旋结构^[18]，具有旋光性，并且具有生物相容性及可降解等优点。截止目前，石墨烯/CS复合物在生物医药^[19]、重金属吸附^[20]、电化学传感器^[21]等领域得到了比较广泛的应用，但是，石墨烯和CS构成的薄膜结构直接用于电化学检测的电极材料还未见报道。
为了降低成本，提高电化学传感器的电流响应，本研究以石墨烯作为导电材料，CS作为手性识别剂，在氧化铟锡(ITO)玻璃表面制备了石墨烯/CS的复合薄膜，用于Trp对映异构体的电化学选择性识别。该方法从氧化石墨烯(GO)的制备出发，由抗坏血酸还原制备了稳定分散的还原氧化石墨烯(RGO)和CS的分散液(RGO/CS)^[22]，通过真空抽滤法将RGO/CS复合物薄膜均匀沉积于ITO玻璃表面，得到RGO/CS@ITO电极。该方法具有制备工艺简单、廉价、灵敏度高的特点。通过DPV法分别检测了L-Trp、D-Trp及不同含量的L-Trp和D-Trp混合物溶液，结果表明，RGO/CS复合物电极对L-Trp有更高的电流响应，实现了Trp对映体的识别。该识别方法有望用于分子药物及临床医学领域中手性对映体的识别。
1 实验部分1.1 药品与仪器药品：天然石墨粉，山东青岛华泰润滑密封有限公司；去离子水，国药集团化学试剂有限公司；十二水合磷酸二氢钠(分析纯)、十二水合磷酸氢二钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；氯化钾、冰醋酸(分析纯)、硫代硫酸钠、氢氧化钠、高锰酸钾(分析纯)、五氧化二磷、硫酸(分析纯)、硝酸(分析纯)、盐酸(分析纯)，北京化工厂；壳聚糖、亚铁氰化钾(分析纯)、铁氰化钾(分析纯)、抗坏血酸、L-和D-色氨酸，均为阿拉丁公司产品；ITO玻璃，广东省佛山市源晶美玻璃有限公司；阳极氧化铝膜(AAO，47 mm，0.02 μm)，英国Whatman公司。
仪器：Bruker D8-focus X射线粉末衍射仪，德国布鲁克公司；Excalibur 3100傅里叶变换红外光谱仪，美国Varian公司；InVia-Reflex显微共焦激光拉曼光谱仪，英国Renishaw公司；ESCALAB 250Xi X射线光电子能谱仪，英国赛默飞世尔科技公司；JEM-2100透射电子显微镜(TEM)，日本电子株式会社；Hitachi S-4800型扫描电子显微镜(SEM)，日本日立公司；J-815圆二色光谱仪，日本分光公司；Chi660E电化学工作站，北京华科普天科技有限公司。
1.2 石墨烯/壳聚糖复合物电极的制备1.2.1 GO的制备GO由改进的Hummer法制备^[23]，通过离心分离得到GO水凝胶，用于石墨烯和CS复合物的制备。
1.2.2 RGO/CS复合物的制备将CS(25 mg)加入醋酸溶液中(0.1 mol·L^-1, 100 mL)，搅拌至溶解，获得0.25 mg·mL^-1的CS酸溶液。移取8 mL(0.25 mg·mL^-1)CS酸溶液于玻璃瓶中，搅拌下缓慢滴加8 mL(1 mg·mL^-1)GO溶液，超声30 min获得分散均匀的混合溶液。向混合溶液中加入抗坏血酸(80 mg)，于60 ℃下搅拌6 h，使GO还原得到RGO。向混合溶液中滴加氢氧化钠溶液，pH值调节为7，取200 μL上述混合液，稀释至250 mL，超声，抽滤，获得沉积于AAO基底的RGO/CS复合物薄膜。
1.2.3 RGO/CS@ITO电极的制备取适量NaOH溶液(3 mol·L^-1)于培养皿中，把沉积于AAO基底的RGO/CS复合物薄膜轻轻放置于NaOH溶液的表面上，待氧化铝模板腐蚀溶解后，用去离子水交换多次，待溶液的pH值为7时，将处理好的ITO玻璃放入培养皿中，通过抽滤，使复合物薄膜沉积于ITO表面，60 ℃下干燥8 h^[24]。把RGO/CS@ITO裁切作为工作电极(0.5 cm²)备用。
1.3 DPV法测试Trp对映异构体以RGO/CS@ITO为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，采用DPV法，检测Trp的对映异构体。Trp溶解于PBS缓冲溶液(0.1 mol·L^-1 PBS，pH为7.0)用于DPV检测。电压范围：0.2~1.2 V，电压增量：0.01 V，振幅：0.05 V，脉冲宽度：0.2 s。以ITO电极作为对比试验时，L-/D-Trp溶液的浓度均为1.0 mmol·L^-1；以RGO/CS@ITO作为工作电极，L-/D-Trp溶液的浓度为：0.3 mmol·L^-1、0.5 mmol·L^-1、0.7 mmol·L^-1、1 mmol·L^-1、1.2 mmol·L^-1、1.5 mmol·L^-1。L- Trp和D-Trp混合物溶液的总浓度为1.0 mmol·L^-1，其中L-Trp组分的含量依次为10%、20%、40%、60%、80%。
2 结果与讨论2.1 RGO/CS电极制备GO易分散于水，且导电性差，因此不适合用于制备稳定的薄膜电极；经抗坏血酸还原得到的RGO在水中的分散性较差，导电性高，制备的RGO薄膜在水溶液中可作为稳定的电极材料使用。GO在CS存在的条件下经抗坏血酸还原得到RGO/CS的复合物，该复合物的分散性优于RGO，通过抽滤可获得均匀分布于AAO基底的RGO/CS薄膜，将其转移到ITO基底得到RGO/CS@ITO电极。
2.2 结构与性能测试2.2.1 RGO/CS复合物结构表征图 1(a)是CS、GO、RGO、RGO/CS的XRD图。可以看出，GO在2θ =11.5°有一个尖锐的衍射峰。经抗坏血酸还原后，GO片层表面上的环氧基团减少，故其原有的衍射峰消失，在2θ =25°处出现一个新的较宽的衍射峰，对应于RGO的(002)晶面^[25]。CS在2θ =20°处有一个明显的衍射峰。相比于RGO和CS，RGO/CS的衍射峰出现在2θ =22°附近，与RGO的衍射峰相比向小角区移动，说明通过与CS的复合，RGO/CS复合物中具有更大的层间距^[26]。
图 1
Fig. 1

图 1 CS、GO、RGO和RGO/CS的X射线衍射(a)和红外图谱(b)Fig.1 (a) XRD patterns and (b) FT-IR spectra of CS, GO, RGO and RGO/CS

采用FT-IR光谱技术，对CS、GO、RGO、RGO/CS进行表征，结果如图 1(b)所示，GO样品在3413 cm^-1和1732 cm^-1的吸收峰分别对应于O—H键C=O键的伸缩振动^[27]。1050 cm^-1处的吸收峰归属于GO片层表面的环氧基团C—O—C键的不对称伸缩振动。GO经抗坏血酸还原后，归属于环氧基团的吸收峰消失。CS样品在3400 cm^-1处附近有一个宽带吸收峰，源于—OH和—NH的伸缩振动吸收的叠加；而在1650 cm^-1处的吸收峰源于酰胺键的振动；此外，在1120 cm^-1的吸收峰归属于二级羟基—C₂OH的振动，在900~890 cm^-1附近的信号属于多糖的β-构型糖苷键吸收^[28]。对于RGO/CS样品，在其FT-IR光谱观察到对应于RGO和CS的特征吸收峰。
2.2.2 RGO/CS复合物中界面作用的表征图 2(a)为GO、RGO和RGO/CS的拉曼光谱图，3个材料均在1330和1590 cm^-1处出现了两个主要的峰，分别为石墨烯材料的D带和G带，代表石墨烯片层的无序和有序结构^[29]。GO、RGO和RGO/CS的D带和G带强度比分别为1.08、1.46和1.77，这一结果与通过GO还原制备RGO的文献报道一致^[30]，化学还原导致其片层结构中小尺寸的共轭结构增加。材料的表面功能性是决定材料性能的关键因素。图 2(b)为RGO/CS的C1s XPS谱图，拟合分峰在284.7、286.2、286.8和288.5 eV处得到信号峰，它们分别对应于C—C、C—N、C—O和C(O)O^[31]的结合能，进一步证明GO的还原和RGO/CS复合物形成。
图 2
Fig. 2

图 2 (a) GO、RGO和RGO/CS的拉曼光谱；(b) RGO/CS的C1s XPS高分辨图谱Fig.2 (a)Raman spectra recorded for GO, RGO and RGO/CS; (b) high-resolution C1s XPS spectrum recorded for RGO/CS composite

2.2.3 RGO/CS复合物微观形貌的表征图 3(a)为RGO/CS薄膜的透射电子显微镜(TEM)图片，可以看出，CS分散在RGO片层表面呈颗粒状分布，RGO片层具有明显的褶皱结构^[32]。图 3(b)为沉积在ITO玻璃上的RGO/CS薄膜的扫描电子显微镜(SEM)图片，可以看出，薄膜表面具有明显的突起，这是RGO/CS复合物片层堆积的结果。在真空制膜的过程中，负载着CS的RGO片均匀组装，片片紧密叠加，分布在RGO片层表面及层间的CS造成了复合物薄膜粗糙的形貌。
图 3
Fig. 3

图 3 RGO/CS的TEM图片(a)和RGO/CS薄膜的SEM图片(b)Fig.3 (a) The TEM image of RGO/CS; (b) SEM image of RGO/CS film deposited on ITO slide

2.2.4 RGO/CS@ITO电极对L-/D-Trp的选择性检测以RGO/CS@ITO为工作电极，通过DPV法研究了L-/D-Trp电化学行为。图 4(a)为L-Trp和D-Trp的DPV曲线，可以看出，随着电压的增加，电流密度逐渐升高，在0.7 V处出现L-Trp和D-Trp的氧化峰，并且，L-Trp的峰电流强度明显比D-Trp的高(比值为1.2)，证明RGO/CS@ITO电极对L-Trp的识别效果更强。CS链的螺旋结构为RGO/CS复合物薄膜创造了手性环境，据文献报道，CS对D-Trp比对L-Trp有更强的氢键作用，因此，CS抑制了D-Trp在RGO表面的分子链运动，L-Trp更容易被氧化，从而L-Trp在DVP检测中给出比D-Trp更强的氧化电流。作为对比，从图 4(b)可以看出L-和D-Trp对ITO电极在0.2~1.2 V范围的电流密度基本相同，说明ITO对Trp对映体无识别效果。
图 4
Fig. 4

图 4 以RGO/CS@ITO为工作电极(a)和以ITO为工作电极(b)Trp对映异构体的DPV曲线Fig.4 DPV curves recorded for Trp enantiomers using RGO/CS@ITO as working electrode (a) and using ITO as working electrode (b)

为了定量说明RGO/CS复合物电极对Trp对映异构体的手性识别效果，我们针对不同浓度的L-Trp和D-Trp溶液进行了DPV测试, 如图 5(a)和5(c)所示，发现随浓度的增加，Trp对映异构体的氧化峰及电流密度逐渐增加。将峰电流密度和Trp对映异构体浓度作图，如图 5(b)和5(d)所示，在0.3 ×10^-4~1.5×10^-4 mol·L^-1范围内，峰电流密度与Trp对映异构体浓度呈线性关系，因此，RGO/CS复合物电极在较大的浓度范围内可实现对Trp对映异构体的选择性识别，对L-Trp异构体具有更灵敏的识别效果。
图 5
Fig. 5

图 5 以RGO/CS@ITO为工作电极，不同浓度L-Trp溶液的DPV曲线(a)及峰电流密度与浓度的线性关系(b)；以RGO/CS@ITO为工作电极，不同浓度D-Trp溶液的DPV曲线(c)及峰电流密度与浓度的线性关系(d)Fig.5 DPV curves recorded for L-Trp solutions at various concentrations using RGO/CS@ITO as working electrode (a) and the linear relationship between the peak current density and the concentration of L-Trp solutions (b); DPV curves recorded for D-Trp solutions at various concentrations using RGO/CS@ITO as working electrode (c) and the linear relationship between the peak current density and the concentration of D-Trp solutions (d)

对映异构体混合物的手性识别在实际应用中具有更大的价值。然而，目前手性识别大多是在纯的L-或D-氨基酸溶液中进行。我们制备了一组具有不同L构型和D构型组成的Trp对映异构体混合物溶液，如图 6(a)所示，DPV法检测表明，随L-Trp组分比例的增加，Trp对映异构体混合物溶液的峰电流密度逐渐增加，并且，峰电流密度和L-Trp在混合物溶液中含量呈线性关系, 如图 6(b)所示。因此，RGO/CS复合物电极具有在对映异构体混合物中进行手性检测的能力。
图 6
Fig. 6

图 6 以RGO/CS@ITO为工作电极，不同组成的Trp对映异构体混合物的DPV曲线(a)和峰电流密度与混合物中L-Trp组分浓度的线性关系(b)Fig.6 DPV curves recorded for the mixture of Trp enantiomers at various ratios of L-Trp to D-Trp (a) and the linear relationship between peak current density and the content of L-Trp in the mixture of Trp enantiomers (b)

2.3 手性识别机理图 7(a)为CS溶液(1 mg·mL^-1)的圆二色光谱(CD)曲线，在210 nm处有明显的负带吸收，该吸收带可归因于CS分子链乙酰基团的n→π^*电子跃迁，负带吸收值约为-20 mdge，说明CS分子链呈L螺旋构型^[33]。由图 7(b)可知，L-Trp溶液(0.001 mg·mL^-1)在230 nm附近有正带吸收，这源于L-Trp结构中芳香环间的堆积作用，正带吸收值约为13 mdge^[34]，与L-Trp溶液相反，D-Trp溶液呈现负带吸收。
图 7
Fig. 7

图 7 壳聚糖(a)和色氨酸对映体(b)的CD光谱图Fig.7 The CD spectra of CS (a) and L-/D-Trp (b)

本研究以CS作为手性识别剂，CS负载于石墨烯片表面(图 3)，其分子链上的手性碳原子和分子链的螺旋结构为RGO/CS复合物提供手性环境，为Trp对映异构体的选择性识别提供了可能性。由RGO/CS复合物的形貌(图 3)可知，CS分子链负载于RGO片层的表面，在通过抽滤法制备薄膜的过程中，RGO/CS复合物片层紧密堆砌叠加，形成厚度均匀的薄膜，同时，分布在RGO片层表面及片层间的CS造成了复合物薄膜表面较粗糙的形貌。RGO/CS@ITO电极对Trp对映异构体的选择性识别源于CS对Trp对映异构体的选择性作用。
3 结论本文从RGO和CS的复合物设计出发，通过真空抽滤法制备了RGO/CS@ITO电极，用于Trp对映体的电化学选择性识别。实验证明，L-Trp比D-Trp具有更高的电化学响应，并且峰电流密度和Trp的浓度在0.3×10^-4~1.5×10^-4 mol·L^-1范围内有线性关系。RGO/CS@ITO电极具有面积和厚度可控、稳定性高等优点，显著提高了电流信号，能够灵敏地识别Trp对映体，有望用于分子药物及临床医学领域中手性对映体的识别。
致谢 本论文工作受到国家自然科学基金(21462042，21262036，51773211)的支持，在此表示感谢。
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