, 张国梅1, 双少敏1, 董川21. 山西大学 化学化工学院, 山西 太原 030006;
2. 山西大学 环境科学研究所, 山西 太原 030006
2017-11-14 收稿, 2018-01-09 录用
山西省回国留学人员科研资助项目（2017-011）和山西省自然科学基金（201601D011017）项目资助
*通讯作者: 张彩红, E-mail: chzhang@sxu.edu.cn; 董川, E-mail: dc@sxu.edu.cn
摘要: 以吲哚（苯并吲哚）衍生物和4-羟基苯甲醛为原料，通过一步反应合成半花菁类pH荧光探针1和2。两个探针水溶性好、发光性能稳定，它们的紫外吸收光谱和荧光光谱都能比率检测酸性和碱性溶液pH变化，探针1的两个pKa为3.81和10.01，探针2的两个pKa为4.03和10.47。两个pH探针都具有Stokes位移大、灵敏度高、可逆性好等特点。二者相比，探针1对碱性更敏感，探针2对酸性更敏感。
关键词: 比率荧光探针半花菁pH变化紫外光谱荧光光谱
Preparation and Spectral Characterization of a pH Ratiometric Fluorescence Probe
CUI Lixia1, ZHANG Honghong1, LI Miao1, ZHANG Caihong1
, ZHANG Guomei1, SHUANG Shaomin1, DONG Chuan21. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, Shanxi, P. R. China;
2. Institute of Environmental Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, Shanxi, P. R. China
*Corresponding author: ZHANG Caihong, E-mail: chzhang@sxu.edu.cn; DONG Chuan, E-mail: dc@sxu.edu.cn
Abstract: Fluorescent probes (1 and 2) for pH based on semi-cyanine were synthesized from indole (benzo indole) derivatives and 4-hydroxybenzaldehyde using one-step condensation reaction. The probes have good water solubility and stable luminescence properties. They can be used to detect pH of acidic and alkaline solutions by the UV absorption spectra or ratiometric fluorescence spectra. The pKa data of probe 1 are 3.81 and 10.01, and the pKa data of probe 2 are 4.03 and 10.47. Both pH probes have some advantages, such as large Stokes shift, high sensitivity and good reversibility. Compared the two probes, probe 1 is more sensitive to the alkalinity, and probe 2 is more sensitive to the acidity.
Key words: ratio fluorescence probessemi-cyaninepH changesUV spectrafluorescence spectra
pH荧光探针具有操作简单、高灵敏度、高信噪比等特点，尤其是荧光探针与激光共聚焦细胞成像技术相结合，已经成为分子水平监测细胞内pH值的重要手段[1-3]。半花菁染料由于具有发光稳定、水溶性好以及对溶液环境比较敏感等特点，成为检测溶液pH的首选探针[4-6]。
大多数半花菁类pH荧光探针是通过吲哚环上未被取代的N原子发生质子化/去质子化作用实现pH值检测的[7-9]。本文以吲哚(苯并吲哚)衍生物和4-羟基苯甲醛为原料，通过一步反应合成半花菁类染料化合物1和2，其分子结构中含有杂环上未被取代的N原子和酚羟基的两个pH敏感点。然后利用紫外吸收和荧光光谱研究了其作为pH探针的光谱特性。
1 实验部分1.1 试剂与仪器主要试剂有4-羟基苯甲醛、1, 1, 2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚、2, 3, 3-三甲基-3H-吲哚、哌啶、无水乙醇。原料和试剂均为分析纯，购于Aldrich公司。实验用水为二次蒸馏水。
仪器：日本岛津UV-265紫外-可见分光光度计，日立F4500荧光分光光度计，瑞士Bruker Avance DRX600 MHz超导核磁共振仪，布鲁克Bruker Autofex NAILD-TOF质谱仪，梅特勒-托利多pH计。
1.2 实验方法1.2.1 合成方法探针1和2的合成路线如Scheme 1所示。4-羟基苯甲醛(0.732 g，6 mmol)、吲哚衍生物(5 mmol)和1.5 mL哌啶在25 mL无水乙醇中加热回流20 h[10]，冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，得到固体粗产品后用柱层析纯化，展开剂为V(二氯甲烷):V(乙酸乙酯)=1:1，得到目标化合物1和2。
Scheme 1
Scheme1
 | Scheme 1 探针1和2的合成Scheme1 Synthesis of probe 1 and 2 |
探针1(产率65.5%): 1HNMR (400 MHz, DMSO)：7.60~7.68 (m, 3H), 7.43~7.48 (m, 2H), 7.29 (t, J=14.4, 1H), 7.19 (t, J=14.3, 1H), 7.02 (d, J=17.6, 1H), 6.81 (d, J=8.0, 2H), 5, 75 (s, 1H), 1.38 (s, 6H)。13CNMR (100 MHz, CDCl3)：166.9, 151.3, 146.1, 130.8, 129.9, 129.5, 125.8, 124.7, 123.7, 122.5, 119.0。HRMS (MALDI-TOF) for C18H17NO：calcd. 263.1310 [M + H]+, found: 264.1379。
探针2(产率60%): 1HNMR (400 MHz, DMSO)：8.13(d, J=8.4, 1H), 7.99(d, J=8.0, 1H), 7.88~7.93 (m, 1H), 7.73~7.78 (m, 2H), 7.64~7.66 (m, 2H), 7.56~7.60 (m, 1H), 7.44~7.48 (m, 1H), 7.14 (d, J=16.4, 2H), 6.81(d, J=8.4, 2H), 1.58 (s, 6H)。HRMS (MALDI-TOF) for C22H19NO：calcd. 313.1467 [M + H]+，found: 314.1537。
1.2.2 紫外-可见和荧光光谱检测方法将探针1和2溶于DMF中，制得10 mmol/L的储备液。在pH滴定实验中，取2 μL探针储备液，用水/DMF (9/1, 体积比)体系稀释到10 μmol/L，定容至2 mL。所需溶液的pH值通过加入一定量的NaOH (0.1 mol/L)或HCl (0.1 mol/L)调节。激发和发射狭缝宽度均为5 nm，激发波长分别为380 nm (1)和400 nm (2)。所有光谱实验均在室温下进行。
2 结果与讨论2.1 紫外-可见吸收光谱图 1是探针1和2在水/DMF (9/1, V/V)体系中随pH变化的紫外-可见吸收光谱图。
图 1
Fig. 1
 | 图 1 在水/DMF (9/1, V/V)溶液体系中，探针1 (a、b)和探针2 (c、d)从中性到酸性和从中性到碱性随pH变化的紫外-可见吸收光谱图内图：探针1和2摩尔吸光系数(ε)随pH变化的拟合曲线Fig.1 Change of the absorption spectra of 1 (a、b) and 2 (c、d) in H2O/DMF (9/1, V/V) with pH Inset: sigmoidal fitting of the pH-dependent molar extinction coefficient ε |
探针1在pH=7的中性溶液中的最大吸收峰位于358 nm。当溶液pH从7降低到1时，358 nm处的吸收峰强度减弱，同时在420 nm处产生了新的吸收峰且峰强度增强。峰位置红移62 nm，在380 nm处出现一个明显的等吸收点。同时，溶液颜色由无色变为黄色(图 1a)。当溶液pH由7增大到13时，探针1的紫外吸收光谱随pH的变化也呈现比率变化，在400 nm处出现了一个新峰，吸收峰位置红移42 nm。等吸收点位于375 nm处(图 1b)。
探针2与探针1结构类似，由于共轭体系增大，导致最大吸收波长红移，摩尔吸光系数增加。在pH=7的中性溶液中，探针2呈现出两个峰，分别位于376 nm、306 nm。pH变化时的比率响应特性与探针1相似(图 1c、d)。
2.2 荧光光谱2.2.1 光稳定性研究通过测量探针1和2在2 h内随时间变化的荧光强度值，对探针的光稳定性进行了考察。如图 2所示，在水/DMF (9/1, 体积比)体系中，pH=3.5、7.0和10.5时，2 h内探针1和2分别在540 nm和570 nm处的荧光强度值基本保持不变，说明探针在外界空气下和溶液体系中具有很好的光稳定性。
图 2
Fig. 2
 | 图 2 在pH 3.5、7和10.5的水/DMF (9/1, V/V)体系中，10 μmol/L的1 (a)和10 μmol/L的2 (b)分别在540 nm和570 nm处的荧光强度随时间的变化Fig.2 Changes of the fluorescence intensity with times for 10 μmol/L 1 (a) and 10 μmol/L 2 (b) in H2O/DMF (9/1, V/V) at pH 3.5, 7 and 10.5, respectively |
2.2.2 探针对pH响应的荧光光谱在水/DMF (9/1, V/V)体系中分别考察了探针1和2对pH响应的荧光光谱。探针1和2在不同pH中能快速响应，实验过程中，将探针加入不同pH溶液体系，立即出现相应的颜色变化，测定光谱可知强度已经达到稳定。
在中性条件下，探针1的荧光发射位于510 nm处(λex=380 nm)。当溶液从中性变为酸性时，荧光发射峰从510 nm逐渐红移至540 nm(图 3a)。当溶液从中性变为碱性时，荧光发射峰从510 nm红移至545 nm，且荧光发射强度显著增强，溶液在紫外灯下的荧光也更亮(图 3b)，说明探针1在碱性环境中对pH变化更灵敏。
图 3
Fig. 3
 | 图 3 在水/DMF (9/1, V/V)体系中，探针1 (10 μmol/L)(a、b)和探针2(10 μmol/L) (c、d)从中性到酸性和从中性到碱性随pH变化的荧光光谱图，激发波长分别为380 nm (1)和400 nm (2)内图：探针1和2的荧光强度随pH变化的Sigmoidal拟合曲线Fig.3 Change of the fluorescence spectra of 10 μmol/L 1 (a and b) and 10 μmol/L 2 (c and d) in H2O/DMF (9/1, V/V) with pH Inset: sigmoidal fitting of the pH-dependent fluorescence intensity for probe 1 and 2, respectively |
探针2在中性条件下，荧光发射位于540 nm处(λex=400 nm)，溶液在紫外灯下的荧光为橙黄色。当溶液变为酸性时，荧光发射从540 nm明显红移到590 nm且强度减弱(图 3c)，说明探针2在酸性环境中对pH变化更灵敏。在碱性条件下也呈现出与探针1相似的pH荧光响应特性(图 3d)。
2.2.3 探针1和2光学性能的比较表 1对探针1和2的光学性质进行了比较，包括最大吸收波长(λabs)和发射波长(λem)、Stokes位移、摩尔吸光系数(ε)。结果表明，与探针1相比，探针2的最大吸收、发射峰明显向长波方向移动，摩尔吸光系数更大。
表1
Table 1
 表 1 探针1和2的光学性能比较Table 1 Comparison of the photophysical properties of 1 and 2
| 表 1 探针1和2的光学性能比较 Table 1 Comparison of the photophysical properties of 1 and 2 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.2.4 pKa值的测定和pH线性范围根据紫外吸收光谱图和朗伯-比尔定律，计算了探针1和2在不同pH条件下的摩尔吸光系数(ε)。根据ε对pH变化的Sigmoidal拟合曲线(图 1内图)和荧光强度对pH变化的Sigmoidal拟合曲线(图 3内图)分别计算了探针1和2在酸性和碱性条件下的pKa值[9]，如表 2所示。结果表明，由两种方法计算得到的pKa值基本一致。
表2
Table 2
表 2 探针1和2的pKa值和线性范围Table 2 The pKa value and linear range of probes 1 and 2
| 表 2 探针1和2的pKa值和线性范围 Table 2 The pKa value and linear range of probes 1 and 2 | ||||||||||||||||||||||||
根据荧光光谱图 3，探针1和2随pH变化的线性拟合如图 4所示，响应范围如表 2所示。从图 4可知，探针1对碱性条件更敏感，探针2对酸性条件更敏感，与荧光光谱结果一致。
图 4
Fig. 4
 | 图 4 探针1 (a)和2 (b)荧光强度随pH变化的线性关系Fig.4 The good linearity between fluorescence intensity and pH of 1 and 2 |
2.2.5 可逆性研究可逆性是衡量pH荧光探针性能的重要指标。通过快速改变体系pH值，分别考察了探针1和2在酸性和碱性条件下的可逆性。如图 5(a)所示，pH从7变化到2时，探针1在540 nm处的荧光强度升高，pH再增大到7时，荧光强度降低。5次循环改变pH值后，酸性条件下仍然有99.5%的荧光强度成功恢复。此外，探针对不同pH的响应和荧光恢复时间均很短。同时，溶液颜色也随着体系pH值的改变在黄色(酸性)和无色(中性)之间重复变化。图 5(b)、(c)、(d)也表现出类似的结果。这些结果表明探针1和2对pH的响应具有很好的可逆性。
图 5
Fig. 5
 | 图 5 10 μmol/L的1在水/DMF (9/1，V/V)体系中随pH在2~7(a)和7~13(b)之间变化时，540 nm处荧光强度的变化；10 μmol/L的2在PBS/DMF (9/1, V/V)体系中随pH在2~7(c)和7~12 (d)之间变化时，分别在540 nm、570 nm处荧光强度的变化Fig.5 (a) Changes of the fluorescence intensity at 540 nm for 10 μmol/L 1 in PBS/DMF (9/1, V/V) between pH 7 and 2; (b) changes of the fluorescence intensity at 540 nm for 10 μmol/L 1 in PBS/DMF (9/1, V/V) between pH 7 and 13; (c) changes of the fluorescence intensity at 540 nm for 10 μmol/L 2 in PBS/DMF (9/1, V/V) between pH 7 and 2; (d) changes of the fluorescence intensity at 570 nm for 10 μmol/L 2 in PBS/DMF (9/1, V/V) between pH 7 and 12 |
2.3 pH响应机理如Scheme 2所示，探针分子内存在着杂环N原子和酚羟基两个pH敏感点，在酸性条件下杂环N原子发生质子化，在碱性条件下酚羟基去质子化，导致在酸性、碱性溶液中探针分子内推-拉电子效应增强，吸收光谱和荧光光谱明显红移，呈现出酸碱两个pKa值。
Scheme 2
Scheme2
 | Scheme 2 探针1随pH变化的酸碱平衡Scheme2 The acid-base form equilibrium using probe 1 as an example |
3 结论通过简便的方法合成了水溶性好、发光稳定的半花菁染料pH荧光探针1和2。随着溶液从中性变化到酸性或者从中性变化到碱性，两个探针的荧光光谱都逐渐红移，对溶液pH呈比率变化，溶液颜色也出现比色变化。探针1的pKa值为3.81和10.01，pH检测范围为3.72~4.68和9.29~10.88。探针2的pKa值为4.03和10.47，pH检测范围为3.56~4.63和10~10.98。探针对pH的检测是通过吲哚环上未被取代的N原子以及酚羟基的质子化/去质子化效应实现的，都具有较大的Stokes位移和高灵敏度等特点。本研究结果为探针在细胞和组织内的pH检测应用提供了参考。
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