王娟娟, 魏学红
山西大学 大型科学仪器中心, 山西 太原 030006
2018-03-16 收稿, 2018-06-19 录用
2016年中央提升王娟娟人才事业启动经费(304545007)资助
^*通讯作者: 王娟娟, E-mail: wjjuan1983@sxu.edu.cn

摘要: 为了探讨活细胞工作站温度变化对激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）成像的影响，进行了升温和降温条件下铃兰草切片的动态图像采集实验，同时结合Zeiss LSM880的完美聚焦（Definite Focus）功能，采用局部荧光表达动态分析（Mean ROI），分别分析了升温和降温过程中图像的平均明场亮度及荧光强度。结果表明，使用Definite Focus功能前后，活细胞工作站升温和降温均引起了焦点漂移，影响了图像明场亮度和荧光强度，图像质量并未得到改善；活细胞工作站温度达到设定值后还会继续变化，需经过约20 min才能稳定，温度稳定后，焦点漂移现象可减弱，对图像明场亮度及荧光强度的影响也随之减小。因此，在激光扫描共聚焦显微镜成像过程中，一定要维持活细胞工作站温度及整个仪器工作环境温度的稳定，并同时采集明场图像，排除温度变化引起的焦点漂移及荧光强度变化，以便更好地提供准确的样品信号。
关键词: 激光扫描共聚焦显微镜温度焦点漂移明场亮度荧光强度
The Effect of Temperature on Imaging of Confocal Laser Scanning Microscope
WANG Juanjuan, WEI Xuehong
Scientific Instrument Center, Shanxi University, Taiyuan 030006, Shanxi, P. R. China
^*Corresponding author: WANG Juanjuan, E-mail: wjjuan1983@sxu.edu.cn
Abstract: In order to explore the effect of temperature on imaging of confocal laser scanning microscope (CLSM), dynamic image acquisition experiments of Convallaria Maigl?ckchen slice with heating and cooling condition are designed and conducted combined with the definite focus of Zeiss LSM880. The average bright field brightness and fluorescence intensity of image in heating and cooling process were also analyzed by Mean ROI, respectively. The results indicated that before and after use of Definite Focus, the heating and cooling of the live cell workstation all caused the focus-drift, which greatly affected bright field brightness and fluorescence intensity, and the quality of image was not improved. The temperature of live cell workstation continued changed after the temperature reached the set point. It would take about 20 min to stabilize. Once the temperature was stable, the focus-shift was weakened, and the influence of temperature on the brightness and fluorescence intensity of image decreased. Therefore, it is necessary to maintain the stability of the temperature of live cell workstation and the working condition of instrument, acquire the bright field of image in the process of confocal laser scanning microscope imaging, so as to eliminate the focus-drift and fluorescence intensity change caused by the temperature change and provide the accurate sample signals.
Key words: confocal laser scanning microscopes (CLSM)temperaturefocus-driftbright field brightnessfluorescence intensity
激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope，CLSM)作为研究细微结构必备的大型科学仪器，不仅是近代最先进的生物医学分析仪器之一^[1-4]，而且在工业检测领域也有不可替代的应用^[5-7]。它在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，并通过针孔的选择和光电倍增管的收集，利用计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针。通过它不仅可得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，还可对荧光信号进行相对定量测定。与传统光学显微镜相比，其优点在于具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图像等。它可在亚细胞水平上观察诸如Ca²⁺、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化，已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学、纳米生物学等领域中重要的研究工具。
荧光强度的定量在生物医学研究中具有重要作用^{[8, 9]}。多数荧光探针对被标记物的标记均为特异性标记。荧光探针的亮度即荧光强度，可以反映被标记物相对含量的多少。因此利用这一功能可以对单个细胞或细胞群的溶酶体、线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份等进行定量测定，还可监测诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度、快速的免疫荧光测定，这种定量测定可以准确监测抗原表达、细胞结合和杀伤的形态特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的定量信息。由此可见，对进行荧光强度定量的样品测试有非常严格的要求。
由于CLSM是极为精密的光学仪器，其工作环境(如温度、湿度等)对光学系统和供电系统的性能有较大影响，而成像质量依赖于系统的性能^[10]。本人在仪器管理工作中发现CLSM活细胞工作站温度的波动对图像的明场亮度及荧光强度都有一定影响，而这种温度波动多数情况是由焦点漂移引起的。
焦点漂移这一术语经常被用来描述显微镜不能在一个延长的时间内保持选定的焦平面。尽管已有各种技术进步，研究者在利用活细胞工作站动态观察活细胞生物学行为时，随时间推移，成像表现的轴向波动仍然是一个重大问题^{[11, 12]}。温度变化是焦点漂移最常见的原因，由于各种物质材料的热膨胀系数不同，所以温度变化和温度不均会引起仪器各部分的变形和应力，导致几何光学尺寸的变化和成像质量的变化^[13]。然而，很多研究者在用CLSM动态观察细胞荧光图像时，都未考虑温度波动对焦平面的影响，从而导致对图像荧光信号变化的错误判断，未能反映探针在细胞内的真实变化。
本文从活细胞工作站温度波动对铃兰草横切样片的平均明场亮度及荧光强度的影响方面入手，并结合Zeiss LSM880的完美聚焦(Definite Focus)功能，分别系统地半定量分析了CLSM活细胞工作站升温和降温对图像成像效果的影响，这一结果对研究人员正确使用CLSM以保证仪器的准确性有一定参考意义。
1 实验部分1.1 材料与仪器铃兰草(Convallaria Maigl?ckchen)横切样片，蓝色、绿色和红色荧光均为自发荧光。
LSM880激光扫描共聚焦显微镜(德国Zeiss公司)。
1.2 实验方法1.2.1 Zeiss LSM 880图像采集基本参数设置物镜：20倍物镜(NA为0.8);蓝色(DAPI)、绿色(EGFP)和红色(Rhodamine)荧光激发光波长分别为405 nm、488 nm、561 nm；激光强度分别为0.2 mW、0.005 mW、0.48 mW；扫描针孔：1 Au；Gain(Master)分别为650、600、600；Digital gain：1；Digital offset：0；扫描次数：2。
使用透射光光电倍增管(Transmitted photomultiplier tube, TPMP)采集明场强度。使用Definite Focus功能采集图像时，Definite Focus Period：3 s。
1.2.2 升温过程图像采集仪器工作环境温度为22±1 ℃，在升温实验中，将CLSM的活细胞工作站温度设定为37 ℃，采用时间序列扫描，每隔1 min采集一次图像，采集41次，温度从24.3 ℃升至37.0 ℃；使用Definite Focus功能时，将CLSM的活细胞工作站温度设定为30 ℃，采用时间序列扫描，每隔1 min采集一次图像，采集26次，温度从26.4 ℃升至30.0 ℃。
1.2.3 降温过程图像采集仪器工作环境温度为22±1 ℃，在降温实验中，将CLSM的活细胞工作站温度设定为32 ℃，同样采用时间序列扫描，每隔1 min采集一次图像，采集41次，温度从37.0 ℃降至32.0 ℃；使用Definite Focus功能时，将CLSM的活细胞工作站温度设定为29 ℃，采用时间序列扫描，每隔1 min采集一次图像，采集26次，温度从30.1 ℃降至29.5 ℃。
1.2.4 图像中明场亮度及荧光强度的分析扫描参数固定不变，通过Mean ROI功能分析升温和降温对图像中3个矩形框(如图 1所示)中的平均明场亮度及荧光强度的影响。数据的统计分析采用SPSS 16.0 for Windows(SPSS Inc.，USA)软件进行方差分析，用Tukey法进行多重比较，P < 0.05时差异具有显著性。
图 1
Fig. 1

图 1 Mean ROI视图Fig.1 The Mean ROI of 3 rectangles

2 结果与分析在活细胞的时间推移成像技术中，温度变化已成为引起焦点漂移的主要因素之一，因此研究显微镜的活细胞工作站温度对系统成像性能的影响就尤为重要。
2.1 升温对成像效果的影响未使用Definite Focus时，升温对图像中3个矩形框(图 1)中的平均明场亮度及荧光强度的影响结果如图 2所示。从图中可看出，在26 min时活细胞工作站温度可达到37.0 ℃，到31 min时逐渐升至37.3 ℃，37 min时降至37.0 ℃且维持稳定。通过Mean ROI分析3个矩形框中的平均明场亮度及荧光强度，由图 2可知，活细胞工作站温度对明场亮度和荧光强度均有一定影响，在0~40 min内，随着活细胞工作站温度的升高，明场亮度逐渐降低，自37 min后，随着温度的稳定而逐渐稳定。Rhodamine荧光强度在整个升温过程中变化较小，EGFP和DAPI的荧光强度变化则较大，温度稳定后，二者也有小幅度的波动。升温过程中的平均明场亮度及3种荧光强度和0 min时相比均无显著差异(P>0.05)。
图 2
Fig. 2

图 2 升温过程中图像矩形框中的平均明场亮度及荧光强度的动态观察Fig.2 The average bright field brightness and fluorescence intensity of the rectangles in heating process

从图 3可知，升温过程中，焦平面随着温度的升高(24.3~37.0 ℃)而改变(0~26 min内)，26 min后，焦平面还会随着温度的较小波动略微改变，整个升温过程的离焦量是0.0038 μm。
图 3
Fig. 3

图 3 升温过程中的焦点漂移Fig.3 The focus-drift in heating process

由图 4可知，使用Definite Focus功能后，升温对图 1中3个矩形框中的平均明场亮度及荧光强度的影响并未减弱。活细胞工作站温度在9 min时升到30.2 ℃，23 min时降至30.0 ℃且维持较稳定(图 4)。在0~25 min内，随着活细胞工作站温度的升高，明场亮度逐渐降低；17 min后，Rhodamine荧光强度和0 min时相比差异具有显著性(P < 0.05)，EGFP和DAPI的荧光强度分别从14 min和20 min后也显著低于0 min时(P < 0.05)。
图 4
Fig. 4

图 4 使用Definite Focus后，升温过程中图像矩形框中的平均明场亮度及荧光强度的动态观察Fig.4 After Definite Focus is in use, the average bright field brightness and fluorescence intensity of the rectangles in heating process

从图 5可以看出，使用Definite Focus后，焦点漂移的现象并没有得到改善，整个升温过程的离焦量是0.0057 μm。升温过程中，焦平面随着温度的升高(26.4~30.2 ℃)而改变(0~9 min内)，9 min后，焦点漂移逐渐减小。
图 5
Fig. 5

图 5 使用Definite Focus后，升温过程中的焦点漂移Fig.5 The focus-drift in heating process after Definite Focus is in use

2.2 降温对成像效果的影响未使用Definite Focus时，降温对图 1中3个矩形框中的平均明场亮度及荧光强度的影响结果见图 6，由图 6可知，活细胞工作站温度在25 min时可降到32.0 ℃，然而在34 min后才能维持于32.0 ℃左右。活细胞工作站温度对明场亮度无影响，对3种荧光强度均有显著影响，在0~40 min内，随着活细胞工作站温度的降低，Rhodamine和EGFP荧光强度均从11 min后显著低于0 min时(P < 0.05)；DAPI的荧光强度则从25 min后显著低于0 min时(P < 0.05)。
图 6
Fig. 6

图 6 降温过程中图像矩形框中的平均明场亮度及荧光强度的动态观察Fig.6 The average bright field brightness and fluorescence intensity of the rectangles in cooling process

由图 7可知，温度从37.0 ℃降至32 ℃时，焦点漂移较大，25 min后，温度较稳定，焦点漂移也减小，整个降温过程的离焦量是0.0122 μm。
图 7
Fig. 7

图 7 降温过程中的焦点漂移Fig.7 The focus-drift in cooling process

如图 8所示，使用Definite Focus功能后，设置活细胞工作站温度变化范围为1.1 ℃，Rhodamine、EGFP和DAPI的荧光强度均呈逐渐减小趋势(P>0.05)，明场亮度没有明显变化。
图 8
Fig. 8

图 8 使用Definite Focus后，降温过程中图像矩形框中的平均明场亮度及荧光强度的动态观察Fig.8 The average bright field brightness and fluorescence intensity of the rectangles in cooling process after Definite Focus is in use

如图 9所示，降温过程使用Definite Focus后，焦点漂移的现象同样存在，即使温度波动范围在1 ℃之内，也有较大的焦点漂移，整个降温过程的离焦量是0.0030 μm。
图 9
Fig. 9

图 9 使用Definite Focus后，降温过程中的焦点漂移Fig.9 The focus-drift in cooling process after Definite Focus is in use

综上所述，使用Definite Focus功能前后，活细胞工作站温度变化均引起了焦点漂移，从而导致图像荧光强度发生变化，但其影响无规律性，变化趋势有所不同。升温时明场亮度逐渐降低，降温时则变化不明显。温度稳定后，焦点漂移现象可减弱，对图像明场亮度及荧光强度的影响也随之减小(P>0.05)。然而，即使温度变化范围为1 ℃，焦平面也会改变，明场亮度和荧光强度都会有一定程度的变化，这对我们判断细胞生物学行为的变化会产生较大的影响。由此可见，保持恒定的活细胞工作站温度，可以提高图像成像质量，获得细胞行为的真实情况。
3 讨论与结论激光扫描共聚焦显微镜是一种极为精密的光学仪器，是检测生物荧光信号的最新技术手段，不仅广泛用于荧光定性、定量测量，还可用于活细胞动态荧光监测、组织细胞断层扫描、三维图象重建、共聚焦图象分析、荧光光漂白恢复等^[14-18]。目前，CLSM在国内普及率日益增高，但很多研究者在用其观察荧光图像时，只注重荧光染色过程中探针、细胞、孵育条件及拍照参数等对荧光强度的影响，而忽视了CLSM对其工作温度的要求，忽略了活细胞工作站温度对焦平面和荧光强度的影响，从而导致对图像荧光信号变化的错误判断，未能反映探针在细胞内的真实变化，影响我们对细胞生物学行为的准确判断。
本实验中应用CLSM分别采集了活细胞工作站升温和降温过程中的明场和荧光图像，并使用Definite Focus功能进行了焦点漂移校正，结果表明：使用Definite Focus功能前后，活细胞工作站升温和降温均引起了焦点漂移，焦点漂移并未得到改善，温度稳定后，焦点漂移现象可减弱。未使用Definite Focus时，在0~40 min内，升温过程(24.3~37.0 ℃)的离焦量是0.0038 μm，降温过程(37.0~32.0 ℃)的离焦量是0.0122 μm。使用Definite Focus后，在0~25 min内，升温过程(26.4~30.0 ℃)的离焦量是0.0057 μm，降温过程(30.1~29.0 ℃)的离焦量是0.0030 μm。
此外，实验结果显示，焦点漂移导致了图像荧光强度和明场亮度不同程度的变化，升温时明场亮度逐渐降低，降温时则变化不明显，这可能还与光学元件的性能有关。未使用Definite Focus时，活细胞工作站温度在26 min内从24.3 ℃升至37.0 ℃，图像明场亮度、EGFP和DAPI的荧光强度均发生较大变化，温度稳定(37 min)后，其对图像明场亮度及荧光强度的影响也随之减小；25 min时，活细胞工作站温度从37.0 ℃降至32.0 ℃，Rhodamine、EGFP和DAPI的荧光强度均发生了显著变化，温度稳定(34 min)后，3种荧光强度也趋于稳定。使用Definite Focus后，活细胞工作站温度在9 min内从26.4 ℃升至30.2 ℃，图像明场亮度和3种荧光强度发生了显著变化，温度稳定(23 min)后，它们的变化也随之减小；在0~25 min内，即使活细胞工作站降温1.1 ℃，对3种荧光强度也有影响。同时，研究发现，活细胞工作站温度达到设定值后还会继续变化，需要经过约20 min才能稳定。
因此，要通过CLSM采集到优质图像，如实反应荧光信号的变化，除了要考虑荧光染色中探针、细胞、孵育条件及拍照参数等的优化外，还必须要重视活细胞工作站温度的稳定，重视整个仪器工作环境温度的稳定(22±1 ℃)。不论活细胞工作站温度需要室温还是37℃，整个图像采集过程最好进行温度监控，并同时采集明场图像，排除温度变化引起的焦点漂移及荧光强度变化，以便更好地提供准确的样品信号。

参考文献

[1]	杨子贤, 王洪星, 易小平. 激光扫描共聚焦显微镜在生物科学研究中的应用[J]. 热带生物学报, 2013, 4(1): 99–104. Yang Z X, Wang H X, Yi X P. Future prospects of laser scanning confocal microscope in bioscience[J]. Journal of Tropical Biology, 2013, 4(1): 99–104.DOI:10.3969/j.issn.1674-7054.2013.01.017
[2]	Pawley J B. Handbook of Biological Confocal Microscopy[M]. 3rd ed. Berlin: Springer, 2006: 1-16.
[3]	Amos W B, White J G. How the confocal laser scanning microscope entered biological research[J]. Biology of the Cell, 2003, 95(6): 335–342.DOI:10.1016/S0248-4900(03)00078-9
[4]	Hovis D B, Heuer A H. The use of laser scanning confocal microscopy (LSCM) in materials science[J]. Journal of Microscopy, 2010, 240(3): 173–180.DOI:10.1111/jmi.2010.240.issue-3
[5]	邱丽荣, 李佳, 赵维谦, 杨佳苗. 激光共焦透镜曲率半径测量系统[J]. 光学精密工程, 2013, 21(2): 246–252. Qiu L R, Li J, Zhao W Q, Yang J M. Laser confocal measurement system for curvature radii of lenses[J]. Optics and Precision Engineering, 2013, 21(2): 246–252.
[6]	郭俊杰, 邱丽荣, 王允, 孟婕, 高党忠. 用于惯性约束聚变靶丸测量的激光差动共焦传感器[J]. 光学精密工程, 2013, 21(3): 644–651. Guo J J, Qiu L R, Wang Y, Meng J, Gao D Z. Laser diffe-rential cofocal sensor for ICF capsule measurement[J]. Optics and Precision Engineering, 2013, 21(3): 644–651.
[7]	张运海, 杨皓旻, 孔晨晖. 激光扫描共聚焦光谱成像系统[J]. 光学精密工程, 2014, 22(6): 1446–1453. Zhang Y H, Yang H M, Kong C H. Spectral imaging system on laser scanning confocal microscopy[J]. Optics and Precision Engineering, 2014, 22(6): 1446–1453.
[8]	陈跃, 杨建茹, 赵宝红, 冯海兰. 激光扫描共聚焦显微镜中荧光强度的测定条件研究[J]. 中国医学装备, 2005, 2(3): 10–12. Chen Y, Yang J R, Zhao B H, Feng H L. The research on determine condition of fluorescence intensity in confocal laser scanning microscopy[J]. China Medical Equipment, 2005, 2(3): 10–12.DOI:10.3969/j.issn.1672-8270.2005.03.003
[9]	Boi S, Fascio U. A method of quantitative measurement of fluorescence intensity by confocal laser scanning microscopy[J]. Journal of Computer-Assisted Microscopy, 1998, 10(4): 163–166.DOI:10.1023/A:1023434120321
[10]	王玥. LSM 710/780 brief manual[R]. Zeiss, 2015: 84. Wang Y. LSM 710/780 brief manual[R]. Zeiss, 2015: 84.
[11]	杜娟, 孙剑会, 李力, 杨策, 曾灵, 王海燕, 蒋建新. 活细胞工作站使用中的视野漂移与矫正[J]. 第三军医大学学报, 2015, 37(18): 1896–1900. Du J, Sun J H, Li L, Yang C, Zeng L, Wang H Y, Jiang J X. Focus-drift correction in live cell imaging system[J]. Journal of Third Military Medical University, 2015, 37(18): 1896–1900.
[12]	Kreft M, Stenovec M, Zorec R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging[J]. Annals New York Academy of Sciences, 2005, 1048(1): 321–330.DOI:10.1196/annals.1342.029
[13]	姚正秋. 温度场对光学仪器的影响及其减小方法[J]. 光学工程, 1989, 79(1): 13–19. Yao Z Q. Thermal effects on optical instruments and its elimination[J]. Optical Engineering, 1989, 79(1): 13–19.
[14]	Yue Y K, Huo F J, Ning P, Zhang Y B, Chao J B, Meng X M, Yin C X. Dual-site fluorescent probe for visualizing the metabolism of Cys in living cells[J]. Journal of the American Chemical Society, 2017, 139(8): 3181–3185.DOI:10.1021/jacs.6b12845
[15]	王春苗, 侯华新, 黎丹戎, 陈云龙, 莫春燕, 李竟, 莫媛媛. 激光扫描共聚焦显微镜观测大黄素β环糊精包合物在鼻咽癌细胞的跨膜转运及分布[J]. 中国激光, 2014, 41(5): 0504001. Wang C M, Hou H X, Li D R, Chen Y L, Mo C Y, Li J, Mo Y Y. Observation of emodin-β-CD inclusion complex's transmembrane transport in nasopharyngeal carcinoma cells and its distribution by the laser scanning confocal microscpoe[J]. Chinese Journal of Lasers, 2014, 41(5): 0504001.
[16]	赵亚, 马先锋, 肖翠, 刘利平, 李娜, 邓子牛. 利用激光共聚焦扫描显微镜对溃疡病菌侵染柑橘叶片的实时观察[J]. 激光生物学报, 2017, 26(2): 143–150. Zhao Y, Ma X F, Xiao C, Liu L P, Li N, Deng Z N. Real time observation of the infection of Xanthomonas citri subsp. citri in citrus leaf by using confocal laser scanning microscopy[J]. Acta Laser Biology Sinica, 2017, 26(2): 143–150.DOI:10.3969/j.issn.1007-7146.2017.02.009
[17]	吴伟全, 王思捷, 李元歌, 何香红, 王永存, 吴平. 激光扫描共聚焦显微镜及透射电镜观察肺癌A549细胞亚细胞结构溶酶体的对比分析[J]. 临床医学工程, 2013, 20(6): 666–668. Wu W Q, Wang S J, Li Y G, He X H, Wang Y C, Wu P. Value of laser scanning confocal microscopy in observing the subcellular structure-lysosome of lung cancer A549 cells:compared with transmission electron microscopy[J]. Clinical Medical and Engineering, 2013, 20(6): 666–668.DOI:10.3969/j.issn.1674-4659.2013.06.0666
[18]	冯倩倩, 王文娟, 李海冬, 潘勋. 利用激光扫描共聚焦显微镜研究叶绿体自发荧光[J]. 清华大学学报(自然科学版), 2017, 57(6): 651–654, 660. Feng Q Q, Wang W J, Li H D, Pan X. Autofluorescence of chloroplasts measured by a laser scanning confocal microscope[J]. Journal of Tsinghua University (Natural Sciences Edition), 2017, 57(6): 651–654, 660.