, 钱庆2, 章强2, 白鹏利2, 潘宇骏2, 段鹏21. 上海大学 通信与信息工程学院, 上海 200444;
2. 中国科学院 苏州生物医学工程技术研究所, 江苏 苏州 215163
2018-01-23 收稿, 2018-03-20 录用
国家重点研发计划（2016YFC0903502）、中国科学院科技服务网络计划（KFJ-STS-SCYD-007）、吉林省与中国科学院科技合作高技术产业化专项资金项目（2018SYHZ0007）、中国科学院仪器设备研制项目（YJKYYQ20170067）资助
*通讯作者: 程文播, E-mail: chengwb@sibet.ac.cn
摘要: 针对目前基于手机图像比色算法存在的色差计算不可靠、计算量大等问题，本文提出一种符合人眼视觉的比色分析方法。该方法是将原始的非线性RGB颜色空间的色彩信息转换到符合人眼视觉的CIELab颜色空间，在此空间计算测试颜色和参考颜色之间的色差，可以在参考颜色中准确找到与测试颜色最相近的颜色，并在此基础上创新地提出"垂点法"，对颜色的相似程度信息进一步定量，实现了对尿液试纸条的定量分析。实验通过手机拍照获取密闭实验箱中尿液试纸条的图像，定量分析人工尿液中的pH（4.5~9.5）、葡萄糖含量（0~60 mmol/L）和蛋白质含量（0~4 g/L），并使用目测分析法作为对照。结果表明，本文所提出的比色算法不仅准确可靠、重复性好，而且计算量也比较小，非常适合应用在基于手机图像的尿液试纸比色分析中。
关键词: CIELab颜色空间比色分析法尿液试纸条智能手机
Novel Colorimetric Method for Urine Test Strips Based on Smartphone Image
YANG Renbing1, CHENG Wenbo2
, QIAN Qing2, ZHANG Qiang2, BAI Pengli2, PAN Yujun2, DUAN Peng21. School of Communication & Information Engineering, Shanghai University, Shanghai 200444, P. R. China;
2. Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology, Chinese Academy of Sciences, Suzhou 215163, Jiangsu, P. R. China
*Corresponding author: CHENG Wenbo, E-mail: chengwb@sibet.ac.cn
Abstract: This paper proposes a new colorimetric analysis algorithm based on smartphone images. Conforming to human eye vision, it has the advantages of minor calculation and best calculating stability. This method converts the color information of the original nonlinear RGB color space to the CIELab color space that conforms to the human vision, therefore the reference color closest to the test color can be accurately picked. Meantime, "vertical point method" is proposed innovatively to further quantify the similarity of color information and realize the quantitative analysis of urine test strips. As for the experiment, the pH (4.59.5), glucose content (060 mmol/L) and protein content (04 g/L) in artificial urine were quantitatively analyzed by taking photos of urine test strips in an ambient light-isolated box, and visual colorimetry was used as a control. The results show that the proposed colorimetric algorithm is not only accurate, reliable, reproducible and computable, but also suitable for application in urine test strip colorimetric analysis based on mobile phone images.
Key words: CIELab color spacecolorimetric analysisurine test stripssmart phone
基于手机图像的尿液试纸条比色分析技术由于具有操作简单方便、成本低、数据易于传输等诸多的优点，弥补了使用传统的尿液分析仪以及目测法进行比色分析的不足，并且满足了当下人们对即时检测的需要，因而近年来涌现出很多相关的比色算法研究。即使如此，目前的研究工作仍然不够完善。
Smith等[1]简单地用RGB颜色空间的夹角大小来衡量颜色之间的相似程度，但由于RGB颜色空间不均匀，这种色差大小没有可比性。Shen等[2]、Hong等[3]分别把颜色信息转换至CIE 1931、HSV颜色空间计算色差，但是都仅仅考虑到相应颜色空间内的单一分量或者两分量的信息，事实上尿液试纸条的颜色变化过程中三个分量都会受到影响，只考虑局部分量会造成颜色信息的丢失，影响比色分析的结果。此外，Karisen等[4]和Anthimopoulos等[5]都从机器学习的方法考虑，训练出不同的比色分析模型，虽然准确度比较高，但是都只能准确地实现半定量分析，而且机器学习庞大的计算量也不适合在手机平台上应用。
为了优化现有的尿液试纸条比色算法，以准确半定量为前提，提高定量分析的准确性，同时保证算法计算量不会成为手机的负担，本文使用颜色空间转换的方法，先把原始图像RGB色彩空间转换成CIELab色彩空间进行分析，在该均匀的色彩空间中计算测试颜色和参考颜色之间的色差，从而在参考颜色中准确找到与测试颜色最相近的颜色。在此基础上本文还创新地提出“垂点法”, 对颜色的相似程度信息进一步定量，实现了对尿液试纸条的定量分析。为了保证比色分析过程中光照一致性，本文使用轻便的泡沫材料设计了一个密闭的实验箱，可以忽略外界环境光对比色分析的影响。
1 尿液试纸的比色方法尿液试纸条上均匀排列着多个试剂块，用于分析尿液中不同成分的含量，其化学原理是在每个试剂块里都有固化好的化学试剂，当在试剂块上滴加待测尿液后，不同试剂块的化学试剂会与待测尿液发生不同的显色反应，每个试剂块与尿样反应后的颜色深浅就代表该成分含量的高低[6]。图 1是本文所使用的尿液试纸条的参考比色卡，该色卡的作用是将各个试剂块的颜色与浓度的关系一一对应，图中共有酸碱度、亚硝酸盐、葡萄糖、维生素C、尿比重、隐血、蛋白质、胆红素、尿胆原、酮体、白细胞等11个试剂块[7]，另有一个空白块，其主要作用是在尿液分析仪检测时，可补偿尿液自身颜色及试剂块颜色分布不均匀带来的误差，提高仪器测试的准确性。
图 1
Fig. 1
 | 图 1 优利特尿11项的参考比色卡Fig.1 The reference chart of URIT 11A test strips |
如何确定尿液试纸条上试剂块的颜色在参考比色卡中对应的颜色位置，并有效衡量与对应颜色的相似程度，以提高分析结果的精确范围、实现定量分析，这是比色分析重要的研究内容。基于手机图像的比色方法是从手机拍摄的图片中提取出试剂块的颜色，然后仅依靠比色算法来分析出结果，由此可知其中比色算法的准确可靠性至关重要。而本文提出的这种新型比色算法能够满足尿液试纸条比色分析的准确性和可靠性，该算法的实现包括颜色空间转换和“垂点法”定量分析两部分。
1.1 颜色空间转换比色算法的核心目的是衡量两种颜色的相似程度，也就是计算色差大小。在图像处理过程中，一般用颜色空间中两个颜色点之间的距离描述色差[8]。事实上，颜色空间种类有很多，RGB颜色空间是目前应用最为广泛的一种颜色空间，本文需要获取的原始图像就是用RGB颜色空间表示。但是不能直接使用RGB空间的数据来计算两种颜色的色差，这主要是因为RGB是非均匀的颜色空间，不符合人眼描述和解释颜色的方式，直接计算得到的两种颜色在RGB空间的距离与人眼视觉色差是非线性关系，因而不能真实反映两种颜色之间的差异度。如图 2上方是RGB颜色空间的一组光谱，从左到右图中的色彩在RGB颜色空间是按线性逐渐变化的，但人眼看上去其颜色的变化却是不均匀的，尤其是前后两端的颜色变化很慢，有些部分让人眼感觉都是同一种颜色。由于RGB颜色空间具有不均匀性，因此需要选择另外一种与人眼视觉一致的颜色空间，用来评价图像中两种颜色之间的色差。
图 2
Fig. 2
 | 图 2 RGB和Lab的光谱Fig.2 The chromatography in RGB color space (a) and Lab color space (b) |
为了弥补非均匀颜色空间的缺陷，1976年国际照明委员会(Commission International del’Eclairage, CIE)推出了均匀颜色空间CIELab，这是目前最符合人眼视觉的颜色空间[9]。CIELab色彩空间是由一个亮度分量L(lightness)以及两个色度分量a与b来表示颜色的。模型如图 3所示，其中L取值0~100，表示从黑到白的变化，色度a和b的取值都是-128~127，前者表示从深绿(-128)到亮粉红(+127)的变化，后者表示从亮蓝色(-128)到黄色(+127)的变化。图 2下方是使用CIELab颜色空间做成的光谱，与RGB颜色空间相比，光谱上的颜色只要距离相同，给人眼的颜色刺激感受就趋于一致，这是均匀颜色空间所具备的特点。
图 3
Fig. 3
 | 图 3 Lab颜色空间Fig.3 The coordinate system of Lab color space |
综上所述，本文选取色彩均匀的CIELab作为颜色空间，涉及到的所有色差计算都是基于该空间进行的。由于原始图像是RGB颜色空间，因此接下来需要有一个颜色空间转换过程。事实上，RGB无法直接转换成Lab，需要先转换成XYZ再转换成Lab，即：RGB→XYZ→Lab。这里XYZ表示的是3个假想的原色，这是CIE在1931年首次尝试建立均匀的颜色空间而推出的[10]，后来的CIELab也是在此基础上改进而来，详细转换过程如下。
1.1.1 RGB转XYZ假设获得的原始图像数据为(R，G，B)，由于一般手机图像都是经过伽马校正的非线性sRGB，因此首先需要反伽马校正，将这个RGB值线性化，然后才能向XYZ转换：
 | (1) |
 | (2) |
 | (3) |
1.1.2 XYZ转Lab
 | (4) |
 | (5) |
1.2 “垂点法”定量分析本文使用CIELab颜色空间中两种颜色的欧式距离作为色差大小，假设试剂块上的颜色在CIELab颜色空间上表示为(L1*，a1*, b1*)，参考比色卡上的颜色为(L2*，a2*, b2*)，则公式6的结果就是这两种颜色的色差大小，该值用来衡量试剂块的颜色与参考比色卡颜色相似程度。色差公式虽然能确定与试剂块颜色对应的参考颜色，但还是不能实现对尿液试纸条结果进行准确定量，这一步需要依靠本文提出的“垂点法”来完成。
 | (6) |
图 4
Fig. 4
 | 图 4 定量分析的过程Fig.4 The flowchart of quantitative analysis |
随后，计算出颜色A和颜色B之间的色差大小，把计算到的颜色T、A、B三者之间的色差大小作为三角形的三条边，共同构成ΔTAB。我们把T点在AB直线上的垂点o定义为试剂块颜色在参考A、B之间的位置，其实从这三种颜色在CIELab颜色空间内的三维分布来看，该垂点o表示就是试剂块颜色在两种参考颜色方向上的垂直投影点。根据以上关系容易推导得到Ao的长度，见公式(7)。最后我们用Ao与AB的比值来定量得到试剂块颜色所代表的浓度ctest，见公式(8)。
 | (7) |
 | (8) |
2 实验部分2.1 实验试剂和材料本实验所使用的细菌学蛋白胨(LP0037)、酵母提取物购于上海联硕生物科技有限公司；D-(+)-葡萄糖(99.5%)、柠檬酸(99.5%)、碳酸氢钠(99.5%)、尿素、尿酸(99.9%)、肌酸酐(98%)、氯化钙(93%)、氯化钠(99.5%)、硫酸亚铁(99%)、七水硫酸镁(98%)、芒硝(99.0%)、磷酸二氢钾(98%)、磷酸氢二钾(99.9%)、氢氧化钾(90%)、牛血清白蛋白(96%)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乳酸钠溶液(~60%, 质量分数)购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
本文使用确定葡萄糖、蛋白质含量和确定pH的梯度溶液进行测试，为保证测试液的理化性质与尿液接近，本文根据文献[11]描述的方法调配人工尿液作为这些测试成分的溶剂，人工尿液具体组成如表 1所示。每种pH测试液都是以10 mL的人工尿液作为底液，加入不同比例的1 mol/L的盐酸(HCl)和1 mol/L的氢氧化钠(NaOH)来调整pH值，同时利用pH计准确测量，最终获得pH从4.5~9.5等11种不同的测试液。另外，调配葡萄糖溶液时，先称量10.8 g葡萄糖溶解到100 mL的人工尿液中，获得高浓度的60 mmol/L的葡萄糖溶液，然后通过稀释得到低浓度的溶液，最终获得浓度为0~60 mmol/L的13种梯度溶液。同样，蛋白质溶液使用牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)作为溶质，调配得到浓度为0~4.0 g/L的9种梯度溶液。
表1
Table 1
 表 1 人工尿液的组成Table 1 Composition of artificial urine
| 表 1 人工尿液的组成 Table 1 Composition of artificial urine |
本文使用努比亚Z9 mini手机拍摄与测试液反应规定时间后的优利特URIT-11A尿液试纸条，获取到的实验图片则利用MATLAB R2013b软件进行分析。努比亚Z9 mini手机具备1600万像素高清摄像头并搭载八核CPU，足以保证可以获取高清的实验图片，而且价格也较便宜。此外，优利特URIT-11A尿液试纸条质量和显色稳定性优越，在市场中有很高的认可度，已被国内大多数医院和研究机构应用在尿液成分分析中，因此在本实验中可以忽略试纸条显色性能的批间差异对实验造成的影响。此外，本文的比色算法均在MATLAB软件上得以实现，我们设计了一个人机交互界面，便于实验图片处理和分析，未来计划将此算法整合到手机APP内以完善整个分析过程。最后值得注意的是，环境温度以及外界环境光会对实验造成干扰，因此本文实验全都在20 ℃的室内环境进行，并且为了保证实验过程中每次拍照环境光照一致，我们使用泡沫材料设计了一个大小为23 cm×14 cm×6 cm的实验箱，如图 5所示，实验箱的四周封闭，外部光线无法透射进去，箱内放置一个6组LED灯构成的白色光源(色温在6000 K)，试纸条通过外部小孔插入到实验箱内，这样可以保证每次拍摄时试纸条的环境光照始终不变。
图 5
Fig. 5
 | 图 5 实验箱Fig.5 Experiment box |
2.2 实验过程本文的实验目的是通过对pH、葡萄糖和蛋白质3种不同成分的梯度溶液进行测试分析，验证本文所提出的比色算法在对尿液试纸条定量分析方面的准确程度。此外，本实验还设计使用目测法分析的结果作为对照组，先分析出待测溶液的半定量结果，再与比色算法分析的结果进行对比，充分保证最终实验分析结果的可靠性。整个实验过程包括获取参考色块、样本准备、加样、目测对照、手机拍照、算法分析等6个步骤(图 6)，具体过程如下：
图 6
Fig. 6
 | 图 6 整体实验过程Fig.6 The entire experimental process |
获取参考色块：实验开始前需要获取参考比色卡上所有色块的颜色信息，方法是通过手机拍摄放在实验箱中的标准参考比色卡，并把每个色块的RGB值转换成Lab值，依次存储在MATLAB软件的参考颜色库中，以便之后计算测试色块和参考颜色之间的色差。
测试样本准备：根据前述方法调配好pH、葡萄糖和蛋白质的梯度测试溶液，从中各取5 mL用于测试。注意分类和标记防止混淆。
加样：使用移液枪在尿液试纸条相应的测试试剂块上滴加20 μL测试液，该体积的测试样本正好能够被试剂块均匀吸收，如果存在些许残留液，则使用吸水纸去除。
目测对照：本文实验邀请到3名实验人员(2男1女，平均年龄25岁，视力正常)对尿液试纸条进行目测分析。在加样完成后用秒表倒计时，等待规定时间后3名实验人员同时观察试剂块上的显色，并在参考比色卡上找出最相近的颜色，从而通过目测得出半定量结果并记录。本实验对每种梯度溶液都重复加样并目测3次，3次完成后选取频次最多的结果视为该梯度溶液的对照结果。另外根据试纸说明书，每种试剂块的显色时间不一样，pH、葡萄糖和蛋白质的反应时间分别是30 s、40 s和40 s。
手机拍照：使用相应梯度溶液重复进行3次比色算法测试实验。与上一步类似的过程，首先也在完成加样后立即用秒表倒计时，然后将尿液试纸条从小孔中插入到实验箱内，等待同样时间后用手机对试纸条进行拍照。由于手机的拍照方式会直接影响到获取图像的颜色效果，因此本文对手机设置统一的拍照方式，即焦距4 mm、ISO-100、曝光时间1/130 s、白平衡、无闪光。
算法分析：在MATLAB软件上构建完成比色算法后，对获取的所有手机图像进行颜色提取，得出定量分析结果，并记录保存每次的结果。
2.3 结果与分析pH(4.5~9.5)、葡萄糖(0~60 mmol/L)和蛋白质(0~4.0 g/L)的实验结果如图 7所示，每种梯度溶液的3次测试分析结果取均值后在图中用黑色圆点表示，相应的误差线也标注在对应的位置点上，对照组结果则用浅蓝色的柱状图表示。首先，从图 7可以看出，所有测试结果的拟合曲线在整体上均与标准线y=x相吻合，其中尿糖溶液的线性度以及相关系数都达到0.98，截距误差也仅为1.25。其次，重复实验的标准差处在较低水平，表现出良好的可重复性。同时，目测对照组的结果与真实值也十分接近，但由于该方法是基于半定量分析的原理，与本文提出的比色算法相比，有些结果仍然偏差较大。通过以上分析可知，相比于传统的目测法或者尿液分析仪这些半定量分析方法，本文所提出的算法可以很好地加强尿液试纸条分析结果的精确度。
图 7
Fig. 7
 | 图 7 比色算法测试的结果 a. pH测试液，线性度: 0.96，相关性：0.99，b.尿糖测试液，线性度：0.98，相关性：0.98，c.蛋白质测试液，线性度：0.88，相关性：0.98，c中小图为除去3.5 g/L和4.0 g/L两个数据后的蛋白质测试结果拟合曲线，线性度：0.95，相关性：0.99 Fig.7 Results of colorimetric algorithm test a. pH solution, linearity: 0.96, correlation: 0.99, b. urine sugar solution, linearity: 0.98, correlation: 0.98, c. protein solution, linearity: 0.88, correlation: 0.98, the graph at bottom-right of (c) is protein solution without 3.5 g/L and 4.0 g/L, linearity: 0.95, correlation: 0.99 |
实验中还发现，对于超出参考比色卡范围的浓度，比色算法分析的结果误差会比参考范围内浓度的大，使拟合曲线与真实值的线性吻合度降低。最明显的是蛋白质溶液，该拟合曲线的线性度是3种成分中最低的，但是去除浓度为3.5 g/L和4.0 g/L这两个数据之后，对其它分析结果进行线性拟合，如图 7中蛋白质结果右下角的小图所示，拟合曲线的线性度由原本的0.88上升到0.95，线性吻合度大大提高，因此使用该套算法进行实验时，应该尽量选择参考颜色卡范围内浓度的溶液进行测试，这样获得的拟合曲线能够更接近真实值。
3 结论基于手机图像的尿液试纸比色分析有望替代传统的尿液分析仪，使人们可以方便地进行尿液分析，了解和掌握自己的病情，而且可以帮助医疗条件差的地区享受与医疗发达地区同等质量的医疗服务。本文针对基于手机图像的尿液试纸比色分析，提出了一套全新的基于人眼视觉的手机图像比色算法，实验证明该方法对尿液试纸条结果的比色分析具有很高的准确度及可重复性，同时也延展了比色分析精确度。虽然本文实验仅对人工尿液中pH、葡萄糖以及蛋白质这3种成分进行了分析，但是可检测其它几种成分的尿液试纸条以及如胶体金等其它类型的试纸条，其内在比色原理是一致的，因而推测该方法也能适用。可以预见，该方法在基于手机摄像头的尿液分析方面具有广阔的应用前景，为实现这一目标，接下来还需开展一系列研究以进一步完善。首先是将本文所提出的算法嵌入到手机应用程序内，真正实现仅仅依靠手机来进行比色分析；其次，本文的实验图像是在均一的环境箱内获取，实验箱这一附属部件与分析便利性的需求极不相称，因此开展适用于任何环境的光照补偿算法研究显得十分必要；此外，手机摄像头以及拍照方式千差万别，如何解决手机摄像头的一致性，也是值得深入研究的问题。
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