液态金属与低温生物研究中心饶伟研究员团队应CELL出版社Trends in Biotechnology杂志的邀请，就仿生型低温保存方法发表了题为Bioinspired materials and technology for advanced cryopreservation（DOI: 10.1016/j.tibtech.2021.06.004）的综述文章。文章凝练了自然界中冬眠动物及抗冻生物的耐寒机制，并总结了近年来针对三维体相系统的仿生型低温保存材料与技术的发展，对于低温保存未来发展趋势提出了独特见解（图1）。
在低温下生存的动物，如哺乳动物在冬眠期间,减缓代谢速率以节约能量并减轻缺血损伤，冷冻避免型动物采用过冷来防止或减轻冰晶带来的损伤，而耐冻动物甚至可以忍受部分体液结冰。冬眠动物、耐寒两栖动物、爬行动物和昆虫为仿生型低温保存材料及技术的研究提供了理想的参考模型。借鉴耐寒生物的自适应低温保存方法，或将帮助人类掌握复杂生命活体的冷冻保存技术。
图1. 动物的耐寒机制启发研究人员革新低温保存方法
从生物传质的角度，耐寒物种的生理性调控为发展新型天然冷冻保护剂提供了宝贵思路，包括但不限于抑制代谢速率、应激通路上调以及低温保护剂的积累（图1）。一些特定分子，如硫化氢(H2S)和活化蛋白激酶(AMPK)，在增强供体器官耐受缺血-再灌注损伤的能力中发挥了重要作用。在耐寒动物体内发现了具有高生物相容性的冷冻保护剂，例如，L-脯氨酸、海藻糖、抗冻蛋白及其衍生物，可用于减缓生物样本所受冰的伤害，提高生物样本低温保存效率。团队前期研究了L-脯氨酸及海藻糖等天然冷冻保护剂对冰晶成核、生长、重结晶的影响机制，发现脯氨酸在冷冻过程中渗透进入细胞，在降低冰点和抑制冰晶生长方面发挥重要作用，而海藻糖在冻结过程中起到抑制冰生长的作用，在解冻过程中能够抑制冰重结晶。L-脯氨酸及海藻糖的联合使用，成功实现了红细胞的无毒冻存，并且冻存后的红细胞生理学功能良好（图2），有望取代目前临床上普遍使用的低温保护剂甘油（需洗脱，洗脱过程耗时耗力），用于红细胞的大规模长期快速冻存与复苏（Cryobiology，DOI：10.1016/j.cryobiol.2019.11.002）。
图2. L-脯氨酸&海藻糖联合使用冻存红细胞
除了天然氨基酸与糖类，抗冻蛋白在耐寒生物的低温生存中也起到了关键性的作用。但抗冻蛋白存在一定的生物毒性并可能引发免疫反应，且生产成本过高不宜大规模生产。研究小组联合化学所王健君老师研究团队在此问题上取得了关键突破，发现了一种具有强大水合能力的丝素蛋白，能够抑制低温保存过程中冰晶形成和再结晶。蚕茧由20%的丝胶蛋白和80%的丝素蛋白组成。虽然丝胶蛋白已经被用作冷冻保护剂，但丝胶蛋白经常引起免疫反应。因此，使用丝素蛋白作为冷冻保护剂有以下优点:(1)与丝素相比，丝素蛋白无毒、生物兼容、生物降解，已获药物管理局(FDA)在药物传输和组织工程/手术应用；(2)丝素蛋白主要由链多肽与普通疏水性和亲水性域,赋予丝素蛋白水化能力强,可以抑制冰的形成和有效地阻止水在冰面上的扩散，进一步限制冰晶的生长(图3); (3) 丝素蛋白可以与细胞膜相互作用，这可能有助于稳定细胞膜的完整性，并通过相互作用保护细胞膜免受低温损伤。实验表明, 仅添加10.0 mg mL-1丝素蛋白到基础低温保护溶液，可使人骨髓间充质干细胞玻璃化冻存活率显著提升，从31.45%提升到81.28%，这与使用商业化低温保护溶液保存效果相对相当（Biomacromolecules，DOI：10.1021/acs.biomac.1c00700）。这表明丝素蛋白可有效地保护人骨髓间充质干细胞免受低温损伤。重要的是，低温保存的人骨髓间充质干细胞的干细胞性和分化潜能与未低温保存的人骨髓间充质干细胞等同的效果。
图3. 丝素蛋白玻璃化冻存人骨髓间充质干细胞
从生物传热的角度分析，体积较大的耐寒动物（木蛙）不仅依靠外界环境的热传导，还通过提高自身代谢率，利用化学能产生热量，实现机体均匀、快速的降温和复温，以避免结晶、重结晶并减少缺血再灌注损伤。
为获得更快的降温速率，以减少低温保护剂的使用，除了减少低温保存样本的体积和使用导热系数高的载体材料外，低温冷源温度降低，也可提高传热效率，大大提高冷却速率，促进低温保存后生物样本存活。液氮(-196 °C)是一种广泛用于生物样本保存的低温冷源。近年来，随着低温工业的发展，液氦更容易获得，且其温度比液氮更低(-269 °C)。液氦作为玻璃化低温冷源被提出，以提高玻璃化细胞的冷却率和存活率。研究团队建立了干细胞浸入液氮或液氦冷却过程的模型。模拟结果表明液氦作为低温冷源具有较高的冷却速率，有利于玻璃化（图4）。随后，基于上述数值模拟结果，首次提出了液氦作为冷源的热力学过程图，利用液氦作为低温冷源高效冻存人骨源间充质干细胞(存活率：85.2%)及人胚胎干细胞(79.0%)，并减低了低温保护剂的使用浓度。该工作受Multiscale Thermal Engineering for Biomedical Applications专题约稿发表于国际期刊Bioengineering上（2021，DOI：10.3390/bioengineering8110162），并被选为Featured Paper。
图4. 液氦及液氮为冷源的玻璃化冻存的热力学过程分析
为获得更快的升温速率，受耐寒生物自主调节的解冻过程的启发，研究人员将纳米粒子低温保护剂作为自加热粒子，在外部物理场驱动下实现生物样本快速而均匀的复温，而不是仅仅依赖于从组织表面到内部深处的热传导。这种纳米复温方法不仅可以显著提高升温速率，从而减少低温保护剂的用量，还可以消除温度不均匀性，将热应力降至最低。团队制备了包覆表面活性剂的柔性液态金属纳米颗粒，并在激光照射下实现玻璃化人骨髓间充质干细胞及5毫米长小鼠尾组织的快速复温（图5），且复温后的人骨髓间充质干细胞生理学功能完好，小鼠尾巴的血管结构完整，实现了复杂大体积生物样本的成功复温（Acta Biomaterialia，DOI：10.1016/j.actbio.2019.11.023）。
图5. 细胞玻璃化冻存方案中，纳米液态金属对复温过程冰晶重结晶的抑制效果
更值得指出的是，仿生低温保存是生物体系统性调节传热传质以适应低温环境的过程。从系统调控的角度，研究团队进一步实现了复杂生命个体的耐冻能力的提升。通过低温驯化及喂饲低温保护剂L-脯氨酸，成功将冷冻敏感型日本弓背蚁Camponotus japonicus Mayr转化为冷冻耐受型（图6）（Science Bulletin, DOI：10.1016/j.scib.2019.09.028）。这项研究通过热力学条件优化与L-脯氨酸驯饲成功地提升了非耐寒性日本弓背蚁的耐寒能力（图7），L-脯氨酸驯饲后的蚂蚁在-27.66 °C冷冻的存活率相比较对照组增加了两倍多。热力学及代谢组学分析揭示出L-脯氨酸在蚂蚁体内的积累，蚂蚁体内活化水含量降低等因素均有助于减少冷冻损伤。更为重要的是，本研究首次阐明了外源性冷冻保护剂在蚂蚁体内的积累对于蚂蚁的基因调控与耐寒性提升之间关系的影响。冷敏感蚂蚁相变过程中抗损伤机制的研究将为今后组织器官保存和复杂生物体的低温保存相关研究提供理论和技术支持。
图6. L-脯氨酸训饲使冷冻敏感型蚂蚁转化为冷冻耐受型生物体
图7. L-脯氨酸训饲后蚂蚁的抗冻能力提升机制
未来，基因组学和蛋白质组学筛选工具、实时无创的3D温度监测方法有助于阐明耐寒物种冷适应机制；此外，还需要结合复杂生物体真实解剖结构进行传热传质系统分析，以降低冻融过程中的热机械应力。值得指出的是，最佳冷却和复温速率是实现冷敏感生物样品成功低温保存的必要条件，因而发展绿色无毒低温保护剂和低温精准调节平台是未来的重要方向。更进一步的，大尺度生物样本的保存需要从系统的整体尺度进行设计，例如开发模拟肺部分子交换的仿生薄膜，以及模拟肾脏去除有毒物质的仿生透析器等等。通过仿生生物自适应实现复杂生命体的长期低温保存并非镜中花水中月，作为一个新兴的研究领域，多领域多学科的“跨界”合作，将激发出仿生性冷冻保存巨大的研究和临床应用的价值。
以上系列工作得到国家自然科学基金重大项目课题、国家重点研发计划课题等的资助。
