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遗传修饰技术在绵羊分子设计育种中的应用

本站小编 Free考研考试/2022-01-01
王海涛,1,2, 李亭亭3, 黄勋1,2, 马润林,1,2,4, 刘秋月,1 1. 中国科学院种子创新研究院,北京 100101
2. 中国科学院遗传与发育生物学研究所,分子发育生物学国家重点实验室,北京 100101
3. 浙江农林大学,杭州 311300
4. 中国科学院大学,北京 100049

Application of genetic modification technologies in molecular design breeding of sheep

Haitao Wang,1,2, Tingting Li3, Xun Huang1,2, Runlin Ma,1,2,4, Qiuyue Liu,1 1. Innovation Academy for Seed Design, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
2. State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
3. Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, China;
4. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

通讯作者: 马润林，博士，研究员，研究方向：免疫功能基因组学与免疫遗传学。E-mail:rlma@ucas.ac.cn；刘秋月，博士，副研究员，研究方向：肉羊遗传育种。E-mail:qyliu@genetics.ac.cn

责任编辑: 姜雨
收稿日期:2021-03-8修回日期:2021-04-14网络出版日期:2021-06-20
基金资助: 中国科学院战略性先导科技专项(A类)资助编号.XDA24030205


Received:2021-03-8Revised:2021-04-14Online:2021-06-20
Fund supported: Supported by the Strategic Priority Research Program of Chinese Academy of Sciences No.XDA24030205

作者简介 About authors
王海涛,博士,博士后,研究方向：农业动物基因编辑。E-mail:wanght@genetics.ac.cn







摘要
利用遗传修饰技术可以使动物在遗传水平发生改变,实现在个体内表达外源基因或对其内源基因的功能造成影响。在动物育种中,可以利用遗传修饰技术在分子水平进行设计并实现品种的快速改良。从传统的遗传修饰技术、病毒载体、精子载体等介导的遗传修饰技术到新型人工核酸酶介导的基因编辑技术,尤其是CRISPR/Cas9为代表的人工核酸酶的运用使得基因编辑动物的制备变得更加高效快捷,并迅速在多个物种中得到应用。这些方法也已经拓展到了绵羊(Ovis aries)遗传育种领域。利用遗传修饰技术在绵羊中进行分子育种比传统的育种方式具有更大的优势,可以使用多种策略直接对性状进行快速改良,并且可以加快育种进程。本文详细介绍了遗传修饰技术在绵羊中的研究历程,探讨了通过遗传修饰技术进行绵羊分子设计育种的可能性,并提出以上技术和方法在绵羊育种中面临的问题和挑战。
关键词： 绵羊;遗传修饰;基因编辑;动物育种

Abstract
Genetic modification technologies can be used for modifying animal genome to express exogenous genes or affect the function of endogenous genes. In animal breeding, genetic modification technologies allow the rapid generation of germplasms with beneficial traits. It includes traditional genetic modification, virus or sperm carrier-mediated genetic modification and nuclease-mediated genome editing, especially the CRISPR/Cas9, one of the artificial nuclease genome editing technologies, have been applied in genome editing in many domestic animals including sheep (Ovis aries). Compared with conventional strategies used for animal breeding, there is great value for sheep breeding improvement by using genome editing technology, which is more effective and timesaving. In this review, we summarize the approaches of genetic modification in sheep and discuss the possibility of molecular design and breeding of sheep by genome editing technologies. We also identify the potential bottlenecks and challenges of these technologies in sheep breeding.
Keywords：sheep;genetic modification;genome editing;animal breeding


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本文引用格式
王海涛, 李亭亭, 黄勋, 马润林, 刘秋月. 遗传修饰技术在绵羊分子设计育种中的应用. 遗传[J], 2021, 43(6): 580-600 doi:10.16288/j.yczz.21-087
Haitao Wang. Application of genetic modification technologies in molecular design breeding of sheep. Hereditas(Beijing)[J], 2021, 43(6): 580-600 doi:10.16288/j.yczz.21-087


绵羊(Ovis aries)是畜牧业中重要的农业动物之一,约在1万年前即被人类所驯化[1],主要为人类提供皮毛、肉类和奶制品等。为了获得具有优良性状的绵羊品种,人们通过各种方式进行品种的选育,期望获得具有较高肉奶产量、生产优质皮毛或具有较高抗病能力的绵羊品种。传统的育种方式是通过表型选择将优良性状个体进行保留。整个过程需要对其亲本进行选种,包括选定亲本品系、确定杂交组合、杂交代数等。为了固定表型,需要采用适当的近交,但近交会引起动物的表型退化、品质衰退等。杂交产生的后代也会出现性状分离的现象,育种过程非常缓慢且复杂。

自基因的概念提出以来,分子生物学和基因工程理论和技术获得了较大的发展,明确了遗传变异可以引起性状的改变。因此,可以通过对基因进行修饰或编辑实现新品种培育。通过物理或化学诱变可以在动物中实现诱变育种[2],但诱变产生的基因突变往往是随机性的,并且会产生无育种价值的性状或不利于育种的性状。遗传修饰育种直接针对调控性状的基因,通过转基因或基因编辑等方式对基因进行分子设计,在保留品种固有优良性状的基础上,引入新性状,改善劣势性状,而且可以突破品种的局限,将其他物种的性状引入,从而克服物种间的生殖隔离,把不同物种的优质性状集合和重组,实现定向选择育种。分子设计育种相比传统育种在可预见性和选择上有了极大的提高。

通过遗传修饰在动物中进行分子设计育种,理论上仅需要一个世代就能获得稳定遗传的品系,可以大大缩短育种时间,降低育种成本。通过直接对基因进行操作,在获得的基因修饰个体中就能获得稳定的基因型。基因修饰操作的过程对个体的要求较低,需要品种内具有典型性状的个体提供体细胞、胚胎或卵细胞即可。基因修饰个体的制备需要代孕母畜,但代孕受体的选择标准也较为宽松,不需要本品种内的最优个体,可以用物种内其他品种中具有优良繁殖能力的个体,拓宽了选择范围,同时保有一定数量的受体即可。通过规模化的基因修饰,可以在短时间内获得一定数量的基因修饰动物群体。通过将获得的纯合子进行交配,对群体进行扩繁,可以在几代之内就建立相当规模的稳定遗传品系,相较于杂交育种缩短了时间,提高了效率。

1 遗传修饰技术在绵羊中的应用

在绵羊等大动物中,遗传育种对性状的改良主要包括改善原有性状以及引入新性状。可以转入外源基因序列以获得原物种不具备的表型或功能。遗传修饰的方式最初为外源基因的随机插入或同源重组介导的插入或删除,同时需要借助受精卵显微注射或体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)的方式获得遗传修饰绵羊。在自然情况下同源重组发生的概率极低,只有10-6[3],遗传修饰细胞的筛选难度较大,适合在干细胞中进行筛选,而绵羊的干细胞体系目前并不成熟。因此,提高同源重组效率成为分子设计育种中的关键。

在以人工核酸酶为代表的基因编辑技术出现后,以CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated 9)系统为代表的基因编辑逐渐成为遗传修饰的常用方法。人工核酸酶系统通过提高DNA双链断裂效率来提高同源重组的效率,其原理为：当基因组中出现双链缺口时,启动基因组损伤修复机制,包括非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)修复,或者存在同源供体的情况下,启动同源重组修复(homology- directed repair, HDR),将外源基因引入至重组区域[4]。因此,提高基因组中双链断裂的效率,就能提高同源重组的能力,从而提高基因打靶效率,可以使随机的重组效率由原来的10-7~10-6提高至10-2~10-1。借助新型基因编辑工具,不仅能实现外源基因在受体中稳定高效的表达,还可以实现基因组中序列的缺失、碱基替换和插入等,造成移码突变、氨基酸转换等。基因编辑工具的出现极大地丰富了遗传修饰的方法和策略。遗传修饰技术发展及在绵羊中的应用进程如图1所示。

图1

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图1遗传修饰技术及其在绵羊中应用的里程碑事件

Fig. 1Milestones in genetic modification and its application in sheep



制备遗传修饰大动物涉及多种原理和技术的应用以及繁杂的操作流程(图2)。原理方面涉及随机插入、同源重组、DNA碱基修复、转座子、RNAi转录后调控等分子生物学基础概念。将这些概念转化为实际可操作的技术,首先需要根据实验目的构建相应质粒载体,其次要实现载体向细胞、胚胎甚至个体的转移。操作技术包括：脂质体/病毒/精子等方法进行载体递送, mRNA或蛋白质的直接显微注射,体细胞核移植技术等获得基因被修饰的个体。总体可分为以下3部分：(1)获得目的基因序列并通过限制性内切酶的酶切连接,制备携带外源基因或具有敲除、点突变或干扰等功能的载体。例如具有同源重组功能的载体,以及表达外源基因、转座子酶、siRNA、锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases, TALEN)或CRISPR/Cas9等元件的载体,或者体外获得具有基因修饰功能的mRNA或蛋白质。(2)通过细胞转染、病毒递送或显微注射等方式将载体、mRNA或蛋白质转入体细胞或早期胚胎中,对供体细胞或受精卵基因组进行遗传修饰。(3)发生基因修饰的供体细胞或受精卵再通过体细胞核移植技术或胚胎移植技术移入受体动物子宫内,从而获得包括绵羊在内的多种遗传修饰动物。

图2

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图2制备遗传修饰绵羊流程图

制备遗传修饰绵羊之前,需要确定候选基因,通过载体构建获得具有各种候选基因修饰功能的载体。通过载体转染或各种递送方式,在供体细胞或受精卵中载体表达并对基因组进行修饰或编辑。获得的遗传修饰胚胎移植入受体母羊中发育并获得遗传修饰绵羊。
Fig. 2Schematic of generating genetically modified sheep



1.1 传统的遗传修饰方法

在高效基因编辑技术建立以前,在绵羊中主要通过基因组本身的同源重组或外源片段随机插入对基因进行修饰,并结合显微注射或体细胞核移植技术获得遗传修饰个体。使用这种遗传修饰方式,在基因组中发生基因编辑或重组的效率较低,插入位点具有随机性,并且容易产生嵌合体等特点。通过显微注射和体细胞核移植技术获得的转基因绵羊研究结果见表1。与最早获得的转基因小鼠(Mus musculus)类似,第一只转基因绵羊也是通过显微注射获得。1985年,研究者将人生长激素基因(human growth hormone, hGH)通过显微注射注入绵羊胚胎,通过胚胎移植入代孕受体中获得第一只转基因绵羊[6]。在后续较长时间内,人们通过显微注射制备了多种转基因绵羊,如转羊生长激素基因的绵羊[18,19]以及转Visna病毒糖蛋白绵羊等[20]。

Table 1
表1
表1通过显微注射和体细胞核移植技术获得的遗传修饰绵羊
Table 1Genetic modified sheep generated by microinjection and somatic cell nuclear transfer
制备方法基因名称序列编辑结果表达情况参考文献
显微注射hGH GH cDNA随机整合无[6]
oGH (ovine growth hormone)GH cDNA随机整合表达[18, 19]
vLRT/vvENV (virus long terminal repeat/visna
virus envelope)		病毒LTR区随机整合表达[20]
hGFR (human growth hormone-releasing factor)/
bGH (bovine growth hormone)		GH cDNA随机整合无[21]
hGFR/bGHminigene随机整合表达[22]
hα1AT (human α1-antitrypsin)minigene随机整合表达[23]
hAF IX (human antihemophilic factor IX)cDNA随机整合表达[24]
hBCF VIII (human blood clotting factor VIII)cDNA随机整合表达[25]
CAT (chloramphenicol acetyl transferase)编码序列随机整合表达[26]
HTT (Huntington)人HD cDNA随机整合表达[27]
IGF1 (insulin-like growth factors)cDNA随机整合表达[28]
oTLR4 (ovine Toll-like receptor 4)cDNA随机整合表达[29]
体细胞
核移植		hF IX (human factor IX)完整编码区随机整合无[10]
oPRP和GGTA1cDNA定点敲除GGTA1和PRP敲除[30]
COL1A1位点插入AAT基因cDNA定点插入AAT表达[31]
oTLR4 cDNA随机整合表达[32]
Caenorhabditis elegans fat-1cDNA随机整合被沉默[33]

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克隆羊多莉的诞生标志着哺乳动物体细胞克隆技术的建立[9]。利用体细胞筛选获得稳定整合外源基因的单克隆细胞作为细胞核供体,经过核移植和胚胎移植技术产下预期性状的克隆后代,同时不存在显微注射产生嵌合的问题。研究人员最早通过此方法获得了能够在羊乳中表达人凝血因子的转基因绵羊[10]。2001年英国的罗斯林研究所通过同源重组结合体细胞克隆技术获得了oPRP (ovine prion protein)和GGTA1 (α(1,3)galactosyl transferase)定点敲除的绵羊[30]。该技术获得的细胞供体是通过同源重组获得的基因敲除单克隆细胞,因此再通过体细胞核移植获得的克隆后代均为阳性个体。McCreath等[31]也通过同源重组及体细胞核移植技术获得了COL1A1 (ovine α1(I) procollagen)定点插入AAT (α1-antitrypsin)的基因修饰绵羊。

显微操作技术理论上可以在任何能获得卵细胞的动物中进行操作,甚至可以在胚盘下腔注射以获得遗传修饰禽类,而体细胞核移植只能对两栖类、鱼类和哺乳类卵细胞进行操作。通过显微注射技术制备遗传修饰动物时,在原核形成到第一次卵裂之间进行显微操作,才能尽可能的避免产生嵌合体。早期获得遗传修饰动物的效率较低,使得显微注射获得的个体大多数为野生型或嵌合体。而体细胞核移植技术可以将大量的筛选工作在细胞水平进行,避免在出生的后代中产生大量阴性个体或嵌合体。

1.2 精子载体、慢病毒载体、转座子介导的遗传修饰

显微注射或体细胞核移植技术是将遗传修饰载体导入早期胚胎或细胞的传统方式,此后又发展出利用精子或病毒等生物载体的导入方式。精子载体法的原理为,通过将精子与DNA共孵育后,将携带DNA的精子受精,从而获得基因修饰的受精卵;或者在绵羊睾丸中直接注射外源载体,载体进入精子后再进行交配获得基因修饰后代。多个团队分别通过这种方法制备了SLC7A11 (solute carrier family 7 member 11)[34]、PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma)[35]和LPL (lipoprotein lipase)[36]的转基因绵羊,并获得了具有表型的F1后代。但这种方法的重复性较差且效率较低。

慢病毒载体介导的基因修饰依赖于病毒感染细胞的能力,通过将慢病毒注射到绵羊卵子或胚胎,实现基因转移。通过慢病毒载体感染,已获得了转GFP (green fluorescent protein)转基因羊[37,38,39]以及具有更高产毛性能的转FGF5 (fibroblast growth factor 5)绵羊[40]。结合显微注射和慢病毒载体的方法,也获得了转入外源基因表达量较高的后代[41,42]。病毒载体递送质粒相对于显微注射法和体细胞核移植方法相对简单,甚至在小鼠中可以直接通过鼻腔或气管滴入的方法递送到肺部进行基因编辑[43],但这一方法在大动物中还未见报道。此外,使用病毒载体法获得遗传修饰动物在安全性方面也会受到限制。

在基因组中存在具有特殊功能的序列,也可被用于实现绵羊中基因遗传修饰。例如构建表达转座酶的质粒载体并结合其他递送方法,即利用转座子的转座活性将序列插入基因组中特定区域,在绵羊中已有报道(表2)。Bevacqua等[44]通过Tn5或SB (sleeping beauty)转座子载体结合显微注射成功获得了遗传修饰绵羊个体;Hu等[45]则通过SB转座子介导的RNAi获得了MSTN (myostatin)敲低的绵羊个体。

Table 2
表2
表2绵羊中使用病毒载体、精子载体或转座子介导的遗传修饰研究
Table 2Studies on genetic modifications by using viral, sperm or transposon vectors in sheep
修饰方法基因名称辅助方法编辑结果参考文献
精子载体SLC7A11睾丸内注射基因表达[34]
PPARγ睾丸内注射基因表达[35]
LPL睾丸内注射基因表达[36]
eGFP慢病毒介导基因表达[46]
病毒载体eGFP显微注射基因表达[37~39]
FGF5显微注射异位表达[40]
GFP显微注射基因表达[41]
tdTomato、zYellow和acGFP显微注射基因表达[42]
转座子载体Tn5和SB转座子显微注射GFP表达[44]
SB转座子RNAiMSTN敲低[45]

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一般情况下,精子载体和慢病毒载体介导的遗传修饰技术不需要依赖精密的仪器设备和复杂的技术操作,相比显微操作和体细胞和移植技术成本较低。利用转座子介导的遗传修饰,是在高效精确的人工核酸酶技术规模运用之前的有效修饰方法。人工核酸酶技术出现后,凭借在修饰效率上的巨大优势,成为了在农业动物中的遗传修饰的主要方法。然而,技术的创新无法突破动物生殖方式的局限,畜禽动物本身的生殖方式决定了对其进行遗传修饰操作时,可选择的载体递送方式以及修饰难度存在差异。例如,哺乳动物可获得卵母细胞并在体外进行受精,从而将受精卵与显微注射、转染等操作体系配合。而禽类的生殖方式决定了受精卵在离开母体之前,已经经过卵裂等发育阶段成为多细胞的胚胎,此外,禽类的蛋壳也加大了对其卵或胚胎进行遗传修饰操作的难度。

1.3 人工核酸酶介导的基因精准编辑

如前面所述,通过显微注射和体细胞核移植技术,可以实现外源基因的表达或内源基因的打靶,但外源基因的插入是随机的,打靶的效率也很低。随着人工核酸酶被证实可以运用于遗传修饰后,动物的基因修饰已经从最初单一的、随机性的转基因向基因组的精准敲入、敲除和点突变快速发展,甚至可以实现时间和组织特异性的基因编辑。目前通过显微注射和SCNT结合常用的人工核酸酶技术获得基因编辑绵羊的方法如图3所示,所报道获得的基因编辑绵羊如表3所示。

图3

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图3人工核酸酶技术制备基因编辑绵羊的方法示意图

ZFN、TALEN或Cas9载体主要通过显微注射或体细胞核移植递送入体细胞或受精卵中,在细胞中介导DNA双链断裂(DNA double strand break, DSB),经过细胞内同源重组修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)修复可以对内源基因进行编辑或引入外源基因,获得的基因编辑细胞经过体细胞核移植(SCNT)获得后代,基因编辑胚胎则通过胚胎移植入受体中获得后代。
Fig. 3Schematic diagram for generating genome edited sheep using nuclease technique



Table 3
表3
表3人工核酸酶技术介导的基因编辑在绵羊遗传修饰中的应用
Table 3Application of gene editing mediated by nuclease techniques in sheep genetic modification
人工核酸酶基因名称递送方法编辑结果参考文献
ZFNMSTN脂质体转染基因敲除[14, 47]
TALENMSTN显微注射基因敲除[15]
MSTN核移植基因敲除[48, 49]
CRISPR/Cas9MSTN显微注射基因敲除[17, 50]
MSTN、ASIP (agouti gene)和BCO2 (beta-carotene oxygenase 2β)显微注射基因敲除[51]
TNSALP (tissue-nonspecific alkaline phosphatase)显微注射基因敲除[52]
PDX1 (pancreatic and duodenal homeobox protein 1)显微注射基因敲除[53]
GFP显微注射定点敲入[54]
CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)核移植基因敲除[55]
MSTN核移植基因敲除[56]
SOCS2 (suppressor of cytokine signaling 2)显微注射碱基突变[57]
ASIP显微注射基因敲除[58]
BMPR1B (bone morphogenetic protein receptor type 1B)显微注射基因敲除[59, 60]
otoferlin显微注射重组敲入[61]
FGF5显微注射基因敲除[62, 63]
ASMT (acetylserotonin methyltransferase)显微注射随机整合[64]

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1.3.1 ZFN介导的基因编辑

Lee等[8]于1989年首次报道了锌指结构,后来逐渐发展为可用于基因编辑的锌指核酸酶技术。ZFN系统通过序列识别结构域和切割结构域发挥作用。其中,锌指蛋白由Cys2-His2蛋白单元组成,可以与基因序列上的3个碱基识别[65]。根据靶基因序列,将多个蛋白单元串联组装而成的锌指蛋白即可对其识别,串联结构越长,就越有识别的特异性[66]。起切割作用的为Fok I酶,在锌指蛋白的引导下切割基因序列[67]。而Fok I通常形成二聚体,因此可以对序列造成双链断裂,进而启动基因修复机制[68]。带有ZFN表达元件的质粒载体正是通过这种机制对细胞基因组进行编辑。ZFN首次在非洲爪蟾(Xenopus laevis)中被应用[12],此后在果蝇(Drosophila melanogaster)[69]等动物中均被成功使用。

Salabi等[14]在绵羊肌肉卫星细胞中通过ZFN对MSTN进行了编辑并筛选获得了阳性克隆,继而验证MSTN在卫星细胞中的功能。Zhang等[47]在绵羊成纤维细胞中成功敲除了MSTN基因,并通过ZFN mRNA的显微注射获得了基因编辑胚胎。但目前未见有通过ZFN获得基因编辑绵羊的报道。ZFN的使用比被动的同源重组在效率上有了较大的提高,但由于其设计复杂、特异性较差、有细胞毒性以及容易脱靶等原因,逐渐被后来的其他人工核酸酶所取代。

1.3.2 TALEN介导的基因编辑

转录激活因子样效应物核酸酶是在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现的转录激活样效应物的基础上建立的[11],其结构和原理与ZFN相似,包括具有识别功能的TALE蛋白和切割功能的Fok I酶。TALE具有结合DNA的功能,其中含有的重复串联区域包含34个氨基酸,第12和13位点的氨基酸对于识别特定的碱基起关键作用[70]。在TALE导向下,Fok I对基因组的特定区域进行切割。TALEN以二聚体的形式发挥双链切割作用,因此通常制作1对TALEN载体。自TALEN运用到果蝇中以来[13],在绵羊中的应用主要靶向绵羊MSTN基因。通过TALEN mRNA注射受精卵[15],或体细胞核移植均获得了MSTN编辑绵羊,且在表型上与野生型呈现差异[48,49]。相比ZFN,TALEN在特异性方面有所提高,但TALE分子较大、制备依然复杂,需要的成本和时间过长。

1.3.3 CRISPR/Cas介导的基因编辑

CRISPR/Cas系统凭借其简单的设计、更高的效率,为基因编辑带来了革命性的突破。CRISPR全称为成簇的、规律间隔的短回文重复序列。Cas为CRISPR相关基因编码的特异切割DNA分子的核酸酶,于1987年在细菌和古细菌中被发现,具有发挥细菌免疫功能的作用[7]。CRISPR/Cas系统分为I、II和III,其中Cas9属于II型系统,仅需要一种蛋白参与即可完成序列切割[71]。II型系统包含4种分子,其中crRNA和tracrRNA组成的双链复合体引导Cas9蛋白在序列上特定位置切割。在实际应用中,通过4个碱基将crRNA和tracrRNA连接,形成向导RNA (single-guide RNA, sgRNA)表达框。一个Cas9载体包含了sgRNA表达框和Cas9蛋白。由于生物体内含有RNase,只需要将20 bp的sg序列连入载体中,就能获得可以在细胞内切割DNA序列的全部元件,sg序列则为切割提供引导。sg序列虽然依赖于相邻的PAM序列(5ʹ-NGG-3ʹ序列),但在基因组中,NGG序列普遍存在,平均每128 bp序列中就可以找到一个位点[71]。CRISPR/Cas系统在2013年被证实可用于哺乳动物的基因编辑,此后使用CRISPR/Cas9进行动物基因编辑的研究出现井喷式的成果。利用显微注射技术,可以实现Cas9 mRNA及其sgRNA同时被注入受精卵中,获得基因编辑的绵羊。Crispo等[17]和Han等[50]利用该方法分别获得了MSTN编辑的绵羊,其与野生型绵羊相比表现出明显的体重差异。Wang等[51]则获得了多个基因(MSTN、ASIP和BCO2)同时编辑的绵羊,显示出Cas9系统的强大编辑能力。此外,通过Cas9系统结合显微注射获得了TNSALP[52]及PDX1[53]基因编辑绵羊。另外,还实现了绵羊Rosa26位点的外源基因定点插入[54]。CRISPR系统也可以与SCNT技术结合制备基因编辑绵羊,如对CFTR基因编辑的绵羊[55]以及MSTN编辑的绵羊[56]。

1.3.4 单碱基编辑系统(base editing)

2016年,Komor等[72]开发了基于Cas9系统的单碱基编辑系统,该技术被评为Science杂志年度十大科学技术突破之一,在基因治疗、遗传育种等领域具有应用的潜力。通过将失活或只有单链切割活性的dCas9 (deactivated Cas, dCas)及nCas9 (nickase Cas, nCas)与嘧啶或嘌呤脱氨酶结合,单碱基编辑器可以精准的将胞嘧啶(C)转化为胸腺嘧啶(T),或将腺嘌呤(A)转化为鸟嘌呤(G),分别称之为胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editors, CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors, ABE)[73]。单碱基编辑器不需要依赖基因组双链断裂的产生,也无需供体DNA参与编辑,因此简化了基因编辑步骤。在绵羊中,Zhou等[57]通过CBE系统实现了SOCS2基因的C>T转换,获得了具有更快生长速度的基因编辑滩羊,为培育快长型绵羊品系奠定了基础。单碱基编辑系统将动物的遗传修饰从最初的整个基因的插入或大片段的敲除缩小到单个碱基的操作水平,对动物中由单碱基突变导致性状变异的位点进行基因编辑。但单碱基编辑系统目前仅可以实现碱基的转换(transition)而无法实现碱基的颠换(transversion),只能对符合碱基转换类型的特定突变进行编辑,限制其对任意性状的操作。此外,Jin等[74]及Zuo等[75]分别在不同物种中发现单碱基编辑系统存在严重的脱靶效应,应用时可能存在较大风险。其中,Zuo等[75]还建立了名为GOTI (genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection)的脱靶检测技术,能够显著提高单碱基编辑时脱靶检测的敏感性,可以在全基因组范围内发现以往检测手段不易发现的脱靶位点。该方法为减少单碱基编辑技术应用的风险提供保障,利于该技术的广泛应用。

目前,除Cas9及单碱基编辑系统外,还有多种CRISPR相关的基因编辑工具被开发出来。例如,具有更高编辑效率的Cas12系统,具有靶向RNA编辑功能的Cas13系统,能够编辑单链DNA的Cas14系统[76]以及更小分子量的CasⅩ[77]等。除Cas9之外,目前尚未见到其他CRISPR/Cas系统在绵羊中应用的报道,但这些研究为绵羊的分子育种提供了较新的思路和方法。

2 利用遗传修饰在绵羊中进行分子设计育种的主要方向

在驯化初期,人类饲养绵羊作为主要肉类来源,因此驯化方向大多为肉用品种。此后,为了获得羊毛等副产品,人们又驯化出产毛量、毛色各异的地方绵羊品种。经过长期的人工驯化,现在的绵羊品种与其祖先在体型外貌、行为、生殖能力等方面显示了巨大差异,并在品种间出现显著变异。人工选择会在基因组上留下与动物性状相关的选择信号或分子标记。通过遗传修饰在绵羊中进行分子育种,不仅使育种时间大为缩短,也可以将多种优良性状聚合,一次实现多个性状的改良。在绵羊中,通过遗传修饰进行分子设计育种主要体现在增强抗病抗逆能力,包括抗病毒、细菌及寄生虫能力和抗寒、抗高温高湿能力;改良生产性状,包括肉产量、肉品质、奶品质;改善羊毛产量和品质,包括毛长度、产量和强度;提高繁殖力,包括排卵数和产羔数等方面;制备动物模型,包括人类疾病模型或制备药品等。利用遗传修饰在绵羊中进行分子设计育种的应用方向如图4所示。

图4

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图4利用遗传修饰在绵羊中进行分子设计育种的应用方向

通过对性状相关的基因进行修饰,在绵羊中可以实现多个方向的应用,例如生产性状,包括肉产量、肉质、生长速度等;毛纤维性状,包括羊毛产量、结构、毛色等;繁殖性状,包括产羔数等;高抗病能力;制备人类疾病模型;通过乳腺反应器生产药物等。
Fig. 4Applications of molecular design breeding in sheep using genetic modification



2.1 通过分子设计育种改善羊毛性状

从克隆羊多莉出生到现在的20多年间,国内外针对上述性状开展了多项遗传改良方面的研究。在提高羊毛性状方面,Damak等[26,78]获得的IGF1转基因绵羊F1代的羊毛产量提高了6.2%,但F2代的羊毛产量提高效果却不显著。Bawden等[28]将毛角蛋白II基因在皮质中特异性表达,获得的转基因羊毛结构发生改变,外观富有光泽且卷曲度下降。多项获得FGF5基因编辑绵羊的研究都证实转基因个体羊毛产量比野生型绵羊有显著提高[38,45]。Zhang等[58]通过显微注射和Cas9技术敲除了ASIP基因获得毛色发生变化的基因编辑绵羊。He等[34]通过睾丸注射进行SLC7A11基因编辑也获得了毛色变化的绵羊。

2.2 通过分子设计育种改变肉产量及品质

在改善绵羊产肉量及肉品质方面是研究者投入精力最多的领域。Amdas等[19]获得的转生长激素基因绵羊可过量表达生长激素,使生长速度增加同时减少脂肪含量。牛生长激素[21]以及人生长激素[6]都曾被转入绵羊中以提高绵羊生长速度。在提高产肉量方面,MSTN基因是大部分研究者选择的靶基因。MSTN敲除的绵羊大部分能获得生长速度较快、体重显著增加以及肌纤维增大的表型。Proudfoot等[16]、Crispo等[17]、Hu等[45]、Zhao等[48]、Li等[49]、Han等[50]以及Zhang等[56]通过TALEN或Cas9等方法结合显微注射或体细胞核移植获得了MSTN敲除绵羊,且取得预期表型。通过Cas9介导的SOCS2基因单碱基编辑绵羊同样表现出显著提升的生长速度[57]。绵羊肉品质的改良主要集中在减少肌间脂肪含量和改善脂肪成分方向,主要通过导入外源基因和对脂肪代谢相关通路中成员进行编辑来实现。目前,已获得了PPARγ[35]、LPL[36]和Fat1[33,79]的转基因绵羊。

2.3 通过分子设计育种进行绵羊抗病及疾病模型研究

抗病育种研究主要包括针对病原体进行干扰、针对内源病原体受体进行敲除、转入具有病毒抗原的基因以及诱导动物体内产生抗体4个方面。Denning等[30]通过基因敲除获得了4只PrP单等位基因敲除绵羊。Clements等[20]制备了转入羊髓鞘脱落病毒核衣壳蛋白基因的绵羊,在该绵羊血液中检测到了vvENV糖蛋白的抗体。Deng等[80]通过睡美人转座子将口蹄疫病毒VP1蛋白转入绵羊中,转基因绵羊在体外攻毒实验中表现出抗病能力。此外,TLR4基因也被转入绵羊中获得具有抗病能力的转基因绵羊[32]。

在生物医药或人类疾病模型制备方面,主要包括绵羊乳腺生物反应器制备药物或建立人类疾病模型绵羊。从20世纪90年代起,出现了多个转人凝血因子绵羊的报道,并可以在绵羊乳腺中获得人凝血因子,用于治疗血友病等血液疾病。2000年,McCreath等[31]将人α-1-抗胰蛋白基因定点整合在绵羊的COL1A1基因中,获得了首例基因打靶绵羊。人HTT突变体转基因绵羊的建立为人亨廷顿舞蹈症的研究提供了疾病模型[27,46]。在动物疾病模型领域,Denning等[30]获得的GGTA1敲除绵羊为异种器官移植的研究奠定了基础。Williams等[52]将TNSALP基因进行编辑,获得了模拟人HPP (Hypophosphatasia)综合征的绵羊模型。Vilarino等[53]获得了PDX1基因敲除绵羊,同样出现胰腺缺失的表型。Fan等[56]获得的CFTR基因编辑绵羊,表现出与人囊性纤维化相似的表型。Menchaca等[61]将otoferlin突变型通过Cas9介导的单链同源重组转入绵羊中,获得了耳聋模型的绵羊。Ma等[64]将褪黑激素(melatonin)基因转入绵羊中,获得了在乳腺中表达褪黑激素的转基因绵羊。

2.4 通过分子设计育种改善绵羊繁殖性能

绵羊的繁殖性状是羊实际生产中最受关注的性状。影响绵羊产羔的主效基因为FecB,即骨形态发生蛋白BMPR1B在A746G位置发生了氨基酸突变,该突变能显著提高绵羊的产羔能力[59]。目前已有Cas9介导的BMPR1B基因编辑绵羊[59,60],但其后代的产羔表型还未见报道。

除上述获得的已知功能的基因修饰绵羊,还有部分绵羊中定位清晰但功能不完全明确的主效基因,也可做为后续基因编辑的研究对象,如与产羔数相关的BMP15 (bone morphogenetic protein 15)、GDF9 (growth differentiation factor 9)等[81];与绵羊椎骨数相关的VRTN (vertebrae development homolog)基因[82];与改善肉质相关的MC4R (melanocortin-4 receptor)基因[83]和FABP4 (fatty acid-binding protein 4)[84]等。目前已经在绵羊中开展遗传修饰研究的基因及其相关功能见表4。这些研究为绵羊分子设计育种提供了可行的思路。

近年来,我国肉羊规模化养殖比例一直在提升,随着养殖方式的转变,生长快、繁殖能力强且饲料转化率高的舍饲肉羊品种将会愈发受市场认可。但生长、繁殖以及代谢这些性状均为多基因控制复杂性状,如何在传统育种理论基础上更好引入分子育种概念是需要探索的。一方面针对这些重要经济性状的部分功能明确的主效基因,可直接利用以上的遗传修饰方法快速获得性能突出的基因编辑动物做为育种新材料;另一方面对于目前尚不确定的功能位点,可以通过这些遗传修饰手段直接在目标动物中验证功能位点的有效性,进一步促进育种过程中分子标记辅助选择的准确度。

Table 4
表4
表4重要性状基因在基因修饰绵羊中的研究
Table 4Studies on crucial genes in genetically modified sheep
性状类型基因名称基因类型基因功能位点变化基因修饰绵羊(预期)表型参考文献
生长性状GH外源基因促进生长cDNA随机整合生长加快[6,18,19,21,22]
MSTN 内源基因抑制肌肉生长RNAi敲低或敲除敲除后肌肉量增加[15,17,45,
48~50,56]
SOCS2内源基因促进骨发育单碱基突变点突变体型增大,体重增加[57]
羊毛纤维CAT外源基因氯霉素抗性cDNA随机整合羊毛产量[26]
SLC7A11内源基因谷氨酸转移cDNA随机整合毛色变化[34]
FGF5内源基因调节毛发生长定点敲除(移码突变)敲除后毛产量增加[38,45]
ASIP内源基因黑皮质素拮抗剂定点敲除(移码突变)改变毛色[58]
IGF1外源基因生长调节cDNA随机整合外源基因表达后毛产量增加[78]
抗病抗逆vLRT/vvENV 外源基因ENV蛋白随机整合产生抗体[20]
TLR4外源基因炎症反应cDNA随机整合增强抗病能力[31,32]
VP1 shRNA外源基因口蹄疫病毒蛋白随机整合干扰口蹄疫病毒基因组[80]
繁殖性状hα1AT外源基因蛋白酶抑制剂Minigene随机整合外源基因表达[23]
hFIX 外源基因凝血cDNA随机整合外源基因表达[24,25]
HTT外源基因影响神经系统cDNA随机整合亨廷顿舞蹈症[27,69]
PPARγ内源基因脂肪沉积cDNA随机整合增加肌间脂肪[35]
LPL内源基因脂肪沉积cDNA随机整合增加肌间脂肪[36]
TNSALP 内源基因降低碱性磷酸酶活性单碱基突变人HPP综合征模型[52]
PDX1内源基因胰腺发育定点敲除(移码突变)敲除后胰腺缺失[53]
CFTR 外源基因膜信号转导调节定点敲除(移码突变)囊性纤维化模型[55]
BMPR1B 内源基因卵泡发育定点重组插入增加产羔数[59]
otoferlin 外源基因听力形成定点重组插入耳聋模型[61]
ASMT外源基因褪黑激素合成cDNA随机整合过表达增加褪黑激素表达量[64]
基因表达Rosa-26友好位点无定点插入外源基因插入后稳定表达[54]

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与猪(Sus scrofa)相比,绵羊中进行遗传修饰的研究无论在数量和质量上都比较低。其原因首先在于两个物种的养殖数量和研究重要性方面差距较大;其次从技术层面,猪为多胎动物且养殖规模较大,卵母细胞相对容易获得,体外培养体系更成熟,且细胞对体外环境的耐受性更好;另外猪的遗传修饰模型除了涉及畜牧业,还常作为疾病模型或器官移植来源延伸到医学研究领域,因此更多的团队以猪为研究对象。相比较而言,绵羊繁殖能力低于猪,较难获得大量的卵母细胞。目前在绵羊中进行遗传修饰操作的目的主要为品种遗传改良,在疾病模型等领域研究较少。但是,绵羊也是医学中神经生物学以及脊柱发育研究等方面的良好研究对象,未来的绵羊分子设计育种研究也可以更多的应用于建立医用模型。

3 遗传修饰技术在绵羊中应用的问题及展望

分子设计育种代表着未来种业的发展方向,近年来在遗传修饰技术方面发展迅速,但总体看来家畜分子育种尤其是绵羊分子育种的研究还处于初级阶段,距离商业化以及实际生产还有较长路要走。其中的问题主要包括功能基因研究不够明确,生产效率低且成本高,生产周期长以及较难通过生物安全评价等。

3.1 功能基因选择和表达调控研究不够明确

分子生物学和基因组学研究经过几十年的迅猛发展,已经取得了瞩目的成就,但是对于畜禽大动物尤其是绵羊而言,由于基因组的解析、基因功能的挖掘以及基因表达调控模式探究等方面的研究远远落后于人类以及模式动物,只有极少数性状被定位到了致因突变并阐明了遗传机理。而且绵羊和其他家畜的重要经济性状大多为数量性状,这类性状存在多基因协同或拮抗表达或者存在印记效应等,导致遗传操作的难度较大。传统的转基因方法的随机插入可能造成表达不稳定,影响其他基因的表达;生长相关基因敲除或突变,会造成动物瘫痪或器官发育异常;繁殖相关基因突变,会造成母畜不育或难产等。这些问题仅通过革新基因编辑技术并不能从根本上解决。在畜禽大动物上,可以通过可靠的遗传资源群体、准确的表型数据测定并结合现有的大数据进行遗传定位分析,同时利用分子生物学手段解析致因基因及突变的调控机理,最终利用合理的基因编辑手段获得分子设计个体。但这个过程周期长且耗费大,需要团队合作。目前,已发现的可能影响绵羊表型的基因及其相应的功能突变见表5。


Table 5
Table 5Identified genes and functional mutations that may affect phenotypes of sheep

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3.2 制备遗传修饰动物的生产效率低且成本较高

在绵羊、山羊(Capra hircus)和猪等大动物中,无论是通过显微操作技术还是体细胞核移植技术制备遗传修饰动物,都存在效率偏低的问题。通过显微注射方法获得基因编辑个体时,会存在产生的基因编辑个体嵌合现象,即产生的基因编辑后代个体中包含不同的基因型。其原因在于受精卵注射核酸后,没有立即对胚胎进行编辑,而在胚胎卵裂后才对不同细胞各自进行编辑而产生不同的基因型,因此,应尽快在受精后立即进行显微注射,以提高胚胎发育早期发生基因编辑的概率,从而降低产生嵌合后代的概率。此外,对注射核酸的总量及浓度也需要优化调整。在绵羊、山羊和猪中通过显微注射获得遗传修饰动物的效率均可达到10%以上甚至更高,而体细胞核移植技术克隆效率低,且去核过程会对细胞质造成较大损伤。通过克隆胚胎获得基因编辑绵羊、山羊和猪的效率往往不超过5%,实验获得绵羊、山羊和猪个体的效率统计见表6。

Table 6
表6
表6在绵羊、山羊和猪中进行显微注射或体细胞核移植获得个体的比率统计
Table 6Rates of offspring generated by microinjection or SCNT in sheep, goats and pigs
物种方法基因遗传修饰类型移植胚胎数/
受体数/怀孕		基因编辑后代/
所有后代		获得后代
比率(%)		参考文献
绵羊原核注射hGH随机整合1032/192/-1/737.1[6]
hFⅨ随机整合67/24/116/710.4[10]
oGH随机整合408/109/394/4410.7[18]
bGH; hGHRF随机整合842/98/33; 435/120/512/47; 9/635.6; 14.5[21]
bGH; hGRF随机整合247/-/4211/4217.0; 9.4[22]
hα1AT随机整合549/152/735/11320.6[23]
hBCFVIII随机整合1145/454/27613/43437.9[25]
CAT随机整合371/76/-4/318.4[26]
HTT 随机整合413/138/-6/15036.3[27]
MSTN Cas9敲除213/55/312/3516.4[50]
MSTN、ASIP和BCO2Cas9敲除578/82/7735/367.3[51]
SOCS2 BE3点突变53/8/33/47.5[67]
ASIPCas9敲除92/60/65/66.5[58]
BMPR1BCas9点突变279/39/167/217.5[59]
FGF5 基因敲除100/53/143/1818[62]
FGF5 基因敲除63/43/1820/2336.5[63]
徒手克隆fat-1随机整合53/29/43/35.7[80]
体细胞
核移植		AAT定点插入80/42/2013/1417.5[31]
oTLR4随机整合859/113/12; 1009/108/79/90.7; 0.3[32]
fat-1随机整合128/16/3; 147/20/35/51.6; 2.0[33]
MSTN TALEN敲除70/5/11/11.4[48]
MSTN TALEN敲除282/37/2813/231.4[49]
山羊原核注射MSTNCas9敲除416/137/6426/9322.4[85]
MSTNCas9敲除18/5/31/422.2[86]
FGF5BE3点突变22/7/35/522.7[87]
BLG (β-lactoglobulin)Cas9敲除103/67/18425.2[88]
GDF9Cas9敲除56/17/136/832.1[89]
山羊原核注射MSTNTALEN敲除403/29/73/30.7[90]
MSTNCas9敲除269/21/73/32.2[91]
EDAR (ectodysplasin receptor)Cas9敲除257/79/52/62.3[92]
猪体细胞
核移植		-纯体细胞克隆586/10/20/71.2[93]
LDLR (low-density lipoprotein
receptor)		敲除2276/18/957/572.5[94]
PPARγZFN敲除1134/8/42/100.2[95]
GGTA1TALEN敲除2411/12/930/301.2[96]
FBXO40Cas9敲除5424/16/717/170.3[97]
CD163Cas9敲除2192/6/426/261.2[98]
显微注射DMD (henne muscle dystrophy)Cas9敲除98/8/11/22.0[99]
TMPRSS2 (ransmembrane protease,
serine S1, member 2)		Cas9敲除135/2/212/128.8[100]
SRY (sex determining region Y)Cas9敲除66/4/212/1218.2[101]
NANOS2Cas9敲除84/4/318/1821.4[102]
GGTA1Cas9敲除94/4/24/1516.0[103]

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为了提高遗传修饰动物的效率,找到引发效率低下的原因是关键。不同动物物种之间,影响遗传修饰的因素以及阳性个体获得效率存在显著差异。研究显示,体细胞核移植制备克隆动物的主要障碍包括移植后胚胎存活率低且容易流产,其主要原因为体细胞重编程过程中的多种表观修饰障碍。在猪中,RTL1 (retrotransposon-like-1)的甲基化异常是以猪诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS)为供体时克隆成功与否的重要影响因素,RTL1的敲除和代偿实验证明克隆动物的关键因素在于RTL1的表达是否正常[104]。制备克隆猴(Macaca fascicularis)的难点也在于胚胎发育过程中的甲基化修饰,例如存在H3K9三甲基化,当添加了H3K9me3去甲基化酶KDM4D和组蛋白去乙酰化酶HDAC抑制剂TSA后,获得了世界首例体细胞克隆猴[105],表明在克隆猴过程中在培养体系中添加表观遗传修饰的抑制剂可以提高克隆效率。在克隆猴制备过程中供体细胞的选择也比较关键,使用卵丘细胞做供体的克隆猴出生后不久便死亡,而使用胎儿成纤维细胞做供体时获得了存活的克隆猴。此外,外源因子对重构胚的发育也有影响。褪黑激素是一种抗氧化剂,具有清除活性氧的作用,通过调节氧化应激,可减少DNA损伤,在体细胞核移植的胚胎发育液中添加褪黑激素等可以提高猪重构胚的发育潜能,进而提高克隆效率[106]。在绵羊中,也有通过在供体细胞培养过程中添加表观修饰抑制剂KDM4D提高克隆胚胎体外发育能力的报道[107],表明表观修饰对动物克隆胚胎发育的影响存在普遍性,通过改善这些影响,可以提高获得克隆动物的效率。要根本解决克隆效率低的问题,对大动物胚胎发育过程调控方式以及关键效应通路等的基础研究至关重要。

在实验操作方面,现有的受精卵电转染系统可以将sgRNA及Cas9的mRNA共转入受精卵中,并通过Cas9作用对受精卵进行编辑,这是获得基因编辑动物的简化方法[108]。显微操作和体细胞核移植过程需要的显微操作设备,成本较高,同时需要专门的技术人员操作,增加了培训和时间成本。对于提供受体动物的实验场,需要专门预留一定数量的优质后备母羊,在饲养成本上有所增加。

3.3 基因编辑新品种的生物安全评价和应用

通过分子设计育种获得的家畜要实现商业化所面临的最大问题为生物安全评价。以CRISPR/Cas系统代表的人工核酸酶介导的基因编辑技术已经成为遗传修饰的主流方法。我国对基因修饰动植物(包括转基因和基因编辑)的生物安全评价非常严格,目前在我国批准上市的只有抗番木瓜环斑花叶病毒(papaya ringspot virus)的转基因木瓜(Carica papaya)和抗棉铃虫的转基因棉花(Gossypium hirsutum)。转基因生物安全主要针对遗传修饰动植物是否会破坏生态平衡,是否会影响人们的健康等方面进行评价。目前还没有确切的证据证实基因修饰动植物在生物安全方面有安全隐患。例如转基因牛产生的重组乳铁蛋白饲喂小鼠实验中,长期的饲喂未使小鼠出现显著的临床症状和行为异常[109]。遗传修饰生物的排泄物是否会对环境产生威胁也未有定论。即便如此,仍然需要制定完善的评价体系,针对食物毒性、过敏性、抗生素及营养成分代谢等方面进行安全评估。虽然基因编辑技术等遗传修饰方法在育种应用中受到了争议,但不可忽视其巨大的应用前景。在有严格的生物安全评价为保障基础上,分子设计育种代表着未来家畜育种的发展方向,能够促进畜牧业发展。

目前,由于生物安全评价的限制,通过遗传修饰育种获得的动物品种目前很难开展大规模的育种研究,更不可能实现商业化。美国食品药品监督局分别在2009年、2014年和2015年批准了基因修饰山羊、兔(Oryctolagus cuniculus)和鸡生产的药物上市,而真正得以进入食品领域的遗传修饰动物仅为2015年批准的转生长激素三文鱼(Oncorhynchus)和2020年批准的α-gal敲除的基因编辑猪。目前批准上市的品种仅仅是众多研究成果的冰山一角,期望未来有越来越多的分子育种动物产品走进人们的视野。

在绵羊和其他农业动物中,仍然存在大量的遗传变异位点未被解析。在未来的研究中,需要对适合育种的重要经济性状位点进行持续挖掘并结合不断改进的分子设计育种工具,创制和培育出能够满足人们健康生活质量需求的动物新品种。

(责任编委: 姜雨)

参考文献 原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
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