0 引言
【研究意义】我国东北黑土带是世界三大黑土带之一,其养分丰富,有机质含量高,是我国重要商品粮生产基地,以20%的耕地生产出全国30%的粮食,对我国粮食安全起着举足轻重的作用。由于长期不合理施肥和耕作,东北黑土农田质量日益退化,包括存在土壤酸化、土壤养分发生变化、土层变薄以及土壤微生物活性降低等一系列问题[1]。丛枝菌根（Arbuscular mycorrhizae,AM）真菌是土壤中重要微生物类群之一,广泛分布于自然界土壤中,能够与陆地上大约80%的植物根系形成共生关系[2]。这种共生关系的维持一方面依赖于植物提供光合产物（主要是六碳糖）供AM真菌生长和代谢[3,4],另一方面AM真菌能够促进植物对于土壤中营养元素的吸收（尤其是磷、氮元素）,提高植物对于病原菌的抗性和抗干旱能力等[5,6],在农业可持续发展中具有重要作用[7]。因此,开展长期施肥条件下东北黑土中AM真菌群落组成研究,能为进一步认识AM真菌对化肥的响应机制,以及改进施肥和耕作制度提供依据。【前人研究进展】研究表明长期不合理农艺措施（如长期过量不合理施肥）已经使土壤中养分含量发生显著改变[1,8]。郝小雨等[9]研究表明,长期施肥提高了土壤中全氮、可溶性有机氮等养分含量。丁建莉等[10]研究连续施肥长达36年的我国东北黑土发现,施用化肥或有机肥等显著提高了土壤有机质、速效磷、全氮等养分含量;养分含量变化将导致土壤中AM真菌和植物的共生关系发生改变。根据功能均衡模型理论（the functional equilibrium model）,当土壤中养分含量发生改变时,植物将光合作用产生的能量物质分配给能够给植物提供其他限制性物质的物种[11]。张旭红等[12]研究了黑龙江海伦长期定位培肥试验地黑土中AM真菌群落结构的变化,结果表明随着土壤肥力的提升,AM真菌的丰度和密度均呈增加趋势,而当肥力提高到一定程度后土壤中AM真菌的丰度和密度开始下降。土壤中单施氮肥或磷肥能够降低土壤中AM真菌数量、物种丰富度和多样性[7,13-15]。另外,氮肥对AM真菌群落的影响受土壤中有效磷的影响,氮肥在磷缺乏时能够提高土壤中AM真菌丰富度和多样性,而在磷丰富时降低[16,17]。但是研究多集中在根内AM真菌,而对土壤中AM真菌的涉及较少。CESARO等[18]的研究表明,土壤中AM真菌物种多样性和丰度高于植物根内,说明植物根内AM真菌只是土壤AM真菌的一部分。另外,研究表明土壤中微生物受土壤环境因子的影响。如本课题组以东北黑土为研究对象,发现长期施用化肥降低了黑土中细菌和真菌的多样性,改变了土壤中细菌和真菌的群落组成,影响东北黑土微生物群落结构的主效环境因子是土壤pH[1,19]。杨海水等[20]综述了影响AM真菌群落结构的影响因素,发现环境因子,寄主植物以及土壤类型是影响AM真菌群落结构的主要因素。【本研究切入点】近年来,在国家日益重视东北黑土地保护的背景下,人们加快了对东北黑土的研究。与我国南方酸性红壤相比,东北黑土的酸化是由长期施用化学肥料导致的,且土壤有机质含量较高,由土壤提供的养分元素水平也较高。然而,长期施肥对肥沃的黑土中AM真菌群落组成的影响以及影响AM真菌群落结构的主要因素未见报道。【拟解决的关键问题】本研究选取5种不同施肥处理的黑土耕层土壤为研究对象,采用Illumina Miseq测序平台,探讨长期连续施用氮肥和氮、磷混施东北黑土AM真菌多样性和群落组成的变化及其与土壤理化性质的关系。本研究的开展有助于了解长期施肥条件下,土壤中AM真菌群落组成变化规律,为优化该地区农田施肥制度,提高土壤肥力,维护农业可持续发展等方面提供依据。1 材料与方法
1.1 试验地概况
试验田位于黑龙江省哈尔滨市农业部黑龙江耕地保育与农业环境科学观测站（45°40′N,126°35′E）,海拔151 m,年降水量533 mm,年平均气温3.5℃,属松花江二级阶地,地势平坦,土壤类型为黑土。长期定位试验从1980年起按小麦-大豆-玉米顺序轮作,每年种植一季,到2016年为第37个生长季,小麦茬。本研究选择5个处理：CK（不施肥处理）,N1（单施常量氮肥）,N1P1（混施常量氮肥和磷肥）,N2（单施2倍常量氮肥）,N2P2（混施2倍常量氮肥和磷肥）。各小区面积36 m2（9 m×4 m）,氮、磷肥分别为尿素和重过磷酸钙。氮、磷肥小麦和玉米季施用量为150 kg N·hm-2·a-1和75 kg P2O5·hm-2·a-1。氮、磷肥大豆季施用量为75 kg N·hm-2·a-1和150 kg P2O5·hm-2·a-1。氮、磷肥均为秋施肥（玉米季氮肥50%秋施,50%于玉米大喇叭口期追施）。1.2 样品采集
土壤样品采集于2016年6月29日（小麦正处于灌浆期）,在无根区域采集0—20 cm的耕层土壤。每个小区随机取10个点,充分混匀后作为该施肥处理的一个样品,每个处理3个重复。试验共采集15个样品,每个样品一部分于-80℃保存,用于分子生物学分析,一部分于室温下风干、研磨并过2.0 mm筛,用于土壤理化性质的测定。1.3 土壤理化指标的测定
土壤pH参照鲁如坤[21]的方法（土水比1:1）测定。土壤有机质含量测定采用重铬酸钾容量法[22],土壤全氮采用凯氏定氮法测定[22],速效钾采用乙酸铵浸提-原子吸收火焰光度法[1],有效磷采用NaHCO3浸提-钼锑抗比色法[10],硝态氮、铵态氮采用2 mol·L-1 KCl浸提,然后利用流动分析仪测定。
1.4 土壤总DNA提取与高通量测序
总DNA提取采用Power Max Soil DNA Isolation Kit试剂盒（MOBIO,USA）,每个样品称取0.25 g土壤,依照试剂盒说明书提取土壤总DNA。所提取的土壤总DNA经1%琼脂糖凝胶电泳测定DNA完整性,Nano Drop测定DNA纯度和浓度。15个样品的AM真菌DNA采用巢式PCR扩增。第一对引物包括LR1（5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GA-3′）,FLR2（5′-GTC GTT TAA AGC CAT TAC GTC-3′）[23];第二对引物包括FLR3（5′-TTG AAA GGG AAA CGA TTG AAG T-3′）,PLR4（5′-TAC GTC AAC ATC CTT AAC GAA-3′）[24]。第二对引物包括接头A、B和样品识别序列。两轮PCR扩增体系都包括：5 μL 10×Pyrobest缓冲液,4 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1）,上下游引物各2 μL（10 μmol·L-1）,0.75 U Pyrobest DNA聚合酶和30 ng模板DNA。扩增条件参照前人研究方法[7],两轮扩增条件均为98℃预变性5 min,98℃变性45 s,58℃退火50 s,72℃延伸45 s,30个循环,72℃延伸10 min。制备Amplicon文库后,应用Illumina MiSeq PE250平台进行测序。1.5 数据处理和分析
通过Illumnia Miseq平台测序所得的下机数据经过QIIME（v1.8.0）软件进行质量控制[7]。具体过程为：去除质量值低于20的序列;根据序列间的重复序列（overlap）将序列进行拼接;去除引物序列,并根据GenBank数据库检测并去除嵌合体,获得高质量序列。利用CROP软件将核苷酸相似度大于97%的序列作为一个分类操作单元（OTU）[25],利用GenBank数据库对物种进行注释,并去除非AM真菌序列和所有处理中只有一条序列的OTU[26],将所有样品序列进行抽平（Subsample）。根据不同AM真菌类群在该样品所占的比例计算AM真菌类群相对丰度。利用Mothur软件（V1.31.2）计算样品α多样性。数据分析利用Excel 2010,SPSS 19.1和Conoco5.0软件进行。利用单因素方差分析（ANOVA,Tukey’s test）分析不同处理间理化性质、α多样性以及AM真菌相对丰度差异。基于Bray-Curtis相似距离,运用非度量多维度分析（non-metric multidimensional scaling,NMDS）对东北黑土中AM真菌β多样性进行分析。采用R（v3.1.1）软件包中的ANOSIM分析不同处理间AM真菌群落结构的差异显著性,并采用冗余分析（RDA）进行土壤理化性质和AM真菌群落组成的关系分析。
2 结果
2.1 长期施用氮、磷肥对土壤理化性质的影响
连续施用氮肥以及氮、磷肥混施显著改变黑土理化性质（表1）。与对照（不施肥）相比,长期施肥显著降低土壤pH（P<0.05）,且随着氮肥施用量的增加,pH降低幅度增加,特别是施2倍常量氮肥处理（N2和N2P2）,pH分别降低至5.01和4.90,降低了1.83和1.94个单位。与对照处理相比,单施氮肥处理,土壤有效磷含量变化不显著（P>0.05）,而氮、磷混施显著提高土壤有效磷含量。长期施用氮肥以及氮、磷肥混施显著降低土壤速效钾含量,提高土壤全氮、铵态氮、硝态氮和土壤有机质含量,特别是施用2倍常量氮肥处理,其全氮、铵态氮、硝态氮和土壤有机质含量显著高于施常量氮肥处理和不施肥处理。Table 1
表1
表1不同施肥处理土壤理化性质
Table 1Properties of soil samples under long-term fertilizer regimes
| 处理 Treatment | pH (1:1 H2O) | 有效磷 Available P (mg·kg-1) | 速效钾 Available K (mg·kg-1) | 全氮 TN (g·kg-1) | 铵态氮 NH4+-N (mg·kg-1) | 硝态氮 NO3--N (mg·kg-1) | 有机质 SOM (g·kg-1) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CK | 6.84 ± 0.05a | 13.3 ± 2.9c | 139.9 ± 10.7a | 1.42 ± 0.01c | 16.84 ± 2.01c | 1.52 ± 0.37c | 27.94 ± 0.06b |
| N1 | 5.69 ± 0.12b | 8.9 ± 3.6c | 107.9 ± 4.7bc | 1.45 ± 0.04bc | 22.92 ± 1.64c | 2.55 ± 0.61c | 28.18 ± 0.06b |
| N1P1 | 5.84 ± 0.21b | 76.9 ± 16.1b | 114.7 ± 6.2b | 1.51 ± 0.03ab | 30.86 ± 3.98b | 3.19 ± 0.80c | 29.34 ± 0.11ab |
| N2 | 5.01 ± 0.08c | 11.2 ± 0.8c | 93.4 ± 7.4cd | 1.54 ± 0.02a | 47.87 ± 1.11a | 16.44 ± 1.54b | 28.74 ± 0.05ab |
| N2P2 | 4.90 ± 0.03c | 233.3 ± 9.8a | 80.7 ± 4.4d | 1.58 ± 0.03a | 49.35 ± 2.62a | 21.97 ± 1.66a | 30.31 ± 0.06a |
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2.2 长期施用氮、磷肥对土壤AM真菌群落组成和多样性的影响
通过高通量测序共产生238 113条高质量序列,平均每个样品含有15 874条,所有序列共归为259个OTUs,其中128个OTUs是非AM真菌序列,非AM真菌的序列数仅占总序列的4.1%。所有样品覆盖度指数（good’s coverage value）在97%相似度下均大于99%,说明测序深度已足够评价该土壤AM真菌群落组成和多样性。在科水平上（图1）,主要AM菌包含4个科,分别为球囊霉科（Glomeraceae）（13.21%—64.53%）、Claroideoglomeraceae（2.66%—22.70%）、巨孢囊霉科（Gigasporaceae）（0.28%—29.65%）和类球囊霉科（Paraglomeraceae）（0.03%—3.47%）。ANOVA分析表明,长期施用氮肥以及氮、磷肥混施显著改变AM真菌群落的组成。其中,长期氮、磷添加显著降低Glomeraceae,且其丰度在单施氮肥处理比氮、磷肥混施处理丰度低;而单施氮肥处理的Gigasporaceae和Paraglomeraceae相对丰度比氮、磷肥混施处理高;Claroideoglomeraceae相对丰度在N1P1处理中较高,而其他处理低于对照。在属水平上（图2）,主要AM菌包含7个属,其中Rhizophagus和Septoglomus在各施肥处理间没有显著差异（图2-e、图2-f）,而球囊霉属（Glomus）、近明球囊霉属（Claroideoglomus）、巨孢囊霉属（Gigaspora）和类球囊霉属（Paraglomu）相对丰度在各处理间具有显著差异。与对照处理相比,长期施肥降低了管柄囊霉属（Funneliformis）和Septoglomus菌属相对丰度,而提高了Paraglomu的相对丰度。同时,在氮肥基础上添加磷肥对AM真菌群落组成也具有显著的影响,如Glomus和Funneliformis相对丰度在N1P1和N2P2处理中高于N1和N2处理;而Gigaspora和Paraglomu则表现出相反的特征。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1不同施肥处理中AM真菌组成（科水平）
**表示在5种不同施肥处理中AM真菌相对丰度达到极显著（P<0.01）,*表示在5种不同处理中AM真菌相对丰度达到显著（P<0.05）。下同
-->Fig. 1Relative average abundances of AM fungi under different fertilization (family level)
** indicates the relative abundance of AM fungi was significant difference at 0.01 level among 5 fertilizer regimes; * indicates the relative abundance of AM fungi was significant difference at 0.05 level among 5 fertilizer regimes. The same as below
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2不同施肥处理中AM真菌组成（属水平）
**表示不同处理中AM真菌相对丰度达到极显著（P<0.01）,*表示不同处理中AM真菌相对丰度达到显著（P<0.05）
-->Fig. 2Relative average abundances of AM fungi under different fertilization (genus level)
** indicates the relative abundance of AM fungi was significant difference at 0.01 level among 5 fertilizer regimes, * indicates the relative abundance of AM fungi was significant difference at 0.05 level among 5 fertilizer regimes
-->
长期施用氮肥以及氮、磷肥混施对AM真菌多样性的影响见表2。长期单施氮肥对AM真菌多样性指数（PD_whole_tree）,丰富度指数（Chao1）以及OTUs数量影响不显著（P>0.05）,说明长期单施氮肥对黑土中AM真菌多样性影响不大。但是氮、磷混施（N1P1和N2P2）降低土壤中AM真菌多样性,特别是N1P1处理显著降低土壤中PD_whole_tree指数,Chao1指数以及OTUs数量,其与对照相比,分别降低了16%、16%和15%（表2）。对不同氮、磷添加处理的AM真菌β多样性分析结果如图3所示,其中第一排序轴代表AM真菌38.54%群落组成变异,而第二排序轴代表AM真菌36.66%群落组成变异。施肥显著改变AM真菌群落组成,其中N1和N2处理的群落组成较为接近,而N1P1和N2P2处理的群落结果较为接近。ANOSIM分析表明,各处理间AM真菌群落组成差异达到显著水平（表3）,也再次证明N1和N2处理的AM群落组成较为相似,N1P1和N2P2群落结果较为接近,而对照与施肥处理之间的差异性较大。
Table 2
表2
表2不同施肥土壤中AM真菌α多样性
Table 2Effects of long-term fertilizer regimes on the OTUs, coverage, richness and diversity
| 处理 Treatment | 物种数OTUs Species OTUs | 丰富度Chao1 Richness Chao1 | 多样性PD_whole_tree Diversity PD_whole_tree |
|---|---|---|---|
| CK | 104 ± 5a | 109 ± 6a | 6.96 ± 0.41a |
| N1 | 103 ± 5ab | 109 ± 4a | 7.02 ± 0.45a |
| N1P1 | 88 ± 3c | 92 ± 3b | 5.85 ± 0.07b |
| N2 | 91 ± 7abc | 97 ± 10ab | 6.59 ± 0.55ab |
| N2P2 | 89 ± 7bc | 100 ± 2ab | 6.11 ± 0.21ab |
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3不同施肥处理中AM真菌群落组成NMDS（OTU水平）
-->Fig. 3Results of NMDS analysis based on Bray-Crutis distance at OTU level
-->
Table 3
表3
表3不同处理间AM真菌群落差异性分析
Table 3The AM fungal composition differentiation between different treatments under long-term fertilization
| 组别 Group | 差异性Differentiation | |
|---|---|---|
| 系数Coefficient (R) | 显著性Significance (P) | |
| CK vs N1 | 0.832 | 0.012 |
| CK vs N1P1 | 0.992 | 0.010 |
| CK vs N2 | 0.960 | 0.011 |
| CK vs N2P2 | 1.000 | 0.011 |
| N1 vs N2 | 0.568 | 0.021 |
| N1P1 vs N2P2 | 0.352 | 0.011 |
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2.3 AM真菌群落组成与土壤理化性质相关性
RDA分析结果如图4,土壤理化性质共解释62.94% AM真菌群落组成变化。第一排序轴解释群落变化的24.20%,而第二排序轴解释群落变化的19.49%。Monte Carlo检验显示,有效磷（F = 3.9,P = 0.007,解释量为19.6%）,土壤pH（F = 3.3,P = 0.007,解释量为20.2%）对AM真菌群落组成影响最显著。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4不同施肥处理土壤中AM真菌和土壤理化性质冗余分析（OTU水平）
AP（速效磷）,AK（有效钾）,pH,NH4+-N（铵态氮）,NO3--N（硝态氮）,TN（全氮）和SOM（有机质）
-->Fig. 4Redundancy analysis (RDA) between AM fungi and soil properties under different fertilization regimes (in OTU level)
AP (available P), AK (available K), pH, NH4+-N (soil concentration of NH4+), NO3--N (soil concentration of NO3-), TN (total nitrogen), and SOM (soil organic matter)
-->
3 讨论
3.1 氮肥对土壤AM真菌多样性的影响
本研究结果表明,长期单施氮肥没有显著改变土壤中AM真菌丰富度和多样性,这可能是AM真菌对施入土壤的氮肥反应不敏感造成的[19, 27]。然而,EGERTON-WARBURTON等[16]通过蔗糖密度梯度离心分离AM真菌孢子的研究方法发现（该方法灵敏度较低,仅能检测到相对丰度较高物种种类）,在磷缺乏的土壤中施用氮肥能够提高土壤中AM真菌丰富度和多样性,并且发现影响AM真菌多样性的主要因素是相对丰度较低的物种。在本研究中,高通量测序能够较全面检测到土壤中物种种类,包括相对丰度较低的物种,更能准确评价土壤中AM真菌多样性[1]。长期施用氮肥改变了土壤AM真菌群落结构。这可能是由于长期施肥降低了土壤中优势菌群的丰度,如与对照相比,Glomeraceae相对丰度在N1处理中降低了45.3%,在N2处理中降低了79.5%;而提高了土壤中非优势菌群的相对丰度,如Paraglomeraceae等。因此,37年连续单施氮肥改变了土壤中AM真菌群落结构,其通过降低优势菌群的丰度,提高非优势菌群丰度的方式影响AM真菌多样性,使东北黑土AM真菌α多样性保持稳定。3.2 氮、磷混施对土壤AM真菌多样性的影响
与CAMENZIND等[26]研究结论一致,长期氮、磷肥混施降低土壤中AM真菌α多样性。同时还与EGERTON-WARBURTON等[16]的研究结论一致,即在磷丰富土壤中,氮肥能够降低土壤AM真菌多样性。考虑到AM真菌的主要功能是促进植物对于土壤磷素的吸收[28],土壤中磷肥的添加使AM真菌-植物共生体系利益分配发生变化,植物会减少对AM真菌物质能量的分配[29],经过长期植物的选择作用,某些得不到足够能量的物种将被淘汰。然而,不同种类AM真菌的功能是相对保守的[30,31],土壤中AM真菌多样性降低说明土壤中AM真菌功能多样性降低。长期氮、磷添加改变土壤中AM真菌的群落组成。该结果和QIN等[15]长期向土壤中添加营养元素将改变土壤中AM真菌群落组成的研究结论一致。当植物缺乏某种元素时,植物会将其光合产物分配给能够帮助植物获得该元素的微生物[32]。在资源减少的情况下,能够高效获得光合产物的AM真菌将会增多,而获得光合产物效率低的AM真菌将会减少[33]。在本研究中,长期施用磷肥提高了土壤中有效磷的含量。Glomeraceae在N1P1和N2P2处理中的相对丰度比N1和N2高。这可能是因为Glomeraceae中许多种类（包括Glomus,Funneliformis）在磷缺乏的土壤中帮助植物吸收土壤中磷的作用较低[32],而在磷含量较高土壤中,能提高作物对于磷的吸收[34],并且只需要从寄主中获取少量光合产物[34,35]。另外,Funneliformis中一些物种,如Funneliformis mosseae具有较强磷耐受性,并且倾向于在有效磷含量较高土壤中生存[36]。因此,长期氮、磷肥混施提高了该AM真菌类群的生长。与Glomeraceae相反,Gigasporaceae和Paraglomeraceae相对丰度在有磷肥添加土壤中低于无磷肥添加土壤,该研究结果与LIN等[37]研究结果相同,说明在磷丰富的土壤中,植物会减少对该AM类群的能量投入,而在磷缺乏的土壤中,植物可能加大对Gigasporaceae和Paraglomeraceae的能量供应,从而获得更多的磷元素[31]。如Gigaspora、Paraglomu在磷缺乏土壤中可以提高植物对于磷素吸收,但是当土壤中有效磷含量提高时,植物不再需要其提供磷,尤其像小麦这种须根植物[38-39][40, 45]。
由于不同种类AM真菌的功能相对保守[31],AM真菌群落结构的改变不仅改变植物-AM真菌物质能量交换的效率,也将影响土壤中其他生物过程。例如,Glomeraceae对于病原菌的抗性高于Gigasporaceae[40]。在本研究中,长期施肥降低了Glomeraceae的丰度,说明长期施用化肥提高植物发生病害的可能性;与氮、磷肥混施相比,长期单施氮肥降低了Glomeraceae丰度,而提高了Gigasporaceae丰度,说明长期单施氮肥使植物发生病害的可能性高于氮、磷肥混施。
3.3 AM真菌群落结构与土壤理化相关性
在陆地生态系统中,影响AM真菌群落组成和分布的主要因素是土壤pH[41]。在本研究中,我们发现AM真菌群落组成与土壤pH具有较强的相关性（F = 3.3,P = 0.007）,这可能是因为土壤pH能够直接影响AM真菌生理状态、改变其生态位,并通过调节土壤养分的生物有效性等间接影响AM真菌群落[42]。另外,不同种类的AM真菌对土壤酸碱性的耐受不同,如Glomeraceae对酸性土壤比较敏感,长期施用氮、磷肥降低Glomeraceae的相对丰度[43]。RDA分析表明,东北黑土AM真菌除了受土壤pH的影响外,也受土壤有效磷含量的影响。研究已表明,土壤中AM真菌对土壤中磷的活化作用受土壤中有效磷的影响[7],因此,该研究结果能够指导我们合理施肥以及利用AM真菌提高作物产量。如Gigasporaceae和Paraglomeraceae可能在磷缺乏的土壤中对植物吸收土壤中磷发挥更大的作用[31]。。4 结论
长期单施氮肥对AM真菌多样性影响不大,氮、磷肥混施降低东北黑土AM真菌多样性;土壤pH和有效磷含量是导致土壤中AM真菌群落差异的主要因素。因此,长期施用氮、磷肥引起土壤理化性质发生改变,降低氮磷利用率,导致土壤养分流失,造成环境污染,有悖于节能减排目标;改变了黑土中AM真菌群落结构组成,使土壤中原有的氮磷循环发生改变。本研究结果为认识AM真菌在长期施肥土壤中的群落组成变化提供重要的参考,并为将来利用AM真菌提高土壤养分有效性提供依据。The authors have declared that no competing interests exist.
