0 引言
【研究意义】小麦是国内外谷物贸易的重要粮食作物,然而,为获取经济利益,跨地域交易中优质小麦经常被伪劣小麦替代,对消费者以及合法的生产商均带来较大的负面影响[1]。小麦产地溯源技术的建立,可有效协助政府监管、保护消费者利益、保障粮食安全。稳定同位素是用于小麦产地溯源的有效指标,研究小麦及其制粉产品中稳定同位素的组成特征及其在地域间、基因型间的变化规律,有助于扩大稳定同位素溯源指纹技术的应用范围,可为小麦产地溯源及小麦产业链追溯提供理论和技术支撑。【前人研究进展】由于光合过程中羧化酶对同位素的分馏效应以及气孔的扩散分馏效应不同, C3植物、C4植物和CAM植物的13C有明显区别。一般C3植物的δ13C=-23‰—-38‰,C4植物的δ13C= -12‰—-14‰,CAM植物δ13C值界于C3和C4植物之间[2]。另一方面,影响植物碳同位素分馏的气候环境因素有温度、降水、压力、光照、大气压及大气中CO2的碳同位素组成等[3]。因此,即使同一种植物,其体内碳同位素组成也因不同地域环境因素的差异而不同。目前,稳定碳同位素指纹溯源技术已被应用于谷物[4-6]、酒类[7-8]、果蔬[9-11]等植源性农产品的产地溯源中。动物通过食物链摄食不同种类不同配比的植物,使得碳同位素也在肉类[12-13]、奶类[14-16]、鱼类[17]等动物源性食品产地溯源中得以应用。植物中的氮取决于土壤中的氮池（硝酸盐和氨水）,而土壤中氮同位素组成取决于地理和气候条件,并与农业施肥有关,其通过影响矿化、硝化、氮的吸收和反硝化等生物转化过程,进而影响氮同位素分馏效应和氮的流失程度[18-19]。目前,用于小麦产地溯源研究的样品主要是全麦粉,BRANCH等[20]测定了来自美国、加拿大和欧洲小麦全麦粉中矿物元素含量（Cd、Se）与稳定同位素组成（δ13C、δ15N、208Pb/206Pb、207Pb/206Pb和87Sr/86Sr）,发现单独使用δ13C可完全区分3个不同地域来源的小麦样品。LUO等[21]测定来自澳大利亚、美国、加拿大以及中国江苏省和山东省的35份全麦粉样品,发现δ13C在不同地域间具有显著差异（P<0.05）,利用δ13C、δ15N同位素绘制二维分布图,能够明显区分不同地域间样品。全麦粉是由小麦籽粒粉碎制成,其稳定同位素组成表征籽粒中各种成分同位素的权重。小麦的主要消费途径是制成面粉,该过程还产生麸皮和次粉两类制粉产品。前人研究表明,矿物元素溯源指纹在麸皮、次粉和面粉间具有显著差异[22],而稳定同位素在不同制粉产品间是否存在分馏效应,不同产品中碳、氮同位素在地域间以及基因型间的表现是否一致,均为未知。【本研究切入点】小麦制粉产品中稳定同位素能否表征地域特征、进而应用于小麦产地及其自身的产地判别还不清楚,全麦粉与制粉产品中碳、氮同位素之间相关性的研究还未见报道。【拟解决的关键问题】以小麦为模式植物,设计模型试验,解析不同地域、不同基因型和不同制粉产品中碳、氮同位素的差异特征,明确全麦粉与制粉产品中碳、氮同位素的关系,为小麦及制粉产品的产地溯源提供理论参考。1 材料与方法
1.1 试验材料
2014年选择3种基因型小麦（邯6172、衡5229、周麦16）,分别种植于河北省石家庄赵县、河南省新乡市辉县和陕西省杨凌区3个试验点。每个地域3个基因型小麦随机排列,每个小区面积10 m2。试验田按照当地小麦基因型区域试验管理。2015年收获期在每个试验点每个小区随机选择3个点作为重复,每点收割1 m2,共采集小麦样品27份。样品信息见表1。Table 1
表1
表1各试验站地理位置、气象因子及田间措施
Table 1The geographic locations, climate factors and field management of each experiment field
| 地域 Location | 北纬 N latitude (°) | 东经 E longitude (°) | 海拔 Altitude (m) | 年降水量 Total precipitation (mm) | 温度 Temperature (℃) | 日照时间 Total sunshine (h) | 化肥 Fertilizer |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 赵县Zhaoxian | 37.83 | 114.82 | 39 | 136.4 | 10.4 | 1686.8 | 尿素（10 kg/667 m2）,磷酸二铵（20 kg/667 m2） Urea (10 kg/667 m2), diammonium phosphate (20 kg/667 m2) |
| 辉县Huixian | 35.39 | 113.83 | 82 | 221.2 | 11.5 | 1387 | 复合肥（90 kg/667 m2） Compound fertilizer (90 kg/667 m2) |
| 杨凌Yangling | 34.29 | 108.06 | 513 | 338.3 | 10.2 | 1236.5 | 尿素（25 kg/667 m2）,磷酸二铵（25 kg/667 m2） Urea (25 kg/667 m2), diammonium phosphate (25 kg/667 m2) |
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1.2 试验方法
1.2.1 样品前处理 将收获后小麦进行晾晒,手工脱粒,然后将小麦籽粒运往实验室进行前处理。挑出小麦籽粒中的石子、杂草等杂物,用去离子水反复冲洗干净,38℃烘箱内约24 h烘干至恒重。烘干样品用植物粉碎机粉碎,过100目筛,得到全麦粉样品。1.2.2 小麦制粉 称取300 g小麦籽粒样品,进行润麦。添加超纯水（Milli-Q,Millipore,USA）,调整衡5229和周麦16小麦含水率到14.5%,调整邯6172小麦含水率到15%,润麦时间24 h。采用实验性制粉机（LRMM8040-3-D,中国无锡锡粮机械制造有限公司）配合粉筛（LFS-30,中国无锡锡粮机械制造有限公司）分离小麦麸皮、次粉与面粉。麸皮和次粉样品用植物粉碎机粉碎,过100目筛,烘干备用。
1.2.3 样品测定 称取5 mg样品放入锡箔杯中,通过自动进样器进入元素分析仪（vario PYRO cube,Elementar,Germany）,通过燃烧与还原转化为纯净的CO2和N2气体,CO2再经过稀释器稀释,最后进入稳定同位素质谱仪（IsoPrime100,IsoPrime,UK）进行检测。具体的工作参数如下：
元素分析仪条件：燃烧炉温度为1 020℃,还原炉温度为600℃,载气He流量为230 mL·min-1。
质谱仪条件：分析过程中,每12个样品穿插一个实验室标样,IAEA600（δ13CPDB=(-27.771±0.043)‰,δ15Nair=(1.0±0.2)‰）对测定结果进行校正。
稳定同位素比率计算如下：
δ（‰）=（R样品/R标准-1）×1000
其中,R为重同位素与轻同位素丰度比,即13C/12C和15N/14N, δ13C的相对标准为V-PDB,δ15N的相对标准是空气中氮气。
测定时,δ13C和δ15N的连续测定精度<0.2‰。
1.3 数据处理及质量控制
用SPSS 18.0软件分别对数据进行单因素方差分析,Duncan多重比较分析,皮尔逊（Pearson）相关分析。2 结果
2.1 小麦及制粉产品中碳、氮同位素在地域间的差异
通过对不同地域全麦粉及不同制粉产品中碳、氮同位素进行单因素方差分析,结果表明,全麦粉及制粉产品中碳同位素在赵县与辉县/杨凌间有显著差异,氮同位素在不同地域间有显著差异（P< 0.05）（表2）。各类样品中碳同位素在不同地域间变化趋势一致,均为杨凌最高,赵县最低;各类样品中氮同位素在地域间变化趋势也一致,均为辉县>赵县>杨凌。小麦中氮同位素值与当地使用肥料的种类有一定关系,辉县施用复合肥（δ15N=（4.39±0.41）‰）,杨凌施用尿素（δ15N=（-6.89±0.03）‰）和磷酸二铵（δ15N=（-3.34±0.07）‰）,赵县施用尿素（δ15N=（-0.47±0.00）‰）和磷酸二铵（δ15N=（1.54±0.04）‰）。Table 2
表2
表2不同地域全麦粉及小麦制粉产品中的碳、氮同位素
Table 2δ13C, δ15N in wheat milling fractions among different regions
| 制粉产品 Milling fraction | 辉县 Huixian | 杨凌 Yangling | 赵县 Zhaoxian | |
|---|---|---|---|---|
| δ13C | 全麦粉 Whole wheat flour | -28.17±0.22a | -27.96±0.33a | -28.60±0.25b |
| 麸皮Bran | -28.87±0.11a | -28.78±0.19a | -29.41±0.40b | |
| 次粉Wheat shorts | -28.39±0.36a | -28.35±0.30a | -28.92±0.39b | |
| 面粉Flour | -28.00±0.15a | -27.87±0.22a | -28.35±0.39b | |
| δ15N | 全麦粉 Whole wheat flour | 4.42±0.50a | -3.83±0.46c | 1.38±0.65b |
| 麸皮Bran | 4.03±0.52a | -3.46±0.63c | 0.99±0.98b | |
| 次粉Wheat shorts | 3.83±0.46a | -3.91±0.63c | 0.86±0.86b | |
| 面粉Flour | 4.45±0.42a | -3.15±0.54c | 1.63±1.06b |
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2.2 小麦及制粉产品中碳、氮同位素在基因型间的差异
通过对不同基因型的全麦粉及制粉产品中碳、氮同位素进行单因素方差分析,结果表明,全麦粉、麸皮和面粉中碳同位素在3种基因型间无显著差异,次粉中碳同位素在邯6172和衡5229之间有显著差异;全麦粉及其他制粉产品中氮同位素在不同基因型间均无显著差异（表3）。Table 3
表3
表3不同基因型全麦粉及制粉产品中的碳、氮同位素
Table 3δ13C, δ15N in wheat milling fractions among different genotypes
| 制粉产品 Milling fraction | 邯6721 Han 6172 | 衡5229 Heng 5229 | 周麦16 Zhoumai 16 | |
|---|---|---|---|---|
| δ13C | 全麦粉 Whole wheat flour | -28.12±0.14a | -28.41±0.34a | -28.21±0.56a |
| 麸皮Bran | -28.89±0.10a | -29.12±0.38a | -29.04±0.56a | |
| 次粉Wheat shorts | -28.16±0.51a | -28.82±0.29b | -28.54±0.50ab | |
| 面粉Flour | -27.86±0.15a | -28.21±0.31a | -28.16±0.44a | |
| δ15N | 全麦粉 Whole wheat flour | 0.58±3.28a | 0.44±3.60a | 0.15±5.53a |
| 麸皮Bran | 0.30±3.15a | 0.32±2.81a | 0.93±3.92a | |
| 次粉Wheat shorts | 0.15±3.30a | 0.06±2.89a | 0.57±4.04a | |
| 面粉Flour | 0.88±3.24a | 0.69±2.92a | 1.33±3.94a |
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2.3 小麦制粉产品间碳、氮同位素差异
图1表示全麦粉与制粉产品中碳、氮同位素分布,以及单因素方差分析多重比较结果。其中全麦粉碳同位素处于中间,平均值为-28.24‰,变幅为-28.90‰—-27.44‰,面粉碳同位素最高,平均值为-28.07‰,变幅为-28.71‰—-27.57‰,麸皮碳同位素最低,平均值为-29.02‰,变幅为-30.02‰—-28.54‰。全麦粉、次粉及麸皮中碳同位素存在显著差异,其中麸皮和次粉中碳同位素相对贫化。尽管全麦粉与面粉中碳同位素无显著差异,但面粉中碳同位素平均值高于全麦粉,略显富集。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1小麦制粉产品中稳定碳（A）、氮（B）同位素组成每个盒须图内,*代
-->Fig. 1δ13C (A) and δ15N (B) of different milling fractionsFor each box plot,* represents the 1th and 99th percentiles, whereas whiskers above and below the box indicate the 10th and 90th percentiles. The boundaries above and below the box indicate the 25th and 75th percentiles, the solid line and within the box mark the median and the mean. a-c different letters above the box mean significant differences among different milling fractions (P<0.05)
-->
氮同位素在不同制粉产品间无显著差异。全麦粉、麸皮、次粉及面粉的氮同位素变幅分别为-4.50‰—5.15‰、-4.20‰—4.79‰、-4.66‰—4.56‰及-3.92‰—5.10‰。
2.4 小麦及制粉产品碳、氮同位素的相关性
为了研究全麦粉与不同制粉产品中碳、氮同位素的关系,对数据采用皮尔逊相关分析（表4）。结果表明,全麦粉与不同制粉产品中碳、氮同位素均呈极显著正相关（P<0.01）,3类制粉产品之间碳、氮同位素也呈极显著正相关（P<0.01）。Table 4
表4
表4小麦及制粉产品中碳、氮同位素相关分析系数表
Table 4Correlation coefficient of δ13C and δ15N of different wheat milling fractions (n=27)
| 麸皮 Bran | 次粉 Wheat shorts | 面粉 Flour | |
|---|---|---|---|
| 次粉 Wheat shorts | 0.839** | ||
| 0.997** | |||
| 面粉 Flour | 0.877** | 0.825** | |
| 0.997** | 0.998** | ||
| 全麦粉 Whole wheat flour | 0.843** | 0.845** | 0.840** |
| 0.983** | 0.988** | 0.986** |
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利用3类不同制粉产品与全麦粉碳、氮同位素进行线性回归分析（图2）,结果表明,麸皮、次粉及面粉的碳同位素与全麦粉碳同位素线性拟合均较好,3条拟合线近似平行,且所有次粉样品位于面粉与麸皮之间。3种制粉产品的氮同位素与全麦粉氮同位素拟合效果优于碳同位素,3条拟合线相互间隔较近,次粉与麸皮存在部分交叉,进一步说明不同制粉产品氮同位素差异较小。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2小麦中碳（A）、氮（B）同位素与制粉产品的线性回归分析
-->Fig. 2Linear fittings of δ13C (A) and δ15N (B) between whole wheat flour and milling fractions
-->
3 讨论
小麦作为C3植物,其叶片碳同位素组成可表示为δ13Cplant=δ13Cair-a-(b-a)Ci/Ca[23],表明小麦碳同位素主要受大气CO2的δ13C值、叶片内外CO2分压比的影响。大气CO2的碳同位素值有随纬度升高而增大的趋势[24],而本研究中纬度最低的杨凌小麦体内碳同位素最高,因此其变异来源主要是叶片内外 CO2分压比。小麦碳同位素表现为随海拔升高而增大的趋势,该结果与前人研究一致[25-26],然而,海拔对植物δ13C的影响是多种环境因素综合作用的结果。海拔高度的变化引起降水量、光照、温度、大气压等环境因素的变化,从而改变叶片形态、生理特性及光合气体交换,最终影响植物δ13C值的大小。其中,碳同位素有随湿度的降低而增加,随光照的增强而增大的趋势[3],但以上趋势均未在本研究中显现,可能由于3个地点降水量、湿度和光照强度的变化较小,不足以引起碳同位素变化。因此,本研究中海拔升高主要引起CO2浓度和大气压的降低,导致植物的Ci/Ca值减小,从而导致小麦体内碳同位素的增加。比较不同地域小麦及化肥中氮同位素组成可知,氮同位素在不同地域间的差异主要受到栽培措施的影响,且受肥料影响较大。一方面化肥的种类不同,氮同位素值不同[27-28]。辉县复合肥的氮同位素显著高于杨凌和赵县施用的尿素和磷酸二铵;即使同一种化肥,生产厂家不同,也具有不同的氮同位素值[29]。杨凌地区小麦施用的尿素和磷酸二铵中氮同位素值均低于赵县小麦施用的这两类化肥的氮同位素值。此外,在一定氮浓度内,有机氮肥输入越多,植物体内的氮同位素随之升高;无机氮肥输入越多,植物体内的氮同位素随之降低[29]。LIM等[30]研究不同氮肥处理对盆栽大白菜和菊花中氮同位素的影响,发现未施肥的白菜和菊花中氮同位素值均显著高于施用尿素处理。本研究中3个试验地点中杨凌施肥量最高,也可能是导致当地小麦体内氮同位素更为贫化的原因之一。
前人研究表明,小麦籽粒碳同位素受基因型影响显著 [31-32],并与植物本身的抗旱性和水分利用效率有关[33]。而本研究中全麦粉、面粉及麸皮的碳同位素在不同基因型间无显著差异,可能由于所选的3个小麦品种间碳同位素本身差异较小所致。
在实际的制粉工艺中,麸皮、次粉和面粉中各组分含量因不同的润麦加水量、润麦时间、剥刮力度而略有不同。麦麸约占小麦籽粒的22%—25%,主要由果皮、种皮、糊粉层、少量胚和胚乳组成;次粉约占小麦籽粒的5%左右,其中胚乳高于麸皮而低于面粉,糊粉层的含量高于麸皮和面粉[34-35];面粉主要由胚乳磨制而成,富含淀粉。本研究结果表明,制粉产品相对全麦粉碳同位素产生不同程度的贫化或富集。其中,麸皮和次粉碳同位素相对贫化,可能是由于二者相对于面粉具有较多的纤维素和木质素;另一方面,面粉中碳同位素略显富集,主要由于面粉富含淀粉,前人研究表明淀粉中碳同位素高于木质素和纤维素中碳同位素值[36]。同一品种小麦次粉中的纤维素、木质素和淀粉含量位于麸皮和面粉之间[36],因此,其碳同位素值低于面粉但高于麸皮。
氮同位素在动物不同组织间存在分馏效应。其中,蛋白质含量较高、脂肪含量较低的肌肉组织中氮同位素值较高,而脂肪含量较高的肝脏和肠组织中氮同位素值较低[37-38]。本研究中各类样品中氮同位素无显著差异,可能是由于全麦粉与制粉产品中蛋白质和脂肪含量差异较小导致。
4 结论
小麦制粉产品与全麦粉中碳、氮同位素具有地域特征,且变化趋势一致;小麦制粉产品中碳同位素具有显著差异,氮同位素无显著差异;全麦粉与制粉产品碳、氮同位素之间呈极显著相关性。因此,碳、氮稳定同位素指纹可用于小麦及其制粉产品的产地溯源。今后可进一步研究小麦不同种类蛋白、脂肪等同位素组成特征及其用于小麦产地溯源的可行性。The authors have declared that no competing interests exist.
