,, 侯应军, 李雪涵, 余心怡, 渠慎春,南京农业大学园艺学院,南京 210095Cloning and Function Analysis of Apple Gibberellin Oxidase Gene MdGA2ox8
LI FeiHong,, HOU YingJun, LI XueHan, YU XinYi, QU ShenChun,College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095通讯作者:
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收稿日期:2018-06-4接受日期:2018-07-16网络出版日期:2018-11-16
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Received:2018-06-4Accepted:2018-07-16Online:2018-11-16
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李飞鸿, 侯应军, 李雪涵, 余心怡, 渠慎春. 苹果赤霉素氧化酶基因MdGA2ox8的克隆及功能分析[J]. 中国农业科学, 2018, 51(22): 4339-4351 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.22.012
LI FeiHong, HOU YingJun, LI XueHan, YU XinYi, QU ShenChun.
0 引言
【研究意义】苹果（Malus domestica）是世界范围内广泛栽培的果树之一。矮化栽培现已成为世界苹果栽培最主要的高效栽培模式,此栽培模式近几年在我国发展迅速,主要通过矮化砧木实现。‘苏帅’是由南京农业大学通过杂交培育的短枝型苹果品种[1],以此品种为材料,克隆赤霉素代谢关键酶基因,通过研究其表达模式及功能,探讨其节间缩短的主要机理,对果树矮化和短枝形成机制的研究具有重要意义。【前人研究进展】在植物体内,具有生物活性的GA有GA1、GA3、GA4和GA7[2]。GA20-氧化酶（GA20ox）、GA3-氧化酶（GA3ox）和GA2-氧化酶（GA2ox）是参与植物赤霉素合成与代谢的关键酶,其中GA20ox和GA3ox参与GA合成,而GA2ox则参与GA的分解代谢[2]。GA2ox是由多基因家族编码的双加氧酶,是赤霉素代谢过程中关键酶之一,作用于有生物活性的GA1和GA4,分别将它们转变成无活性的分解代谢物GA8和GA34,使植物体内GA的活性降低,维持植物体内生物活性GA和无活性GA的平衡[3]。研究表明,沉默GA2ox可以促进植物生长和纤维的产生[4],而过表达GA2ox则可以导致植株赤霉素含量的减少和矮化[5]。目前,已经从拟南芥[6]、水稻[7]、梨[8,9]、葡萄[10]、马铃薯[11]、西洋参[12]、太子参[13]、柳枝稷[14]、山茶[15]、油菜[16]中克隆得到GA2ox。【本研究切入点】迄今,有关苹果赤霉素合成相关基因克隆的研究仅见少量报道[17,18,19,20],而对苹果GA2ox8的分离及功能研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】应用RT-PCR技术克隆MdGA2ox8的开放阅读框（ORF）,分析其组织特异性,利用生物信息学方法对其序列进行分析,构建过表达载体,通过农杆菌介导的方法转化烟草,分析过表达MdGA2ox8对烟草生长的影响,为果树矮化机理研究提供理论依据。1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 ‘苏帅’由南京农业大学以‘印度’苹果为母本、‘金帅’为父本杂交育成,2011年通过江苏省作物品种审定委员会鉴定（苏鉴果201108）。该品种植株生长健壮,树冠紧凑,枝条粗壮,具有典型的短枝型苹果品种特征[1]。本研究所用‘苏帅’苗为八棱海棠作为砧木的3年生盆栽苗,所用基质为泥炭土,株高160 cm,由南京农业大学果树生物技术实验室保存。于2016年6月取‘苏帅’中枝顶端展叶2周的幼叶,液氮速冻后于-70℃保存备用;烟草K326种子由玉溪中烟种子有限责任公司提供。1.1.2 菌株与试剂 大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌菌株EHA105均购自上海唯地生物技术有限公司。T4 DNA连接酶购自New England Biolabs公司。各种限制性内切酶、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、反转录试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自TaKaRa公司。pEASY-Blunt克隆载体购自TransGen Biotech、植物RNA提取试剂盒购自成都福际生物技术有限公司。GA1标准样品和GA4标准样品均购自Sigma公司,色谱级甲醇购自Tedia公司,其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 MdGA2ox8克隆 根据先前研究结果[21],‘苏帅’苹果中基因MDP0000309451可能与其节间较短的表型相关,参照NCBI GenBank中苹果基因序列,采用Primer-BLAST设计引物序列（表1）,由上海捷瑞生物工程有限公司合成。Table 1
表1
表1苹果MdGA2ox8克隆、表达及功能分析所用引物
Table 1
| 引物名 Primer name | 引物序列Primer sequence (5′-3′) | 产物Product |
|---|---|---|
| MdGA2ox8-F1 | ATGTCAATGAAGATTCTA | 开放阅读框 ORF |
| MdGA2ox8-R1 | TTATACGACAAATCTAGG | |
| MdGA2ox8-F2 | C/GAGCTC/ATGTCAATGAAGATTCTA | 酶切位点SacⅠ/BamHⅠ Restriction site SacⅠ/BamHⅠ |
| MdGA2ox8-R2 | CG/GGATCC/TTATACGACAAATCTAGG | |
| GA2ox8-RT-F | GAGGAGTGCATGACGGAGAT | 特异扩增 Special amplification |
| GA2ox8-RT-R | ATGTGGCAGAAGGAGTTCCC | |
| NtGA3ox1-RT-F | ATCGACCTCGACAACTACATCA | 特异扩增 Special amplification |
| NtGA3ox1-RT-R | CAGGAGAACGAGCAGCCTTA | |
| NtGA3ox2-RT-F | GTAGTGAACCGAACCCGACA | 特异扩增 Special amplification |
| NtGA3ox2-RT-R | GCGCAAAGCTGAAAAGACGA | |
| NtTubulin-F | AGATGTTCCGTCGTGTCAGTG | 烟草内参基因 Tubulin in tobacco |
| NtTubulin-R | TGCTTCCTCTTCATCCTCATATCC | |
| MdTubulin-F | AGGATGCTACAGCCGATGAG | 苹果内参基因 Tubulin in apple |
| MdTubulin-R | GCCGAAGAACTGACGAGAATC |
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以‘苏帅’中枝顶端展叶2周的幼嫩叶片为材料提取总RNA及反转录得到的cDNA为模板,引物 MdGA2ox8-F1和MdGA2ox8-R1用于MdGA2ox8 ORF克隆。PCR反应体系：模板（cDNA）1.0 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTP 2.0 μL,上下游引物各0.75 μL,1.0 μL PrimeSTAR GXL酶,用超纯水补足至25 μL。反应程序：98℃ 3 min;98℃ 10 s,55℃ 15 s,68℃ 10 s,35个循环;68℃延伸5 min,4℃保存。产物回收：PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测并拍照,按照胶回收试剂盒说明书的步骤进行PCR产物的回收。产物的连接转化：将回收产物与pEASY-Blunt克隆载体相连接,步骤如下：（1）连接：PCR产物3 μL,pEASY-Blunt克隆载体1 μL,总体积4 μL,25℃反应15 min;（2）转化：取-70℃保存的大肠杆菌DH5α,冰上融化,至半融化状态时加入4 μL的连接产物,轻弹混匀,冰浴20—30 min,42℃热激30 s,立即放于冰上2 min,在超净工作台中加入250 μL的无抗性的LB液体培养基,200 r/min,37℃摇菌培养1 h;（3）涂板：离心后去上清液,留取100 μL菌液均匀涂于50 mg·L-1 Km抗性的平板上,37℃培养8—12 h;（4）阳性克隆检测：挑取白色单菌落,接种在含有50 mg·L-1 Km的LB液体培养基中,250 r/min,37℃摇菌培养4 h,PCR检测阳性克隆,测序验证。
1.2.2 MdGA2ox8序列分析 将测序验证正确的核苷酸序列和推导氨基酸序列分别在NCBI数据库上用BLASTn和BLASTp进行序列相似性分析;通过ExPASy Proteomics Server的在线软件Protparam（
1.2.3 表达载体的构建及农杆菌的转化 含酶切位点产物的扩增：设计引物MdGA2ox8-F2和MdGA2ox8-R2,以测序正确的pEASY-MdGA2ox8质粒为模板,MdGA2ox8-F2和MdGA2ox8-R2引物扩增含SacⅠ和BamHⅠ酶切位点的PCR产物,PCR反应体系：模板（pEASY-MdGA2ox8质粒）0.5 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTP 2 μL,上下游引物各0.75 μL（100 ng·μL-1）,PrimeSTAR GXL酶1 μL,用超纯水补足至25 μL。PCR程序：98℃ 3 min;98℃ 10 s,60℃ 15 s,68℃ 10 s,35个循环;68℃延伸5 min,4℃保存。
PCR产物回收：PCR扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测并拍照,按照胶回收试剂盒说明书的步骤进行PCR扩增产物的回收。PCR产物连接转化：将回收产物连接pEASY-Blunt克隆载体,步骤同1.2.1,转化大肠杆菌DH5α,PCR检测阳性克隆,测序验证。
双酶切：将测序正确的阳性菌液提取质粒,构建pCAMBIA1301-35SN-MdGA2ox8载体,步骤如下：（1）双酶切体系：BamHⅠ 2 μL,SacⅠ 2 μL,10×K Buffer 2 μL,质粒（分别为pCAMBIA1301-35SN-MdGA2ox8或pCAMBIA1301-35SN空载）7 μL,ddH2O补足至40 μL,37℃反应3 h;（2）连接：将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收酶切后的目的基因和空载片段,连接体系：T4 DNA连接酶0.5 μL,Ligase 10×Buffer 1 μL,pCAMBIA1301-35SN载体回收片段3.5 μL,目的基因5 μL,总体系10 μL,于16℃反应1 h;（3）转化和涂板：同1.2.1节;（4）阳性克隆检测：挑取白色单菌落,接种在含有50 mg·L-1 Km的LB液体培养基中,250 r/min,37℃摇菌培养4 h,用MdGA2ox8-F2和MdGA2ox8-R2引物进行PCR检测阳性克隆,送去测序验证;（5）将成功构建的载体pCAMBIA1301-35SN-MdGA2ox8转化农杆菌EHA105菌株,具体步骤参照说明书。将PCR检测阳性的菌液提取质粒,并送公司测序。
1.2.4 MdGA2ox8遗传转化烟草及其鉴定 采用叶盘转化法转化烟草K326[23,24],其中筛选抗性标记潮霉素（Hyg）的浓度为10 mg·L-1,每两周更换一次培养基,以保持转基因烟草的抗性筛选压。转基因烟草的鉴定如下：首先剪取抗性烟草的叶片进行GUS染色,对于GUS检测呈蓝色的植株,进一步提取其DNA,利用基因特异引物MdGA2ox8-F1和MdGA2ox8-R1进行PCR检测。然后,提取PCR检测阳性株系的叶片RNA（按照试剂盒说明书）,反转录为cDNA,NtTubulin内参检测模板质量,再以MdGA2ox8-F1和MdGA2ox8- R1为引物,进行PCR检测,反应体系：模板（cDNA）1 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTP 2 μL,上下游引物各0.5 μL,rTaq酶0.15 μL,用超纯水补足至25 μL。PCR程序：94℃ 5 min;94℃ 40 s,55℃ 40 s,72℃ 90 s,35个循环;72℃延伸10 min,PCR产物4℃保存,用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5 MdGA2ox8组织特异性表达 2018年4—5月取‘苏帅’的花、幼叶、老叶、韧皮部、木质部和幼果分别进行检测,上游引物GA2ox8-RT-F,下游引物GA2ox8-RT-R,MdTubulin作为内参基因（表1）。每处理重复3次,根据2-ΔCt公式计算结果,通过SPSS软件计算标准误差和差异显著性。
1.2.6 转基因烟草形态指标的测定 转基因烟草和野生型各5株,经炼苗后移栽,在第一朵花开放时进行各项指标的测定和取样。测量烟草株高和节间长度（从顶而下第3—13片叶的总节间长度）,测量从顶而下第4、5、6、7片叶的叶长和叶宽,计算叶片的长宽比。
1.2.7 转基因烟草叶绿素含量的测定 选取转基因株系与野生型烟草的由顶而下第4、5片叶,参照李合生的丙酮乙醇（1:1）提取方法提取烟草叶片叶绿素[25]。
1.2.8 转基因烟草GA1、GA4含量的测定 选取转基因株系、野生型烟草的由顶而下第4、5片叶,准确称量0.5 g。送南京钟鼎生物技术有限公司,采用ESI-HPLC-MS/MS方法检测植物激素GA1、GA4的含量。
1.2.9 转基因烟草中基因的表达分析 以NtTubulin作为内参基因进行RT-qPCR分析。通过NCBI设计MdGA2ox8特异引物：上游引物GA2ox8-RT-F和下游引物GA2ox8-RT-R,同时设计相关基因GA3ox1和GA3ox2的引物,分别为NtGA3ox1-RT-F,NtGA3ox1-RT-R和NtGA3ox2-RT-F,NtGA3ox2-RT-R。每处理重复3次,根据2-ΔΔCt公式计算结果。
1.3 数据统计与分析
利用SPSS 17.0软件进行显著性分析。利用Excel 2010和GraphPad Prism 7.0软件进行数据分析并作图。2 结果
2.1 MdGA2ox8获得与序列分析
以‘苏帅’叶片cDNA为模板,通过PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测出一条1 000—2 000 bp的特异条带（图1-B）。经产物回收、克隆、测序,该序列全长为1 122 bp,编码373个氨基酸。该基因已经在GenBank登录,登录号为XM_008372903。运用ExPASy Proteomics Server的在线软件Protparam对MdGA2ox8蛋白质进行理化性质的分析和预测。结果显示,其分子式为C1906H2959N507O573S19,相对分子质量为42.8 kD,理论等电点5.44。其中负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）总数为48,正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）总数为39,脂肪系数为79.68,蛋白质不稳定系数为49.73,平均亲水系数为-0.39,预测该蛋白为亲水蛋白。预测MdGA2ox8蛋白无跨膜区,无信号肽序列,为非分泌蛋白。NCBI上分析氨基酸序列的保守结构域,发现MdGA2ox8属于PcbC superfamily超家族,有两个比较保守的结构域,分别是DIOX_N和2OG-FeII_Oxy保守结构域。图1
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图1载体pCAMBIA1301-35SN-MdGA2ox8（A）和MdGA2ox8琼脂糖电泳图（B）
Fig. 1Vector map of pCAMBIA1301-35SN-MdGA2ox8 (A) and agarose gel electrophoresis of MdGA2ox8 (B)
将MdGA2ox8编码的氨基酸序列在NCBI进行搜索,下载白梨、葡萄、草莓、可可等9个物种的GA2ox8氨基酸序列与其进行同源性比对,发现MdGA2ox8编码的氨基酸序列与白梨、草莓和大豆具有较高的相似性,序列一致性分别为89.72%、70.34%和63.03%。多重序列比对结果表明这些GA2ox8所编码的氨基酸序列均含有两个保守结构域,分别为DIOX_N和2OG-FeII_Oxy（图2）。为探讨苹果MdGA2ox8与其他植物之间的关系,选取相似性较高的10种植物的GA2ox蛋白氨基酸序列与MdGA2ox8蛋白氨基酸序列进行比较分析,采用邻位相连法绘制进化树。如图3所示,苹果MdGA2ox8编码的氨基酸序列与白梨的氨基酸序列属于同一个进化支,亲缘关系最近,然后与草莓聚为一支,再与他双子叶、单子叶植物聚类。
图2
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图2MdGA2ox8氨基酸序列比对
红色方框代表DIOX_N结构域;黑色方框代
Fig. 2Alignment of amino acid sequences of MdGA2ox8
Red pane indicates the DIOX_N domain; black pane indicates the 2OG-FeII_Oxy domain
图3
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Fig. 3Phylogenetic tree of GA2ox8 from different plant species
2.2 MdGA2ox8的组织表达
通过RT-qPCR方法检测MdGA2ox8在苹果不同组织中的表达（图4）,发现MdGA2ox8在花中的表达量最高,与其他组织的表达量差异显著;其次为老叶、幼叶和韧皮部,但相互之间差异不显著,而在幼果和木质部的表达量最低,几乎不表达,表明MdGA2ox8的表达具有组织特异性。图4
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图4MdGA2ox8在苹果不同组织中的表达
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下同
Fig. 4Expression of MdGA2ox8 in different tissues of apple
The different lowercases indicate significant difference (P<0.05). The same as below
2.3 MdGA2ox8表达载体的构建及转基因烟草植株的鉴定
用SacⅠ和BamHⅠ酶将MdGA2ox8从克隆载体上切下,与相同酶切的pCAMBIA1301-35SN载体连接,转化大肠杆菌DH5α,经PCR鉴定及测序验证,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1301-35SN- MdGA2ox8（图1-A）。提取质粒并成功转化农杆菌。用阳性单菌落农杆菌菌液（OD=0.5）侵染烟草叶片,共培养3 d,用无菌水洗涤3次,无菌滤纸吸干水分,接种在10 mg·L-1的Hyg抗性培养基中,筛选培养30 d,获得22个抗潮霉素的烟草抗性芽,GUS检测结果表明,其中7株为GUS阳性植株（图5-A）,近一步提取这7株烟草DNA,用MdGA2ox8-F1和MdGA2ox8-R1引物进行PCR扩增,以野生型烟草叶片为对照,结果显示,在获得的7株GUS阳性植株中,6株成功检测到MdGA2ox8（图5-B）,推断MdGA2ox8已成功导入烟草基因组中。为了进一步验证MdGA2ox8在转基因阳性植株中是否在转录水平表达,提取经PCR检测的阳性转基因烟草植株叶片总RNA并反转录成cDNA,检测MdGA2ox8的表达。结果表明,有5个抗性植株中扩增得到片段大小一致的特异MdGA2ox8条带（图5-C）;胶回收、克隆测序表明,所扩增条带为目的基因序列,进一步证明MdGA2ox8成功导入烟草基因组中并在转录水平上进行表达,得到5个阳性转基因植株。图5
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图5MdGA2ox8遗传转化烟草的GUS（A）、PCR（B）和RT-PCR（C）检测
M：Marker;1—7（B）、2—7（C）：转基因烟草植株Transgenic tobacco plants;8：pCAMBIA1301-35SN-MdGA2ox8质粒pCAMBIA1301-35SN-MdGA2ox8 vector;WT（A）、9（B）、1（C）：野生型烟草Wild-type tobacco
Fig. 5GUS staining (A), PCR (B) and RT-PCR (C) amplification of transformation tobacco with MdGA2ox8
2.4 MdGA2ox8过表达对烟草形态指标的影响
经过生根、炼苗、移栽,3个月后,MdGA2ox8过表达影响了转基因烟草的株高、节间长度和开花时间。如图6-A、6-B所示,转基因株系L-1、L-6、L-7、L-11和L-31出现明显的花期延迟和矮化表型,分别比野生型低66%、81%、94%、75%和88%,其中野生型株高达到38.5 cm,而转基因株系L-7和L-31株高分别只有2.3和4.5 cm。同时与野生型相比,转基因烟草的节间长度均有所缩短,以L-7和L-31株系节间缩短最为严重（图6-C）。此外,转基因烟草叶片长宽比均比野生型显著降低（图6-D）。野生型烟草开花时间为85—90 d,而转基因株系均未开花。图6
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图6转基因烟草表型的测定
WT：野生型烟草Wild-type tobacco;L：转基因株系Transgenic line;L-1、L-6、L-7、L-11、L-31：MdGA2ox8过表达烟草的5个株系 MdGA2ox8 overexpression tobacco
Fig. 6Determination of phenotype in transgenic tobacco plants
2.5 MdGA2ox8过表达对烟草叶绿素含量的影响
转基因株系的叶绿素含量均高于野生型,其中L-1、L-7、L-11、L-31株系的叶绿素含量与野生型相比达显著水平,分别比野生型提高61%、44%、31%和27%,而L-6株系的叶绿素含量仅比野生型高13%（图7）。图7
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图7MdGA2ox8过表达对烟草叶绿素含量的影响
Fig. 7Effect of MdGA2ox8 overexpression on chlorophyll content in tobacco plants
2.6 MdGA2ox8过表达对烟草GA1、GA4含量的影响
为研究MdGA2ox8过表达对赤霉素合成的影响及主要作用通路,选取野生型烟草和转MdGA2ox8表达量高的烟草植株叶片,测定GA1和GA4的含量。从图8-A可以看出,转MdGA2ox8的烟草植株叶片中GA1含量均高于野生型,其中,野生型的GA1含量为1.26 ng·g-1,L-6、L-7和L-31株系GA1的含量分别为野生型的1.32、1.29和1.56倍。然而,转基因植株的GA4含量均低于野生型（图8-B）。如图8-C所示,过表达MdGA2ox8的烟草中GA1+GA4总含量均低于野生型,其中野生型的GA1+GA4总含量为6.69 ng·g-1,株系L-6、L-7和L-31的GA1+GA4总含量分别为3.08、1.90和3.47 ng·g-1。图8
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图8MdGA2ox8过表达对烟草叶片赤霉素含量的影响
Fig. 8Effect of MdGA2ox8 overexpression on gibberellin content in transgenic tobacco leaves
2.7 赤霉素相关基因在烟草中的表达
为确认转基因烟草株高的降低（图6-A、6-B）是由MdGA2ox8的过表达所致,以烟草叶片的cDNA为模板,利用RT-qPCR技术分析了转基因烟草中MdGA2ox8的表达量。结果表明,野生型烟草中无MdGA2ox8的表达,而转基因烟草株系中MdGA2ox8的表达量极高,且各转基因株系间其表达量不同（图9-A）。此外,转基因烟草L-6、L-7、L-11、L-31株系中NtGA3ox1和NtGA3ox2的表达量均高于野生型,而L-1株系中其表达量低于野生型（图9-B、9-C）。图9
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图9RT-qPCR检测MdGA2ox8过表达株系
Fig. 9Detection of MdGA2ox8-overexpressed lines using RT-qPCR
3 讨论
赤霉素是一个较大的萜类化合物家族,在植物整个生命循环过程中起着重要的调控作用。植物中GA2ox是一个小基因家族,由多个基因编码,目前已从拟南芥中分离得到8个GA2ox[26,27],但在苹果上相关基因的克隆与分析却没有很好地开展[17,18]。本研究成功获得了苹果GA2ox8 ORF,其具有GA2ox基因家族共同的结构特点,含有DIOX-N和20G-Fell_Oxy保守结构域,通过同源分析结果显示与其他物种的GA2ox8基因同源性最高达90%,因此推测该基因属于GA2ox基因家族的成员,命名为MdGA2ox8。本研究将MdGA2ox8与其他10种植物的15条GA2ox序列进行系统进化分析,结果与前人研究结果一致[13],与AtGA2ox8和AtGA2ox7聚为一类,可能主要催化C20-Gas（GA12和GA53）2β-羟基化[15]。本研究通过农杆菌介导的叶盘转化法获得了5株转基因株系,结果表明MdGA2ox8过表达烟草引起植株的矮化、节间缩短,叶片长宽比降低和花期延迟。SCHOMBURG等[28]研究发现,AtGA2ox8过表达导致烟草矮化和花期推迟。此外,KOTODA等[5]也发现过表达CuGA2ox8拟南芥出现矮化和晚花表型;过表达AtGA2ox7和AtGA2ox8烟草节间严重缩短,植株矮化[28],这与本研究结果相一致。另外,转基因烟草株系的总叶绿素含量均高于对照,说明过表达MdGA2ox8不仅诱导植株矮化,还提高了总叶绿素含量,这与王庆杰等[29,30,31]研究结果一致。
赤霉素合成代谢早期途径在高等植物中基本相同,而在GA12以后的代谢途径中,GA2ox在不同物种和不同组织中的表达量有较大差异。在荔波连蕊茶中ClGA2ox1在嫩枝和两年生茎段中的表达量最高[15];CuGA2ox8在蜜柑成年树的新叶和花芽以及幼苗茎中表达,但在其他组织中表达量较低[5]。本研究的结果与上述结果不同,MdGA2ox8主要在花中优势表达,在幼果和木质部中几乎不表达,这可能是物种或时间不同所致。因此推测MdGA2ox8主要在花中起作用,以控制活性GA的水平,可能参与果实的形成,但不参与果实和木质部的发育。
RT-qPCR技术是现代生物学研究中常用的检测基因表达水平的技术手段[10],通过对转基因烟草株系基因表达水平进行分析研究,结果表明5个转基因株系中MdGA2ox8表达量显著高于野生型,说明这5株转基因烟草均为过表达株系,但各株系间表达量具有差异,这与李军等[32]的研究结果相一致,推测其表达量的差异可能是插入位点和拷贝数的不同造成的[33]。此外,赤霉素合成相关基因NtGA3ox1和NtGA3ox2在株系L-6、L-7、L-11和L-31中的表达量均高于野生型,笔者推测可能是由于MdGA2ox8过表达,导致具有生物活性的GA含量降低,从而提高了NtGA3ox1和NtGA3ox2的表达量。而转基因株系L-1的NtGA3ox1和NtGA3ox2表达量较低,推测可能是MdGA2ox8表达量未达到反馈调节水平。
在植物体内,具有生物活性的GA有GA1、GA3、GA4和GA7[2]。GA2ox作用于有生物活性的GA1和GA4,分别将它们转变成无活性的分解代谢物GA8和GA34,使植物体内GA的活性降低[3]。为检测MdGA2ox8过表达对赤霉素合成与代谢的影响,进而研究MdGA2ox8的作用通路,选取转MdGA2ox8表达量高的烟草植株（L6、L7、L31）和野生型烟草植株的叶片,测定赤霉素GA1和GA4的含量。结果表明,转基因烟草植株叶片中GA1与GA4含量的总和比野生型低,这可能是引起烟草植株节间缩短、矮化的主要原因,这与拟南芥中过表达GA2ox导致赤霉素含量的减少进而植株矮化的研究结果一致[5],也有研究表明,AtGA2ox8在烟草中过表达降低了烟草活性GA的水平并引起矮化[28]。刘露露等[31]研究发现,PsnGA20ox1过表达烟草GA4含量增加而GA1含量并无显著变化;XIAO等[34]分析内源GA显示转GA2ox（ClGA2ox1-3）植物中GA4和GA1水平降低,与野生植物相比GA34含量增加。本研究与其结果一致,在转基因烟草叶片中GA4含量显著低于野生型,但与其研究结果不同的是GA1含量较高于野生型。结合烟草赤霉素合成相关基因分析,推测GA1含量相比野生型增加,可能是由于赤霉素合成相关基因（如GA3ox）表达量上升的原因。然而,本研究结果表明GA4含量的降低是活性GA含量降低的主要因素,因此推测MdGA2ox8主要作用于分解代谢活性GA4转变为无活性的GA34,从而影响植株高度。
4 结论
从‘苏帅’苹果中克隆得到长为1 122 bp的MdGA2ox8开放阅读框（ORF）,编码373个氨基酸,属于PcbC superfamily超家族,有DIOX_N和2OG-FeII_Oxy保守结构域,同源序列比对和进化树分析均表明其与白梨同源性最高,进化关系最近。过表达MdGA2ox8降低了烟草叶片中GA4含量,导致烟草节间缩短、植株矮化、叶色深绿、叶片长宽比降低以及延迟开花时期;MdGA2ox8正反馈调节赤霉素合成相关基因NtGA3ox1和NtGA3ox2的表达量。（责任编辑 岳梅）
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URLMagsci [本文引用: 2]
苹果新品种‘苏帅’是以‘印度’为母本，‘金帅’为父本杂交选育而成。植株生长健壮，树冠紧凑，枝条粗壮。平均单果质量241 g，果实圆锥形，底色黄绿，果皮光滑无锈，果点小，果实发育期155 d左右，品质上等。产量45 t · hm<sup>-2</sup>。
URLMagsci [本文引用: 2]
苹果新品种‘苏帅’是以‘印度’为母本，‘金帅’为父本杂交选育而成。植株生长健壮，树冠紧凑，枝条粗壮。平均单果质量241 g，果实圆锥形，底色黄绿，果皮光滑无锈，果点小，果实发育期155 d左右，品质上等。产量45 t · hm<sup>-2</sup>。
DOI:10.1016/S1360-1385(00)01790-8URLPMID:11120474 [本文引用: 3]
The identification of most of the genes involved in the metabolic pathways for gibberellin hormones has helped us to understand these pathways and their regulation. Many of these enzymes are multifunctional and therefore fewer enzymes than might be expected are required to synthesize the various gibberellin structures. However, several of the enzymes are encoded by multiple genes that are regulated differently, adding unexpected genetic complexity. Several endogenous and environmental factors modify the expression of gibberellin biosynthesis genes, including developmental stage, hormonal status and light. A future challenge will be to dissect the complex, interacting pathways that mediate the regulation of gibberellin metabolism.
DOI:10.1105/tpc.010476URL [本文引用: 2]
DOI:10.1111/j.1467-7652.2009.00480.xURLPMID:20070875 [本文引用: 1]
Enhancing plant height and growth rates is a principal objective of the fiber, pulp, wood and biomass product industries. Many biotechnological systems have been established to advance that task with emphasis on increasing the concentration of the plant hormone gibberellin, or on its signalling. In this respect, the most studied gibberellin biosynthesis enzyme is the GA 20-oxidase which catalyses the rate limiting step of the pathway. Overexpression of the gene resulted in an excessively high activity of the gibberellin deactivating enzyme, GA 2-oxidase. Consequently, this feedback regulation limits the intended outcome. We assume that silencing GA 2-oxidase transcription would abolish this antithetical effect, thereby allowing greater gibberellin accumulation. Here, we show that silencing the gibberellin deactivating enzyme in tobacco model plants results in a dramatic improvement of their growth characteristics, compared with the wild type and GA 20-oxidase over-expressing plants. Moreover, the number of xylem fiber cells in the silenced lines exceeded that of GA 20-oxidase over-expressing plants, potentially, making GA 2-oxidase silencing more profitable for the wood and fiber industries. Interestingly, crossing GA 20-oxidase over-expressing plants with GA 2-oxidase silenced plants did not yield consequential additive effects. Our findings unveil the benefits of silencing GA 2-oxidase to substantially increase tobacco growth and fiber production, which suggest using this approach in cultivated forest plantations and industrial herbaceous plants, worldwide.
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DOI:10.7606/j.issn.1000-4025.2015.02.0233URL [本文引用: 1]
以不同程度缺铁的‘砀山酥梨’组培苗为实验材料,应用ELISA法测定叶片中内源GA含量,并依据NCBI上GA氧化酶GA2ox同源基因的保守序列,采用RACE技术克隆其基因全长,从梨基因组数据库中比对获得GA受体GID1的4个等位基因和DELLA蛋白的4个等位基因,通过实时RT-PCR分析GA2ox基因和GIDI的4个等位基因和DELLA蛋白的4个等位基因的相对表达量,以探讨缺铁对梨叶片GA含量及其信号转导相关基因表达的影响.结果表明:(1)梨叶片中GA含量随着其缺铁程度的加重而增加.(2)克隆出梨叶片中GA2ox基因,其cDNA全长为1 014 bp(GenBank登录号为KJ008976).(3)GA2ox基因的表达量并未随梨缺铁程度增加而上升;GA受体GID1的4个等位基因相对表达量均随梨缺铁程度的加重而增加,其相对表达量与GA含量呈正相关关系;在DELLA蛋白的4个等位基因中,仅DELLA1相对表达量随着梨缺铁程度的加重而逐渐增加,说明DELLA1对缺铁胁迫最敏感.推测梨缺铁诱导了GA合成,但并没有促进活性GA向无活性GA转化.
DOI:10.7606/j.issn.1000-4025.2015.02.0233URL [本文引用: 1]
以不同程度缺铁的‘砀山酥梨’组培苗为实验材料,应用ELISA法测定叶片中内源GA含量,并依据NCBI上GA氧化酶GA2ox同源基因的保守序列,采用RACE技术克隆其基因全长,从梨基因组数据库中比对获得GA受体GID1的4个等位基因和DELLA蛋白的4个等位基因,通过实时RT-PCR分析GA2ox基因和GIDI的4个等位基因和DELLA蛋白的4个等位基因的相对表达量,以探讨缺铁对梨叶片GA含量及其信号转导相关基因表达的影响.结果表明:(1)梨叶片中GA含量随着其缺铁程度的加重而增加.(2)克隆出梨叶片中GA2ox基因,其cDNA全长为1 014 bp(GenBank登录号为KJ008976).(3)GA2ox基因的表达量并未随梨缺铁程度增加而上升;GA受体GID1的4个等位基因相对表达量均随梨缺铁程度的加重而增加,其相对表达量与GA含量呈正相关关系;在DELLA蛋白的4个等位基因中,仅DELLA1相对表达量随着梨缺铁程度的加重而逐渐增加,说明DELLA1对缺铁胁迫最敏感.推测梨缺铁诱导了GA合成,但并没有促进活性GA向无活性GA转化.
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DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.11.011URLMagsci [本文引用: 2]
【目的】分离和克隆‘藤稔’葡萄内根-贝壳杉烯氧化酶基因（VvKO）、GA2-氧化酶基因（VvGA2ox2和VvGA2ox4）、GA3β-羟化酶基因（VvGA3ox4）和GA20-氧化酶基因（VvGA20ox1）等5个重要赤霉素合成相关基因的ORF序列，并对其进行亚细胞定位与表达分析。【方法】采用电子克隆方法克隆相关基因，构建亚细胞定位表达载体，基因枪转化洋葱表皮细胞后激光共聚焦显微镜下观察。并用半定量和荧光定量RT-PCR方法研究各基因的时空表达。【结果】成功克隆了5个基因的完整ORF序列，对上述基因在葡萄不同组织器官中的表达水平进行分析发现，它们在组织器官间的表达有强弱差异。其中，VvGA2ox2主要在果实中表达，VvGA2ox4主要在叶片和果实中表达，而VvKO、VvGA3ox4和VvGA20ox1则在花、叶片和果实中均有一定的表达。VvKO、VvGA2ox2、VvGA2ox4和VvGA3ox4与GFP融合蛋白仅在核内产生绿色荧光；而VvGA20ox1与GFP融合蛋白在细胞核和细胞质膜上均产生绿色荧光信号。【结论】克隆的5个基因与葡萄的花、果实以及营养器官的发育存在不同程度的联系，其中4个基因仅呈现出细胞核内作用的特点，而VvGA20ox1则表现出细胞核和细胞质膜定位的现象。
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.11.011URLMagsci [本文引用: 2]
【目的】分离和克隆‘藤稔’葡萄内根-贝壳杉烯氧化酶基因（VvKO）、GA2-氧化酶基因（VvGA2ox2和VvGA2ox4）、GA3β-羟化酶基因（VvGA3ox4）和GA20-氧化酶基因（VvGA20ox1）等5个重要赤霉素合成相关基因的ORF序列，并对其进行亚细胞定位与表达分析。【方法】采用电子克隆方法克隆相关基因，构建亚细胞定位表达载体，基因枪转化洋葱表皮细胞后激光共聚焦显微镜下观察。并用半定量和荧光定量RT-PCR方法研究各基因的时空表达。【结果】成功克隆了5个基因的完整ORF序列，对上述基因在葡萄不同组织器官中的表达水平进行分析发现，它们在组织器官间的表达有强弱差异。其中，VvGA2ox2主要在果实中表达，VvGA2ox4主要在叶片和果实中表达，而VvKO、VvGA3ox4和VvGA20ox1则在花、叶片和果实中均有一定的表达。VvKO、VvGA2ox2、VvGA2ox4和VvGA3ox4与GFP融合蛋白仅在核内产生绿色荧光；而VvGA20ox1与GFP融合蛋白在细胞核和细胞质膜上均产生绿色荧光信号。【结论】克隆的5个基因与葡萄的花、果实以及营养器官的发育存在不同程度的联系，其中4个基因仅呈现出细胞核内作用的特点，而VvGA20ox1则表现出细胞核和细胞质膜定位的现象。
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DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2014.24.019URL [本文引用: 1]
GA2ox gene containing 987 bp encoding 328 amino acids was cloned and named as PqGA2ox. Bioinformatics analysis showed that PqGA2ox had no transmembrane domain or signal peptide, but had the 20G-Fell_Oxy conserved domains. The expression level of PqGA2ox was lower in the metaphase of morphological dormancy and physiological dormancy than that in the intitial period and release period based on real-time PCR analysis. Conclusion The PqGA2ox gene from the seeds of P. quinquefolium is cloned for the first time, which will provide a foundation for the molecular mechanism of dormancy release of P. quinquefolium.
DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2014.24.019URL [本文引用: 1]
GA2ox gene containing 987 bp encoding 328 amino acids was cloned and named as PqGA2ox. Bioinformatics analysis showed that PqGA2ox had no transmembrane domain or signal peptide, but had the 20G-Fell_Oxy conserved domains. The expression level of PqGA2ox was lower in the metaphase of morphological dormancy and physiological dormancy than that in the intitial period and release period based on real-time PCR analysis. Conclusion The PqGA2ox gene from the seeds of P. quinquefolium is cloned for the first time, which will provide a foundation for the molecular mechanism of dormancy release of P. quinquefolium.
[本文引用: 2]
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URLMagsci [本文引用: 3]
<b>[目的]</b>GA2氧化酶是赤霉素生物合成代谢过程中关键酶之一,GA2ox家族基因常被用于植物矮化基因工程育种。<b>[方法]</b>根据植物GA2氧化酶基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属荔波连蕊茶嫩枝为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 371 bp的<i>GA2ox</i>基因全长cDNA序列,命名为<i>ClGA2ox1</i>(GenBank登录号KJ502290)。<b>[结果]</b>序列分析表明,<i>ClGA2ox1</i>放阅读框(ORF)为1 002 bp,编码333个氨基酸,5'非编码区59 bp,3'非编码区310 bp。预测的蛋白质分子量为37.31 kD,等电点为5.92,具有<i>GA2ox</i>超基因家族的保守结构域和特有的氨基酸残基。ClGA2ox1蛋白与GenBank中收录的其它植物GA2ox蛋白氨基酸的相似性达到80%。构建系统进化树,结果显示山茶GA2氧化酶与烟草GA2ox蛋白的亲缘关系最为密切。实时定量PCR结果显示,该基因在荔波边蕊茶不同器官及发育不同时期的均有表达,表达量有所不同:<i>ClGA2ox1</i>基因在2年生茎段中的表达量最高,在嫩枝和根中也有较高的表达,而在新抽生的嫩叶中最低。<b>[结论]</b>试验结果为进一步明确<i>ClGA2ox1</i>基因的功能特征及揭示其参与调控植物生长的分子机制奠定基础。
URLMagsci [本文引用: 3]
<b>[目的]</b>GA2氧化酶是赤霉素生物合成代谢过程中关键酶之一,GA2ox家族基因常被用于植物矮化基因工程育种。<b>[方法]</b>根据植物GA2氧化酶基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属荔波连蕊茶嫩枝为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 371 bp的<i>GA2ox</i>基因全长cDNA序列,命名为<i>ClGA2ox1</i>(GenBank登录号KJ502290)。<b>[结果]</b>序列分析表明,<i>ClGA2ox1</i>放阅读框(ORF)为1 002 bp,编码333个氨基酸,5'非编码区59 bp,3'非编码区310 bp。预测的蛋白质分子量为37.31 kD,等电点为5.92,具有<i>GA2ox</i>超基因家族的保守结构域和特有的氨基酸残基。ClGA2ox1蛋白与GenBank中收录的其它植物GA2ox蛋白氨基酸的相似性达到80%。构建系统进化树,结果显示山茶GA2氧化酶与烟草GA2ox蛋白的亲缘关系最为密切。实时定量PCR结果显示,该基因在荔波边蕊茶不同器官及发育不同时期的均有表达,表达量有所不同:<i>ClGA2ox1</i>基因在2年生茎段中的表达量最高,在嫩枝和根中也有较高的表达,而在新抽生的嫩叶中最低。<b>[结论]</b>试验结果为进一步明确<i>ClGA2ox1</i>基因的功能特征及揭示其参与调控植物生长的分子机制奠定基础。
DOI:10.1016/j.plaphy.2016.11.008URL [本文引用: 1]
61BnGA2ox6affects silique growth but not seed development inArabidopsis.61BnGA2ox6affects seed germination and flowering inArabidopsis.61BnGA2ox6promotes chlorophyll b accumulation inArabidopsis.61BnGA2ox6downregulates expression of Chlorophyll breakdown genes.
DOI:10.1007/s11105-009-0146-8URL [本文引用: 2]
Three cDNAs, encoding gibberellin (GA) 20-oxidase ( MdGA20ox1 , identical to AB037114), 3-oxidase ( MdGA3ox1 ), and 2-oxidase ( MdGA2ox1 ), were isolated from apple cv. Fuji ( Malus x domestica ). Southern blot analysis indicated that each of these genes belongs to a gene family. Standard enzyme assays show that the MdGA20ox1-MBP fusion protein can sequentially oxidize three times at C-20 position of GA 12 and GA 53 and generate GA 9 and GA 20 ; the MdGA3ox1-MBP fusion protein converts GA 20 and GA 9 to GA 4 and GA 1 , and the MdGA2ox1-MBP fusion protein converts GA 4 and GA 1 to GA 34 and GA 8 , respectively. In addition, we confirmed that MdGA20ox1 is strongly expressed in immature seeds and scarcely detected in other tissues, whereas MdGA3ox1 and MdGA2ox1 are mainly expressed in flowers. Therefore, all the three cDNAs are localized in reproductive tissues. Functional and expression analysis of the three GA oxidases would provide fundamental molecular information to analyze GA metabolic regulation in apple.
DOI:10.1246/cl.2004.790URLPMID:11283183 [本文引用: 2]
To characterize the gibberellin (GA) 20-oxidase gene in apple, the genomic and cDNA clone from 'Fuji' apple (accession no. AB037114) was isolated. The deduced amino acid sequence of this cDNA showed 71% and 66% identity to those of GA 20-oxidase cloned from French bean and Arabidopsis, respectively. The transcript of this gene was detected mainly in immature seeds between 1—3 months after full bloom. These results suggested that this apple GA 20-oxidase gene might be involved in GA biosynthesis in developing apple seed.
DOI:10.3969/j.issn.1000-7091.2012.05.011URLMagsci [本文引用: 1]
GA2ox是赤霉素合成代谢的关键酶,以苹果品种富士茎尖为供试材料,应用同源克隆技术克隆GA2ox基因,获得长度为1 656 bp的DNA序列和1 014 bp cDNA序列。对比分析表明,DNA序列存在3个外显子和2个内含子。GA2ox的开放性阅读框编码337个氨基酸残基,推断其相对分子量为37.679 8 kDa,等电点为6.41。蛋白质结构域检索表明,GA2ox属于依赖于2-酮戊二酸的双加氧酶家族成员;氨基酸同源性分析表明,GA2ox与已报道的其他植物的GA2ox氨基酸序列同源性为51%～97%;氨基酸聚类分析表明,苹果和梨首先聚类,其次是毛果杨。
DOI:10.3969/j.issn.1000-7091.2012.05.011URLMagsci [本文引用: 1]
GA2ox是赤霉素合成代谢的关键酶,以苹果品种富士茎尖为供试材料,应用同源克隆技术克隆GA2ox基因,获得长度为1 656 bp的DNA序列和1 014 bp cDNA序列。对比分析表明,DNA序列存在3个外显子和2个内含子。GA2ox的开放性阅读框编码337个氨基酸残基,推断其相对分子量为37.679 8 kDa,等电点为6.41。蛋白质结构域检索表明,GA2ox属于依赖于2-酮戊二酸的双加氧酶家族成员;氨基酸同源性分析表明,GA2ox与已报道的其他植物的GA2ox氨基酸序列同源性为51%～97%;氨基酸聚类分析表明,苹果和梨首先聚类,其次是毛果杨。
DOI:10.7606/j.issn.1004-1389.2012.11.023URL [本文引用: 1]
The cDNA sequences of progenies indicated that GA2ox gene was expressed in a lower level in shoot apex of columnar apple than it in standard apple.
DOI:10.7606/j.issn.1004-1389.2012.11.023URL [本文引用: 1]
The cDNA sequences of progenies indicated that GA2ox gene was expressed in a lower level in shoot apex of columnar apple than it in standard apple.
[D].
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DOI:10.1093/molbev/msw054URL [本文引用: 1]
DOI:10.1126/science.227.4691.1229URLPMID:17757866 [本文引用: 1]
Transformed petunia, tobacco, and tomato plants have been produced by means of a novel leaf disk transformation-regeneration method. Surface-sterilized leaf disks were inoculated with an Agrobacterium tumefaciens strain containing a modified tumor-inducing plasmid (in which the phytohormone biosynthetic genes from transferred DNA had been deleted and replaced with a chimeric gene for kanamycin resistance) and cultured for 2 days. The leaf disks were then transferred to selective medium containing kanamycin. Shoot regeneration occurred within 2 to 4 weeks, and transformants were confirmed by their ability to form roots in medium containing kanamycin. This method for producing transformed plants combines gene transfer, plant regeneration, and effective selection for transformants into a single process and should be applicable to plant species that can be infected by Agrobacterium and regenerated from leaf explants.
DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2011.08.010URL [本文引用: 1]
[目的]优化根癌农杆菌介导烟草K326遗传转化体系。[方法]以烟草无菌苗的叶片为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化体系进行了优化研究。[结果]外植体在MS＋2 mg/L6-BA＋0.2 mg/L IAA培养基上进行2 d预培养后,用农杆菌GV3101（浸染浓度为OD600=0.6）浸染5 min,转化效率最高,达63%;经过PCR检测初步证明npt II基因已整合到烟草再生植株中。[结论]该研究建立了高效烟草K326叶片农杆菌介导的遗传转化体系。
DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2011.08.010URL [本文引用: 1]
[目的]优化根癌农杆菌介导烟草K326遗传转化体系。[方法]以烟草无菌苗的叶片为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化体系进行了优化研究。[结果]外植体在MS＋2 mg/L6-BA＋0.2 mg/L IAA培养基上进行2 d预培养后,用农杆菌GV3101（浸染浓度为OD600=0.6）浸染5 min,转化效率最高,达63%;经过PCR检测初步证明npt II基因已整合到烟草再生植株中。[结论]该研究建立了高效烟草K326叶片农杆菌介导的遗传转化体系。
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DOI:10.1016/S0958-1669(00)00071-9URLPMID:10753762 [本文引用: 1]
Modification of plant hormone biosynthesis through the introduction of bacterial genes is a natural form of genetic engineering, which has been exploited in numerous studies on hormone function. Recently, biosynthetic pathways have been largely elucidated for most of the plant hormone classes, and genes encoding many of the enzymes have been cloned. These advances offer new opportunities to manipulate hormone content in order to study their mode of action and the regulation of their biosynthesis. Furthermore, this technology is providing the means to introduce agriculturally useful traits into crops.
DOI:10.1073/pnas.96.8.4698URLPMID:10200325 [本文引用: 1]
A major catabolic pathway for the gibberellins (GAs) is initiated by 2 -hydroxylation, a reaction catalyzed by 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases. To isolate a GA 2 -hydroxylase cDNA clone we used functional screening of a cDNA library from developing cotyledons of runner bean (Phaseolus coccineus L.) with a highly sensitive tritium-release assay for enzyme activity. The encoded protein, obtained by heterologous expression in Escherichia coli, converted GA9to GA51(2 -hydroxyGA9), and GA51-catabolite, the latter produced from GA51by further oxidation at C-2. The enzyme thus is multifunctional and is best described as a GA 2-oxidase. The recombinant enzyme also 2尾 -hydroxylated other C19-GAs, although only GA9and GA4were converted to the corresponding catabolites. Three related cDNAs, corresponding to gene sequences present in Arabidopsis thaliana databases, also encoded functional GA 2-oxidases. Transcripts for two of the Arabidopsis genes were abundant in upper stems, flowers, and siliques, but the third transcript was not detected by Northern analysis. Transcript abundance for the two most highly expressed genes was lower in apices of the GA-deficient ga1-2 mutant of Arabidopsis than in wild-type plants and increased after treatment of the mutant with GA3. This up-regulation of GA 2-oxidase gene expression by GA contrasts GA-induced down-regulation of genes encoding the biosynthetic enzymes GA 20-oxidase and GA 3 -hydroxylase. These mechanisms would serve to maintain the concentrations of biologically active GAs in plant tissues.
DOI:10.1105/tpc.005975URL [本文引用: 3]
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.018URL [本文引用: 1]
【目的】获得过量表达苹果细胞 质苹果酸脱氢酶基因(Mdcy MDH)的苹果植株,评价其过量表达对转基因株系生长的影响,并通过光合特性和和激素水平来探讨其调控生长的机理,为进一步揭示该基因调控生长发育的机制 奠定基础。【方法】从苹果叶片中克隆Mdcy MDH编码区,连接植物表达载体p BI121,转化农杆菌LBA4404;利用农杆菌侵染‘嘎啦’苹果叶片,通过叶片再生的方法获得Mdcy MDH过表达的转基因苹果株系。以分化的苹果组培苗叶片为材料,提取基因组DNA,利用来自35S启动子和转化基因序列的引物,通过PCR初步筛选转基因 株系;然后,提取初筛的转基因苹果组培苗叶片RNA,分别采用半定量和荧光定量PCR的方法检测Mdcy MDH表达量,来确定Mdcy MDH过表达株系。以继代培养40和60 d的野生型和转基因苹果组培苗为材料,进行生根处理,30 d后测定Mdcy MDH过表达对组培苗表型以及株高、叶片数量、根重等生长参数的影响。以驯化的、在大田生长一年的野生型和转基因苹果苗为材料,测定叶片光合参数和叶绿素 含量的变化;以组培苗为材料,利用液质联用仪测定叶片内源激素含量的变化。【结果】以苹果叶片基因组DNA为材料,PCR初步筛选获得了3个转基因株系, 即Line2、Line 3和Line 4;半定量和荧光定量PCR检测发现Line 2和Line 4中Mdcy MDH表达量分别比野生型提高了12倍和5倍,因此确定以上两个株系为Mdcy MDH过表达株系。此外,Mdcy MDH过量表达也提高了叶绿体苹果酸脱氢酶基因(Mdch MDH)表达量。组培苗生根培养30 d后,Mdcy MDH过表达对转基因株系的株高、叶数目、茎粗度、地上部重量未造成显著性影响,但小幅提高了转基因株系的株高和地上部总重量;与野生型相比,Mdcy MDH过量表达显著提高了根系的重量和总鲜重。Mdcy MDH过表达显著提高了转基因株系的光合速率,Line 2和4光合速率分别提高了13.2%和15.1%;转基因株系的蒸腾速率和气孔导度总体上都有显著性提高,但其胞间CO2浓度显著降低;Mdcy MDH过量表达显著提高了叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总含量,与对照相比,Line 2和4株系叶绿素总含量分别提高了20.4%和15.9%。叶片激素含量测定表明,Mdcy MDH过量表达显著抑制了ABA水平,其含量约为对照的1/2。【结论】Mdcy MDH过量表达通过提高光合能力和降低ABA水平促进了转基因苹果组培苗的生长,尤其是促进了生根。
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.018URL [本文引用: 1]
【目的】获得过量表达苹果细胞 质苹果酸脱氢酶基因(Mdcy MDH)的苹果植株,评价其过量表达对转基因株系生长的影响,并通过光合特性和和激素水平来探讨其调控生长的机理,为进一步揭示该基因调控生长发育的机制 奠定基础。【方法】从苹果叶片中克隆Mdcy MDH编码区,连接植物表达载体p BI121,转化农杆菌LBA4404;利用农杆菌侵染‘嘎啦’苹果叶片,通过叶片再生的方法获得Mdcy MDH过表达的转基因苹果株系。以分化的苹果组培苗叶片为材料,提取基因组DNA,利用来自35S启动子和转化基因序列的引物,通过PCR初步筛选转基因 株系;然后,提取初筛的转基因苹果组培苗叶片RNA,分别采用半定量和荧光定量PCR的方法检测Mdcy MDH表达量,来确定Mdcy MDH过表达株系。以继代培养40和60 d的野生型和转基因苹果组培苗为材料,进行生根处理,30 d后测定Mdcy MDH过表达对组培苗表型以及株高、叶片数量、根重等生长参数的影响。以驯化的、在大田生长一年的野生型和转基因苹果苗为材料,测定叶片光合参数和叶绿素 含量的变化;以组培苗为材料,利用液质联用仪测定叶片内源激素含量的变化。【结果】以苹果叶片基因组DNA为材料,PCR初步筛选获得了3个转基因株系, 即Line2、Line 3和Line 4;半定量和荧光定量PCR检测发现Line 2和Line 4中Mdcy MDH表达量分别比野生型提高了12倍和5倍,因此确定以上两个株系为Mdcy MDH过表达株系。此外,Mdcy MDH过量表达也提高了叶绿体苹果酸脱氢酶基因(Mdch MDH)表达量。组培苗生根培养30 d后,Mdcy MDH过表达对转基因株系的株高、叶数目、茎粗度、地上部重量未造成显著性影响,但小幅提高了转基因株系的株高和地上部总重量;与野生型相比,Mdcy MDH过量表达显著提高了根系的重量和总鲜重。Mdcy MDH过表达显著提高了转基因株系的光合速率,Line 2和4光合速率分别提高了13.2%和15.1%;转基因株系的蒸腾速率和气孔导度总体上都有显著性提高,但其胞间CO2浓度显著降低;Mdcy MDH过量表达显著提高了叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总含量,与对照相比,Line 2和4株系叶绿素总含量分别提高了20.4%和15.9%。叶片激素含量测定表明,Mdcy MDH过量表达显著抑制了ABA水平,其含量约为对照的1/2。【结论】Mdcy MDH过量表达通过提高光合能力和降低ABA水平促进了转基因苹果组培苗的生长,尤其是促进了生根。
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DOI:10.3969/mpb.010.000121URL [本文引用: 1]
为了建立转基因水稻的高通量遗传分析系统,本研究以粳稻成熟胚诱 导的愈伤组织为受体材料,潮霉素磷酸转移酶(HPT)为抗性筛选标记,通过农杆菌介导的方法将红色荧光蛋白基因mCherry导入水稻.在水稻转化愈伤组 织、转化植株(T0)和转基因后代(T1)均检测到红色荧光,证实mCherry在转基因水稻中稳定表达.139个独立转化株系的遗传分析表 明,mCherry在转基因后代表现多种遗传模式,54％的转基因株系呈单位点遗传.TAIL-PCR进一步验证转基因整合到水稻基因组.根据T-DNA 整合位点DNA序列分析结果,T-DNA左边界发生碱基缺失、增加和替换,右边界只发生碱基缺失,说明左边界比右边界有更多的碱基变异类型.此外,对T2 代植株mCherry和HPT的转录水平进行实时定量逆转录PCR分析,结果表明,mCherry和HPT转录水平因T-DNA在水稻基因组中的整合位置 而变化,表现位置效应.本研究在mCherry荧光蛋白和其它相关方法的基础上,为转基因水稻遗传及分子分析建立了一个高效的流程体系.
DOI:10.3969/mpb.010.000121URL [本文引用: 1]
为了建立转基因水稻的高通量遗传分析系统,本研究以粳稻成熟胚诱 导的愈伤组织为受体材料,潮霉素磷酸转移酶(HPT)为抗性筛选标记,通过农杆菌介导的方法将红色荧光蛋白基因mCherry导入水稻.在水稻转化愈伤组 织、转化植株(T0)和转基因后代(T1)均检测到红色荧光,证实mCherry在转基因水稻中稳定表达.139个独立转化株系的遗传分析表 明,mCherry在转基因后代表现多种遗传模式,54％的转基因株系呈单位点遗传.TAIL-PCR进一步验证转基因整合到水稻基因组.根据T-DNA 整合位点DNA序列分析结果,T-DNA左边界发生碱基缺失、增加和替换,右边界只发生碱基缺失,说明左边界比右边界有更多的碱基变异类型.此外,对T2 代植株mCherry和HPT的转录水平进行实时定量逆转录PCR分析,结果表明,mCherry和HPT转录水平因T-DNA在水稻基因组中的整合位置 而变化,表现位置效应.本研究在mCherry荧光蛋白和其它相关方法的基础上,为转基因水稻遗传及分子分析建立了一个高效的流程体系.
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