新型功能化荧光探针设计及在汞胁迫下生物活性物种的成像分析研究
王悦
学位类型博士
导师陈令新 研究员
2021-05-12
培养单位中国科学院烟台海岸带研究所
学位授予单位中国科学院大学
学位授予地点中国科学院烟台海岸带研究所
学位名称工学博士学位
学位专业环境工程
关键词荧光探针，汞胁迫，生物活性物种，荧光成像，环境分析
摘要荧光成像分析技术凭借其超高的灵敏度、优异的选择性、可实现目标物动态、实时、原位监测的优势已逐渐成为环境分析、生物分析等领域不可或缺的成像分析手段。在本文中，基于荧光成像分析技术，致力于构建新型荧光探针工具，用于汞离子胁迫下细胞及体内生物活性物种（超氧阴离子、多硫化谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶）的成像分析与监测。通过研究汞胁迫下生物活性物种在细胞、组织及活体水平上的分布、浓度变化、转运及其他生物效应，揭示汞污染问题对人类健康造成的影响，为进一步阐明汞中毒机制提供技术支持和科学依据。本文的详细内容如下：1. 三通道荧光探针用于汞中毒模型中超氧阴离子和汞离子的联动检测汞离子（Hg2+）作为一种细胞毒性的重金属离子会引起机体氧化应激，并诱导严重的生理功能障碍。为深入探索汞中毒的复杂机制，设计并合成三通道荧光探针HCy-SeH用于汞中毒细胞及小鼠模型中超氧阴离子（O2?-）和Hg2+的联动检测。探针的荧光响应由氢花菁荧光团部分的抽氢反应引发；探针被O2?-氧化后，其共轭体系恢复，转化为可发射荧光信号的中间体七甲川花菁衍生物Cy-SeH，并且中间体Cy-SeH与它的共轭碱Cy=Se共存。响应基团硒醇可以通过硒汞拮抗反应检测Hg2+，从而得到最终产物同时伴随着荧光发射波长的变化。该探针对O2?-和Hg2+展示出好的选择性及高的灵敏度，可用于O2?-和Hg2+的联动检测。将探针应用于汞中毒细胞及小鼠模型的肾脏中，进行O2?-和Hg2+的原位成像分析。实验结果表明，汞中毒引起严重的氧化应激并诱发肾组织损伤。因此，该新型荧光探针HCy-SeH有助于揭示与汞中毒相关的病理机制。2. 基于巯基的近红外比率型荧光探针用于对比性研究急性/长期汞中毒在前期研究中，使用三通道荧光探针用于O2?-和Hg2+联动检测的工作引起了研究人员的关注，考虑到汞中毒发病机制的复杂性，希望借助荧光探针这一工具进一步揭示急性汞中毒与长期汞中毒之间的区别，以便更好地针对汞中毒进行诊断与治疗。然而，前期荧光探针的稳定性不能满足长期测试的实验要求。鉴于三通道比率型荧光探针的优势，继续采用花菁染料作荧光团，同时采用巯基作响应基团，构建出更稳定的荧光探针HCy-SH，用于汞中毒模型中O2?-和Hg2+的检测。探针对O2?-和Hg2+展示出良好的光谱特征，并进一步将探针应用于对比性研究急性汞中毒与长期汞中毒。实验结果表明，汞中毒会引起严重的O2?-爆发，并且在急性汞中毒中O2?-的爆发比长期汞中毒中的要严重的多，尤其是在心脏中。与急性汞中毒不同，在长期汞中毒小鼠模型中，O2?-在不同器官、不同时间的爆发不尽相同。但是无论在急性汞中毒还是长期汞中毒中，Hg2+都主要在肾脏中积累。实验结果表明，该探针HCy-SH是准确诊断和评估汞中毒的潜在候选者。3. 比率型荧光探针用于汞离子胁迫下多硫化谷胱甘肽的检测还原性活性物种，多硫化谷胱甘肽（GSSH）在信号转导，氧化还原稳态及代谢调节中发挥着关键作用，然而GSSH在这些方面详细的生物学功能却模糊不清。研究GSSH生理功能的主要障碍是缺乏具有高时空分辨率的检测工具。为解决这一问题，设计并合成新型比率荧光探针，基于硒硫交换反应实现汞离子胁迫下活细胞和组织中还原性活性物种GSSH的检测。将荧光探针应用于细胞内GSSH生物合成路径的研究，实验结果表明，GSSH主要来自两种硫转移酶：胱硫醚-β-合成酶和胱硫醚-γ-裂解酶，这与此前的研究报道一致。此外，应用探针探索了GSSH在保护细胞抵抗汞离子诱导的细胞损伤中的生物学作用。实验结果表明，GSSH可以有效缓解汞毒性。该探针是准确评估GSSH生理病理学功能的有力候选者，它可以促进研究人员对GSSH生物学功能的深入探索。4. 谷胱甘肽过氧化物酶可激活的比率型荧光探针用于成像分析谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）是一线抗氧化防御系统中非常重要的蛋白酶，它参与氧化还原稳态以及戊糖磷酸途径的调节等生理活动。然而，当前的技术无法实现Gpx的可视化研究，并且Gpx具有较高的反应活性，容易受到外界因素的干扰。在此，构建新型比率荧光探针用于汞中毒和老龄化模型中Gpx的检测，并探索谷胱甘肽过氧化物酶/谷胱甘肽（Gpx/GSH）氧化还原池的催化循环机制及对汞胁迫引起的氧化应激的抗氧化机理。将探针应用于衰老细胞及小鼠模型中Gpx的研究，实验结果表明Gpx的活性在衰老过程中逐渐降低。进一步，利用探针研究Gpx在汞中毒细胞及小鼠模型中的抗氧化机理。结果表明，汞离子降低了Gpx的活性，并通过诱导活性氧物种的爆发导致氧化应激、激活凋亡信号通路，从而加剧汞离子对生物体的损伤。Gpx/GSH氧化还原池可以利用GSH作为底物有效缓解氧化应激。此外，探针还可应用于深层脑组织中Gpx的检测。该新型荧光探针是探索Gpx生理功能和细胞内氧化还原稳态事件强有力的化学工具，同时期望该新型荧光探针可以促进Gpx靶向工具的开发，并在探索Gpx的生理病理学功能方面提供帮助。5. 比率型荧光探针用于内源性生物信号分子超氧阴离子的成像分析体内生物活性物种在应对汞污染等各类环境问题时发挥着重要的生理功能，然而这些生物活性物种在其他方面的生理及病理学功能也值得进一步探讨。以O2?-为例，汞中毒会引起严重的O2?-爆发并诱发氧化损伤；而高浓度的O2?-则会激活肿瘤凋亡信号通路，有效杀伤肿瘤细胞。在此，设计并合成荧光探针工具TP-Tfs，用于可视化检测内源性生物信号分子O2?-，深入研究O2?-在其他方面的生理功能。探针对O2?-的选择性较好，并可实现O2?-的快速检测。探针TP-Tfs可用于细胞内源性的O2?-检测，并可应用于汞中毒细胞内O2?-的成像分析。此外，探针TP-Tfs可应用于肿瘤细胞药物化疗期间及荷瘤小鼠模型肿瘤药物治疗期间的O2?-检测。实验结果表明，化疗药物顺铂可诱导细胞内O2?-的浓度增加，并有效杀伤肿瘤细胞。姜黄素联合化疗药物顺铂可诱导更严重的O2?-爆发，并对化疗药物顺铂发挥增敏作用，从而提高肿瘤的治疗效果。因此，O2?-除在汞中毒中发生变化，其在其他方面的生理功能亦值得深入探索，探针TP-Tfs作为强有力的分析工具可发挥其潜在作用。
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语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.yic.ac.cnhttp://ir.yic.ac.cn/handle/133337/29336
专题中科院海岸带环境过程与生态修复重点实验室

推荐引用方式
GB/T 7714王悦. 新型功能化荧光探针设计及在汞胁迫下生物活性物种的成像分析研究[D]. 中国科学院烟台海岸带研究所. 中国科学院大学,2021.


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