原核生物的基因组中成簇有规律的间隔短回文重复序列（CRISPR）及其辅助蛋白（Cas蛋白）构成了一道重要的免疫屏障，使细菌和古菌的原核生物免受外界病毒（如噬菌体等）的侵染。该免疫系统发挥作用分三步进行：首先，Cas1和Cas2组成核心蛋白复合物，将入侵宿主的外源DNA片段进行加工，随后整合到位于宿主基因组上CRISPR位点，这一过程被称为获取阶段。其次，宿主表达相关的Cas蛋白，同时转录并加工出成熟的crRNA，形成干扰复合体。最后，当外源DNA再次入侵时，由crRNA介导的干扰复合体将其识别并降解，以保护宿主免遭损伤。随着近年来研究的不断深入，CRISPR-Cas系统中一系列重要蛋白及复合物的结构逐渐被报道，人们对于crRNA的加工机制和干扰复合物的形成有了较为清晰的了解。然而，对于Cas1和Cas2如何获取外源DNA片段，仍知之甚少 。因此，研究获取阶段的结构与分子机制有助于完善对CRISPR-Cas系统的认识。
在本研究中，王久宇和李佳智等人在王艳丽研究员的指导下，通过解析Cas1-Cas2与多种DNA的复合物的晶体结构，证明外源DNA片段以一种两端分叉的构象被Cas1和Cas2组成的复合物所获取。在Cas1-Cas2-DNA的结构中，两个Cas1的酪氨酸残基与Cas2分子共同构成卡尺模型，准确度量出23 bp的DNA双链部分；DNA的3’单链部分，通过Cas1分子Lys211、Tyr217等氨基酸残基对PAM互补序列（5’-CTT-3’）序列特异性识别，深入到由His208、Glu141和Asp221组成Cas1的活性中心，在两端分别切割留下5nt，与之前的双链部分共同构成33 nt的获取片段。在这一过程中，由于结合底物DNA，Cas1-Cas2发生了明显的构象变化，该变化可比作蝴蝶飞舞时由“翅膀扬起”到“翅膀展平”的状态。最终，在Cas1-Cas2的介导下，外源DNA通过“切割-粘贴”的机制插入到宿主的CRISPR位点。该研究通过结构和生化分析，揭示了Cas1-Cas2获取外源DNA片段的分子机制，阐明外源DNA片段的度量机理，为完整揭示原核生物CRISPR-Cas系统奠定了重要的理论基础。
该项研究是在上海设施BL18U1、BL-19U1和上海光源17U等其他相关线站上进行的。在实验方面，线站工作人员提供了强有力的专业技术支持，为成果的发表做出了积极贡献。该研究还得到科技部、国家自然科学基金以及中国科学院战略性先导科技专项（B类）的资助。（生化与细胞所）
图注：E. coli Cas1-Cas2蛋白与具有双叉结构的间隔区前体DNA复合物的晶体结构。Cas1-Cas2特异性的识别并结合含有PAM互补序列DNA，进而确定间隔区前体的长度并将其插入到CRISPR-Cas位点。
