“工欲善其事，必先利其器”：构建工具大鼠，实现基因标记和基因敲减
多巴胺在调节神经发育和大脑功能中发挥着重要作用，其受体分为两种类型：兴奋性D1类受体(Drd1和Drd5)和抑制性D2类受体(Drd2、Drd3和Drd4)。其中，Drd2与多种神经精神疾病有联系，是抗精神病药物的作用靶点。最近的研究表明，大脑皮层的兴奋性锥体神经元具有基因表达和连接模式上的高度异质性，比如，表达Drd1和Drd2的皮层锥体神经元大部分是不同的。大脑皮层神经元的异质性使得单纯用基因敲除方法来研究突触发育具有一定的不准确性。
殷东敏课题组前期构建了Drd2基因报告(SR-Drd2)大鼠，揭示了Drd2在大鼠大脑皮层发育过程及成年期的细胞表达模式(图1)。研究者分析了大鼠前扣带回皮层(ACC)不同层中Drd2阳性神经元占总Drd2阳性神经元的百分比，发现Drd2主要表达在深层(5-6层,占比约85%),而在ACC的浅层(2-3层)，只占约15%。研究者进一步用SR-Drd2大鼠与Drd2+/-大鼠交配得到Drd2自我报告的杂合子(SR-Drd2+/-)大鼠 ，该大鼠的Drd2阳性神经元被红色荧光标记，与此同时Drd2基因的表达也下降了。接下来，研究者使用SR-Drd2+/-大鼠(SR-Drd2作为对照)来研究Drd2在突触发育中的作用，这既达到了同时进行基因标记和基因敲减的效果，又避免了先前研究中Drd2全敲小鼠生长迟缓的全身发育问题。
图1：工具大鼠的构建流程及表达模式
“以点带面，触类旁通”：追踪发育过程，揭示Drd2在突触修剪中的作用
前扣带回皮层(ACC)是一个与情绪如焦虑和抑郁密切相关的脑区，研究者使用SR-Drd2+/-大鼠研究Drd2在ACC突触发育中的作用。研究者追踪了SR-Drd2大鼠和SR-Drd2+/-大鼠ACC第5层Drd2阳性神经元上树突棘的发育时程，发现Drd2在调节突触修剪而非突触形成中起到重要作用(图2)。此外，青春期Drd2介导的突触修剪缺陷会导致成年期神经元兴奋性增加和焦虑样行为。
图2：Drd2在大脑皮层突触修剪中的作用
“层层深入，抽丝剥茧”：运用多种方法，阐明Drd2参与突触修剪的细胞分子机制
在ACC脑区，Drd2除了表达在兴奋性锥体神经元，还表达在投射的多巴胺能神经元末梢上(突触前)。为了进一步证明Drd2是通过细胞自主(cell-autonomous)机制来调节突触修剪，研究者采用了Cre依赖的shRNA表达系统(称为PRIME,potent RNA interference usingmicroRN Aexpression vector系统)。将Cre依赖的EGFP-Drd2 shRNA-AAV注射到三周龄的Drd2-Cre大鼠的ACC深层脑区，在Cre酶的作用下，可以同时表达Drd2 shRNA和EGFP，从而同时标记Drd2阳性神经元和下调Drd2的表达水平。结果表明，特异性地在ACC下调Drd2阳性神经元中的Drd2表达水平，可以抑制突触修剪，从而说明Drd2通过细胞自主机制调节突触修剪。
Drd2的下游包括cAMP-PKA和β-arrestin-PP2A-AKT两条信号通路。Drd2的下调已经被证明可以激活AKT-mTOR信号通路，而mTOR信号的激活与自闭症谱系疾病中突触修剪的缺陷有关联。基于此，研究者首先通过Western blot分析3-4周龄的SR-Drd2+/-大鼠和对照大鼠的ACC深层中AKT-mTOR信号。结果表明，Drd2杂合子突变会引起AKT-mTOR信号的过度激活(图3)。为了研究mTOR的激活是否影响了突触修剪，研究者向3-4周龄SR-Drd2+/-大鼠ACC深层每天注射雷帕霉素(mTOR抑制剂)。结果显示，雷帕霉素可以使SR-Drd2+/-大鼠的ACC神经元树突棘密度恢复到对照水平，证明mTOR的激活确实参与了Drd2对突触修剪的调控过程。进一步研究表明，mTOR的过度激活可能通过抑制自噬影响了突触修剪(图3)。
图3：Drd2调节大脑皮层突触修剪的细胞分子机制
上述研究结果揭示了Drd2在大脑皮层突触修剪中的重要作用，并阐明了相关的细胞分子机制。相关研究论文《Dopamine D2 receptor regulates cortical synaptic pruning in rodents》于2021年11月8日在Nature Communications杂志在线发表。
课题组研究成果刊发于Nature Communications
华东师范大学为该论文唯一完成单位。生命科学学院脑功能基因组学教育部重点实验室博士研究生张亚强、林伟鹏、黄莉萍为论文的共同第一作者，殷东敏研究员为论文的通讯作者。博士研究生赵冰和硕士研究生章成成参与了该项研究。殷东敏课题组长期从事突触和精神性疾病的研究。该工作得到了国家自然科学基金委、科技部精准医疗重点研发计划、上海市科技启明星计划、中科院神经科学国家重点实验室及上海市重性精神病重点实验室开放课题等项目资助。
附：
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-26769-9
图文、来源｜生命科学学院脑功能基因组学教育部重点实验室 编辑｜孟子楠 编审｜郭文君
