, 贾若坦, 梁启煜, 谢元华东北大学 机械工程及自动化学院, 辽宁 沈阳 110819
收稿日期：2016-12-20
基金项目：国家自然科学基金资助项目(51408105)。
作者简介：朱彤(1963-)，男，陕西白水人，东北大学教授，博士生导师。
摘要：为探究厌氧氨氧化(ANAMMOX)过程中微生物群落结构的演化, 采用高通量测序技术对ANAMMOX反应器中微生物群落结构进行分析.结果表明:反应器运行61 d后氮去除负荷达到1.04 kg·N·m-3·d-1, 总氮去除率达75 %以上.反应器中微生物多样性较为丰富, 存在变形菌门、绿曲挠菌门、绿菌门、浮霉菌门等微生物.从启动到稳定过程中微生物群落结构趋于稳定.其中和脱氮相关的变形菌门和浮霉菌门合计占比达40 %以上.ANAMMOX菌所在的浮霉菌门比例随运行时间延长而逐渐增加, 是反应器脱氮效能提高的主要原因.反应器内占据优势地位的ANAMMOX菌主要为Candidatus Kuenenia属, 占比14 %左右, 同时还有少量Candidatus Brocadia属.
关键词：厌氧氨氧化高通量测序群落特征氮去除微生物
Evolution Analysis of Microbial Community During the Running Process in an ANAMMOX Reactor
ZHU Tong
, JIA Ruo-tan, LIANG Qi-yu, XIE Yuan-huaSchool of Mechanical Engineering & Automation, Northeastern University, Shenyang 110819, China
Corresponding author: ZHU Tong, professor, E-mail: tongzhu@mail.neu.edu.cn
Abstract: In order to provide theoretical support for the optimization of anaerobic ammonium oxidation (ANAMMOX)technology, high-throughput sequencing technology was used to study the microbial community structure and its evolution in an ANAMMOX reactor. The results showed that the reactor achieved nitrogen removal rate up to 1.04 kg·N·m-3·d-1 after 61 days. The total nitrogen removal rate was above 75 %.The microbial diversity in the reactor was very abundant, including Proteobacteria, Chloroflexi, Chlorobi, Planctomycetes, etc.The microbial community structure tended to be stable with the running process of the reactor.The proportion of Proteobacteria and Planctomycete, associated with denitrification, totally achieved over 40 %. The proportion of ANAMMOX bacteria belonging to Planctomycete increased gradually with reactor operation, which was the main reason for denitrification efficiency improvement.The ANAMMOX bacteria Candidatus Kuenenia category dominated in reactor about 14 %. A small number of Candidatus Brocadia genus also existed in the reactor.
Key Words: ANAMMOX(anaerobic ammonium oxidation)high-throughput sequencingcommunity characteristicsdenitrificationmicrobe
厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX)技术在废水脱氮领域相较于传统脱氮技术具有明显优势.但ANAMMOX菌对环境因素的变化敏感[1]且倍增时间长、生长缓慢, 限制了ANAMMOX反应器的快速启动[2].目前对ANAMMOX过程的微生物生态学机制研究还不完善.因此, 实现ANAMMOX反应器的快速启动并明确ANAMMOX反应器内部不同位置的微生物种群结构变化与差异, 对ANAMMOX技术的规模化应用有重要意义.
研究表明, 在反应器内添加填料可以减少ANAMMOX污泥的流失, 加速ANAMMOX菌的富集, 缩短反应器启动时间, 已经成功应用于ANAMMOX反应器的填料有无纺布、海绵、生物质炭等[3].但目前对填料上污泥微生物结构变化的研究较少, 菌群变化的影响因素仍不甚明了.
微生物群落结构研究的方法有很多种, 包括生化指标分析、荧光原位杂交、16SrRNA文库构建和PCR-DGGE等方法.这些传统的分子生物学方法效率比较低下, 不能有效、系统地反映群落的丰度和多样性.高通量测序技术作为新型微生物种群鉴定技术, 能更全面深入地了解微生物种群结构, 在环境微生物鉴定领域应用广泛.陈重军等[4]基于高通量测序对ABR ANAMMOX反应器各隔室细菌群落分析表明, 各隔室群落存在较大差异, 种属也不尽相同.
针对本研究所启动的ANAMMOX反应器, 利用高通量测序技术分析其不同功能菌的组成占比和功能, 并对填料不同位置功能菌属的结构演替进行研究, 探讨反应器功能菌群结构变化与其宏观污染物去除效能之间的联系, 为ANAMMOX反应器高效稳定运行提供借鉴和理论依据.
1 实验材料和方法1.1 实验装置实验装置见图 1, 反应器材质为有机玻璃, 圆柱部分直径234 mm, 高750 mm, 有效容积30 L.反应器内环状填料架上缠绕亲水性帘式纤维填料, 有效填充率为7.49 g·L-1.水温通过加热器(SX-265, 广东金利佳机电有限公司)自动控制, pH值通过在线监测装置(SIN-PH160, 杭州联测自动化技术有限公司)监测并联动控制补液泵进行酸碱调节液的投加.进水由蠕动泵控制连续进水.
图 1(Fig. 1)
 | 图 1 上升流式厌氧氨氧化反应器Fig.1 Up-flow ANAMMOX reactor |
1.2 实验材料接种污泥为实验室培养的混合污泥, 含有部分ANAMMOX细菌, 接种后反应器内混合液悬浮固体质量浓度(mixed liquid suspended solids, MLSS)为6 g·L-1.实验原水为人工配水, 其中, NH4+—N, NO2-—N分别由(NH4)2SO4, NaNO2按需配置(NH4+—N与NO2-—N物质的量之比为1：1, 具体负荷见2.1节), KH2PO4 54 mg·L-1, FeSO4·7H2O 9 mg·L-1, EDTA 5 mg·L-1, 矿物质元素浓缩液2 ml·L-1, 微量元素浓缩液1 ml·L-1.由NaHCO3按需配置提供无机碳, 避免采用有机碳源引起杂菌生长, 对ANAMMOX产生抑制.矿物质元素浓缩液组成为CaCl2 0.7 g·L-1, KCl 0.7 g·L-1, MgSO4 0.5 g·L-1, NaCl 0.5 g·L-1; 微量元素浓缩液组成为(质量浓度, mg·L-1)CoCl2·6H2O 0.24, CuSO4·5H2O 0.25, H3BO3, MnCl2·4H2O 0.99, Na2MoO4·2H2O 0.22, NiCl·6H2O 0.19, ZnSO4·7H2O 0.43.
1.3 实验控制参数pH值控制在7.50±0.1(通过0.1 mol/L的HCl调节), 温度控制在34 ℃, 初始HRT设定为24 h, 进水充分曝氮气除氧(溶解氧控制在0.1 mg/L以下), 反应器遮光.
1.4 实验方法水质指标测定:氨氮采用纳式分光光度法; 亚硝氮采用盐酸萘乙二胺分光光度法; 硝氮采用紫外分光光度法.在反应器开始启动到稳定运行的过程中采集不同时间段的污泥样品, 监测反应器运行过程中的微生物群落变化.反应器运行期间共取4组样品, 分别是1号样品(ANAMMOX反应器种泥), 2号样品(运行30 d时填料下部污泥), 3号样品(运行90 d时填料下部污泥), 4号样品(运行90 d时填料上部污泥).在所选的取样时间点, 反应器脱氮能力稳定, 污泥样品能够代表这一阶段反应器内的微生物群落结构状态.污泥样品从反应器取出后, 在-40 ℃冰箱中保存, 样品送往上海美吉生物医药科技有限公司进行测序分析.
获得实验样品后, 基因组DNA用PowerSoil DNA提取试剂盒(MOBIO公司生产)抽提, 再用1 %琼脂糖凝胶电泳对获得的基因组DNA进行检测.DNA抽提之后, 进行PCR扩增.所用扩增引物包括338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT).用2 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增所得产物, 使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物, Tris_HCl洗脱; 2 %琼脂糖电泳检测.在电泳初步定量结果基础上, 将PCR产物用Promega公司的QuantiFluorTM -ST蓝色荧光定量系统进行检测定量, 之后针对不同样本的测序量要求, 进行相应比例的混合.
2 结果与讨论2.1 反应器运行状态ANAMMOX反应器启动历时30 d, 负荷提升后稳定运行40 d, 处理效果如图 2所示.反应器运行0到30 d, 进水TN质量浓度从100 mg/L逐渐上升到600 mg/L, 进水总氮负荷从0.1 kg·N·m-3·d-1提高到0.6 kg·N·m-3·d-1, 总氮去除率稳定保持在80 %左右.之后保持进水浓度不变, 逐渐缩短停留时间, 第61 d, 停留时间从24 h逐渐缩短至12 h, 总氮负荷提高到1.3 kg·N·m-3·d-1, 去除负荷达到1.04 kg·N·m-3·d-1.反应器在此负荷下持续运行, 总氮去除率始终保持在75 %以上.说明本研究所用ANAMMOX反应器在短时间内获得了较高的氮去除负荷, 快速启动成功.
图 2(Fig. 2)
 | 图 2 反应器运行状态Fig.2 Running state of reactor |
2.2 菌群丰度和多样性分析通过高通量测序得到待测样品的微生物种群分布中Alpha多样性相关的各项指标见表 1.
表 1(Table 1)
 表 1 污泥样品的Alpha多样性Table 1 Alpha diversity of different activated sludge samples
| 表 1 污泥样品的Alpha多样性 Table 1 Alpha diversity of different activated sludge samples |
Coverage指数反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况, 其数值高低反映了样本中序列被测出的概率.本实验的待测样品的Coverage值均大于99.7 %, 能够确保测序结果代表样品中的微生物组成.Ace, Chao指数表征微生物种群丰度, 可以对群落中OTU数进行估计, 数值越大表示物种总数越多.从表 1可知, 反应器填料下部样本1号、2号、3号的Ace和Chao指数先增大再逐渐平稳, 反映出反应器启动初期生物多样性和群落复杂程度逐渐增加, 在稳定运行后, 生物多样性与群落分布逐渐稳定, 4号的两个指数均低于其他样本, 说明填料上部微生物群落相对纯净.Shannon和Simpson指数可以反映出功能菌属的多样性.Simpson指数越高, 表明群落多样性越低, 而Shannon指数正相反.Shannon指数也呈现先增大再平稳最后减小的变化趋势.而Simpson指数的变化与Shannon指数相反.但两者反映出的生物多样性和群落变化结果与Ace和Chao指数的结果完全相同.
2.3 运行期间微生物群落变化2.3.1 微生物群落在门分类层面上的比对图 3是ANAMMOX反应器种泥、运行第30 d污泥、运行第90 d污泥的微生物群落组成.3个样品共检测到9个菌门, 其中共同拥有并占有较大比例的是绿菌门(Chlorobi), 变形菌门(Proteobacteria), 绿曲挠菌门(Chloroflexi), 拟杆菌门(Bacteroidetes), 浮霉菌门(Planctomycetes).其中和脱氮相关的有浮霉菌门和变形菌门, 占总菌门比例的40 %左右, 见表 2.
图 3(Fig. 3)
 | 图 3 ANAMMOX反应器不同时期微生物群落门水平分类Fig.3 Composition of microbial community structure in different period of ANAMMOX reactor at a phylum level |
表 2(Table 2)
表 2 反应器主要功能细菌群落构成占比(门水平)Table 2 Relative percentage of the denitrifying bacterial in the ANAMMOX reactor
| 表 2 反应器主要功能细菌群落构成占比(门水平) Table 2 Relative percentage of the denitrifying bacterial in the ANAMMOX reactor | |||||||||||||||||||||||||
反应器从开始启动到实现较高负荷下稳定运行, 变形菌门始终是污泥中最主要微生物种群.在第0 d和第30 d时占比基本没有变化, 稳定在34 %左右, 虽然在第90 d时下降到27 %，但仍高于其他微生物种群.这与其他研究人员所得ANAMMOX反应器功能菌群分布类似.Bae等[5]发现在启动成功的反应器中变形菌门占42 %, 高于浮霉菌门的20 %.陈重军等[4]在ABR ANAMMOX反应器中发现各格室变形菌门均为最主要的菌种, 在脱氮菌中占有最重要的地位.ANAMMOX菌所在的浮霉菌门所占比例随运行时间的增加有了明显提高, 从5.4 %左右提高到14.8 %, 增幅达到9.4 %.说明反应器内的ANAMMOX菌大量繁殖, 本实验对ANAMMOX菌富集取得了非常显著的效果.
而其他非脱氮细菌, 如绿曲挠菌门、绿菌门、拟杆菌门等也常在ANAMMOX反应器中被检测到.但它们在ANAMMOX反应中起何种作用还有待进一步研究.
对比第30 d和第90 d污泥样品中浮霉菌门所占比例的变化发现(见表 2).从30 d到90 d, 浮霉菌门所占比例仅有1.3 %的增长, 相比于第0 d到第30 d时8.1 %的增长速度, 增速明显放缓.推测可能是由于污泥样品均取自填料下部, 而填料下部周围堆积了许多未附着在填料上的污泥, 使得其附近水流流动不畅, 造成细菌间物质交换效率低下, 从而使细菌繁殖减缓.为了验证这种推测, 对反应器填料上部和下部污泥的微生物群落结构进行对比, 如图 4所示.填料上部污泥中检测到的细菌种类与下部基本相同, 但各菌种间的比例明显不同.与下部污泥相比, 上部污泥中绿菌门所占比例大幅减少仅剩5.4 %左右.而与脱氮相关的浮霉菌门和变形菌门所占比例大幅增加, 占比超过50 %, 且增加主要是由ANAMMOX菌所在的浮霉菌门比例上升引起.上部污泥中浮霉菌门占比达到27.7 %, 远高于下部污泥的14.8 %.分析原因是由于填料下部周围物质交换效率低下, 限制了浮霉菌门的繁殖, 虽然上部开始污泥挂膜量不如下部, 但由于物质交互充分, 细菌繁殖速度很快, ANAMMOX菌所在的浮霉菌门反而获得了更好的富集效果.这也说明保证反应器内微生物与周边环境充分的物质交换对ANAMMOX菌的快速富集有非常重要的作用.
图 4(Fig. 4)
 | 图 4 ANAMMOX反应器不同位置微生物群落门水平分类Fig.4 Composition of microbial community structure in different position of reactor at a phylum level |
对所有样品的群落结构相似度进行比较, 得到相似度树状图, 见图 5.样品间相似程度越高则在树状图中位置越靠近.反应器稳定运行阶段的两个污泥样品(样品2和3)在树状图中位置最接近, 相似程度最高.它们与反应器启动时的污泥(样品1)已经存在一定程度的差异.说明反应器从启动到稳定运行, 内部群落结构不断变化, 反应器稳定后菌群结构也趋于稳定.而反应器上部污泥(样品4)与其他几个样品间差异性明显, 说明即使在同一反应器内, 填料不同位置物质交换的微小差异也会对微生物群落的构成产生影响.
图 5(Fig. 5)
 | 图 5 不同样本间相似度树状图Fig.5 Tree of similarity among different samples |
2.3.2 微生物群落在属分类层面上的比对门分类学水平相对较高, 包含物种数量较多.而属分类学水平的分析更加精细, 为了进一步阐明反应器运行过程中微生物群落的演化, 从属的层面上对反应器内微生物群落结构进行分析.
选择在系统中占有较大比例且是反应器脱氮功能的主要来源的浮霉菌门进行分析.浮霉菌门生物学分类如表 3所示[6].
表 3(Table 3)
表 3 浮霉菌门生物学分类Table 3 Taxonomy of phylum Planctomycetes
| 表 3 浮霉菌门生物学分类 Table 3 Taxonomy of phylum Planctomycetes |
图 6是第90 d时所取污泥样品的浮霉菌门群落组成.其中的Candidatus Kuenenia属和Candidatus Brocadia属是具有厌氧氨氧化功能的菌属.Candidatus Kuenenia属发现于德国斯图加特废水处理厂, 以CO2为唯一碳源, 将NO2-—N氧化成NO3-—N获得能量[7].而Candidatus Brocadia属是第一个获得富集鉴定的ANAMMOX菌种[8].本研究的ANAMMOX反应器中Candidatus Kuenenia属是占据优势的ANAMMOX细菌.在上部和下部污泥的浮霉菌门中分别占比74 %和44 %.研究表明在不同的生存环境中, ANAMMOX菌的群落结构存在差异, 在某一稳定的生长环境中, 通常只有一个种属的ANAMMOX菌占据优势[9].这与本实验的结果也相吻合.
图 6(Fig. 6)
 | 图 6 反应器浮霉菌门的组成占比(属水平)Fig.6 Constituent proportion of the Planctomycetes bacterial communities in the reactor at a genus level (a)—填料下部污泥；(b)—填料上部污泥. |
在上部污泥中出现了下部污泥所没有的Candidatus Brocadia属, 且SM1A02属的细菌所占比例大幅提高.其原因可能是反应器不同位置物质交换效率的差异引起的.
除浮霉菌门外, 反应器中还存在许多变形菌门.绿曲挠菌门, 绿菌门的细菌与ANAMMOX菌共存.这些细菌当中有些具有亚硝化功能, 如亚硝化单细胞菌属(Nitrosomonas), 有些具有反硝化作用, 像Denitratisoma属, 变形菌门中的某些细菌还具有丝状菌的功能, 能够构建网状结构利于ANAMMOX菌的富集生长[10].另外反硝化菌和丝状菌的存在也有助于分解水中的有机质, 为ANAMMOX菌的生长创造有利条件.
3 结论1) 研究所用ANAMMOX反应器在61 d内就获得总氮负荷1.3 kg·N·m-3·d-1, 氮去除负荷1.04 kg·N·m-3·d-1的处理能力, 并在此负荷下持续稳定运行30 d以上, 总氮去除率始终保持在75 %以上.
2) 高通量测序分析结果表明ANAMMOX反应器启动到稳定过程中微生物群落结构趋于稳定.其中变形菌门和浮霉菌门合计占比达到40 %以上.ANAMMOX菌所在的浮霉菌门比例随运行时间延长而逐渐增加, 是反应器脱氮效能提高的主要原因.反应器内占据优势地位的ANAMMOX菌主要是Candidatus Kuenenia属, 占比达到14 %左右, 同时也有少量Candidatus Brocadia属的ANAMMOX菌.
3) 同一反应器内填料不同位置的微生物群落结构存在较大差异, 反应器脱氮效能的稳定依赖于功能菌种群的稳定.反应器内不同位置物质交换效率的差异导致了微生物群落结构的差异.微生物物质交换越充分, ANAMMOX菌富集速度越快.
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