刘冬, 邵安林, 赵鑫, 金长宇
东北大学 资源与土木工程学院, 辽宁 沈阳 110819
收稿日期：2017-09-25
基金项目：国家自然科学基金资助项目(51109035)；“十二五”国家科技支撑重点计划项目(2016YFC0801605);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(N170104025)。
作者简介：刘冬(1990-)，男，辽宁本溪人，东北大学博士研究生;
邵安林(1963-)，男，黑龙江肇东人，东北大学教授，博士生导师，中国工程院院士;
金长宇(1979-)，男，辽宁鞍山人，东北大学教授。

摘要：针对混合花岗岩开展了巴氏芽孢杆菌诱导碳酸钙沉积的结构面修复试验研究.在实验室内对巴氏芽孢杆菌活化培养, 利用电导率变化量表征巴氏芽孢杆菌脲酶活性, 考察其生长规律与理化特性.借助XRD, EDS及SEM等手段对结构面处巴氏芽孢杆菌诱导产物进行分析.研究表明, 选用22~28 h培养后的菌液, 巴氏芽孢杆菌脲酶活性最高; 30 ℃, pH为8的理化环境最适合巴氏芽孢杆菌生长繁殖; 巴氏芽孢杆菌在结构面处的沉积产物为5~10 μm的立方体状碳酸钙晶体, 以螺旋位错结晶方式生长, 最终将结构面胶结在一起, 达到结构面修复的目的.
关键词：岩体结构面微生物修复碳酸钙
Healing Experiment for Rock Mass Structural Plane Based on Bacterially Induced Calcium Carbonate
LIU Dong, SHAO An-lin, ZHAO Xin, JIN Chang-yu
School of Resources & Civil Engineering, Northeastern University, Shenyang 110819, China
Corresponding author: SHAO An-lin, professor, E-mail: alshao@163.com
Abstract: Sporosarcina pasteurii-induced calcium carbonate precipitation was used to heal structural planes of migmatitic granite. Conductivity variations was applied to characterize the urease activity for bacteria liquid to investigate the growth law and physicochemical properties of Sporosarcina pasteurii after curing in activated culture. Additionally, microscopic methods including XRD, EDS and SEM were conducted to analyze the induced products of Sporosarcina pasteurii on structural planes. The results show that, the urease activity for bacteria liquid of Sporosarcina pasteurii is the highest after curing 22 ~ 28 hours. The optimum physicochemical environment for Sporosarcina pasteurii growth is 30 ℃ at pH 8. The sediment product produced by Sporosarcina pasteurii on structural planes is cubic crystals with a side length of 5~10 μm, and they grow in a way of screw dislocation to backfill and then repair structures planes.
Key Words: rock massstructural planebacteriahealingcalcium carbonate
天然岩体在长期地质构造作用下, 内部生成大量节理、断层等结构面, 这些结构面不仅大大削弱了岩体完整性, 同时改变了岩体的力学特性, 大量工程地质灾害表明, 岩体中结构面的开裂与滑移是岩土工程失稳的主要诱因.自20世纪50年代开始, 全世界岩土工程专家就开始通过物理与化学等方法对结构面进行加固修复研究.其中, 微生物诱导碳酸钙沉积作为一种新型岩土体加固技术, 从20世纪90年代开始被大量学者进行了广泛的试验研究, 并获得了诸多科研成果.
Adolphe等^[1]率先利用微生物诱导碳酸钙来充填石材中的裂隙, 进而推动了世界范围内对这项技术的研究.Kantzas等^[2]通过微生物诱导产生的碳酸钙作为沙粒固结剂, 不仅降低了沙柱孔隙率, 同时减少了沙柱透气性.Chu等^[3]研究得到了砂柱通过碳酸钙胶结固化后的UCS与其方解石沉积量的线性经验公式.Gollapudi等^[4]发现将某种微生物和沙混合并注入营养液, 成功封堵了岩体裂隙, 使其渗透率接近0.Dick等^[5]选择合适的芽孢杆菌, 在风化严重的石灰石表面沉积出碳酸钙, 大大降低了石灰石表面毛细吸水系数.Whiffin等^[6]发现微生物诱导碳酸钙沉积作用可使土壤透水性降低达22%~75%.Rodriguez-Navarro等^[7]利用一种黏球菌诱导产生的碳酸钙沉淀可以有效地保护和修复石灰岩艺术品, 并且通过改变培养基中的磷酸盐浓度影响产生碳酸钙的晶形, 或为方解石, 或为球霰石.Kim等^[8]研究了土体的相对密实度与颗粒级配对碳酸钙胶结效果的影响.Jonkers等^[9-10]系统地研究了通过微生物诱导碳酸钙沉淀来实现混凝土的自修复作用, 发现好氧菌通过自身新陈代谢的呼吸作用, 能够将特定的有机钙如乳酸钙、甲酸钙转变形成方解石.Qian等^[11]利用某种细菌的酶化反应使底物分解产生碳酸根, 再通过人工引进钙离子, 使水泥石表面沉积出一层坚硬致密的碳酸钙.
上述研究成果主要针对岩土体进行的微生物诱导碳酸钙沉积修复技术, 而对微生物的理化特性以及对岩体结构面修复技术的研究较少.本文对巴氏芽孢杆菌的生长特征、脲酶活性、适宜繁殖的温度与pH等开展了研究工作, 并在岩体结构面处成功诱导出碳酸钙沉淀, 通过XRD, EDS与SEM等手段发现诱导产生的碳酸钙沉淀呈螺旋位错结晶形式, 晶体生长良好, 将结构面胶结在一起, 实现了岩体结构面的修复工作.
1 巴氏芽孢杆菌培养与研究1.1 菌种及培养试验所用的微生物是从中国普通微生物菌种保藏管理中心购置的巴氏芽孢杆菌(Sporosarcina pasteurii)(冻干粉).以10 g/L蛋白胨、3 g/L牛肉浸取物、5 g/L NaCl混合配制培养基, pH调为7.0, 分装于三角瓶中, 121 ℃高压灭菌20 min, 取出至无菌超净台待用; 接种活化后的巴氏芽孢杆菌于无菌培养基, 在30 ℃、振荡频率170 r/min的SHZ-82A型振荡培养箱中培养.于Motic BA210型显微镜下观察巴氏芽孢杆菌个体生长特征, 如图 1所示, 菌株呈杆状, 长约1~3 μm, 直径0.5 μm左右.24 h内于不同时间点取样6次, 采用平板菌落计数法计数并同时通过UVmini-1240型分光光度计测其菌液在光波长为600 nm下的光密度(OD)值, 绘制巴氏芽孢杆菌菌液生物量与菌液OD值关系的标准曲线, 如图 2所示.
图 1(Fig. 1)

图 1 巴氏芽孢杆菌个体生长特征Fig.1 Individual growth characteristics of Sporosarcina pasteurii

图 2(Fig. 2)

图 2 巴氏芽孢杆菌菌液生物量与OD值标准曲线图Fig.2 Standard curve for the relationship between the Sporosarcina pasteurii biomass and the OD value

1.2 细菌生长与脲酶活性为了定量研究巴氏芽孢杆菌水解尿素的能力, Whiffin^[12]证明了尿素水解量与溶液电导率变化量成正比，并提出将菌液加入1.5 mol/L的尿素按一定倍数稀释后, 测量每分钟电导率变化量来衡量脲酶活性的方法.
本试验以体积分数为1%的接种量, 在30 ℃, 振荡频率为170 r/min的振荡培养箱中连续培养, 选取了若干时间点测量其OD值, 再取1 mL菌液加入9 mL的浓度为1.5 mol/L尿素试管中测定每分钟电导率变化量(电导率仪型号为DDS-11A).根据文献[12]中的经验数值, 每分钟电导率变化量对应11 mmol/L的尿素水解量, 进而可以换算得到单位时间内的尿素水解量, 再乘以稀释倍数10, 便得到待测菌液每分钟的尿素水解量, 用此值表示脲酶活性.脲酶活性值除以菌液的OD值, 即得到单位脲酶活性.
巴氏芽孢杆菌生长曲线与脲酶活性曲线如图 3所示.根据曲线可以得到, 0~6 h内, 细菌繁殖比较缓慢, 此时处于延滞期; 6~22 h之间, 细菌繁殖以几何级数快速增长, 此阶段处于对数期; 22 h以后, 随着环境中营养物质消耗与有毒产物积累, 死亡细菌与新繁殖细菌处于动态平衡, 此时为稳定期.菌液的脲酶活性变化趋势与生长曲线基本一致, 即随着菌液OD值的增大, 分解尿素的能力也逐渐增强, 在22 h以后基本趋于稳定.单位脲酶活性在6 h时出现峰值后, 随菌液OD值增加而逐渐减小, 这是由于受培养过程中pH、培养时间等因素影响, 使其变化规律较为复杂, 因此试验中更关心的是菌液的脲酶活性, 综合其生长曲线分析, 试验中选用22~28 h培养后的菌液为宜.
图 3(Fig. 3)

图 3 巴氏芽孢杆菌生长曲线与脲酶活性曲线Fig.3 Growth curves of Sporosarcina pasteurii and curves of urease activity

1.3 温度与pH对巴氏芽孢杆菌生长的影响温度与pH是影响生物体生命活动的重要因素.试验研究了体积分数为1%的接种量条件下, 设置温度梯度分别为20, 25, 30, 35 ℃, 在振荡培养箱(170 r/min)中培养24 h后测定菌液OD值与脲酶活性, 如图 4所示.
图 4(Fig. 4)

图 4 不同温度下的菌液OD值与脲酶活性变化Fig.4 Variation of bacterial OD value and urease activity under different temperatures

由图 4可以看出, 随着温度的增加, 菌液OD值在30 ℃时达到峰值, 细菌繁殖数量最多, 随后出现下降趋势.脲酶活性与菌液OD值的变化情况基本一致.因此对巴氏芽孢杆菌进行大规模培养时, 以30 ℃的培养温度最为合适.
为了研究不同酸碱条件下细菌生长繁殖情况, 本试验预先配置好一系列灭菌的液体培养基, 并将初始pH分别调制为6, 8, 10, 12, 13, 以体积分数为1%的接种量在振荡培养箱中培养(30 ℃, 170 r/min).每隔一定时间测量各组培养基的OD值, 绘制曲线如图 5所示.
图 5(Fig. 5)

图 5 不同初始pH下巴氏芽孢杆菌生长曲线Fig.5 Growth curves of Sporosarcina pasteurii under different initial pH

从图 5可看出, pH为8时, 细菌生长速率最快, 稳定期时菌液OD值最大, 说明pH为8时最适合巴氏芽孢杆菌的生长繁殖.在pH为6的酸性环境中, 稳定期时的菌液OD值相比pH为8时明显降低, 而当在pH为12, 13的碱性环境中, 细菌的生长受到抑制, 繁殖能力降低, 并且碱性越强, 菌液OD值越低.
2 微生物沉积碳酸钙研究基于以上研究, 巴氏芽孢杆菌可以通过新陈代谢而产生大量脲酶, 使环境中的尿素分解, 生成CO₃^2-, 不断与环境中的Ca²⁺结合, 直到晶体前驱物的浓度增大到利于核化, 进而缓慢沉积出CaCO₃颗粒.
2.1 微生物沉积碳酸钙试验本试验以混合花岗岩制作30 mm×30 mm×30 mm的立方体试件, 分别将每两个立方体试件组合, 将其接触面作为试验的结构面.巴氏芽孢杆菌菌株培养24 h后, 在4 ℃, 8 000 r/min条件下离心10 min(离心机型号为5424R), 去掉上层清液, 用新鲜培养基洗出, 通过测定其OD值换算出菌液生物量为2×10¹⁰个/mL.将高浓度菌株湿细胞混合0.2 mol/L的尿素和0.2 mol/L CaCl₂溶液, 喷涂于试件结构面处, 此后每隔6 h, 往组合试件的中间缝隙处滴加0.2 mol/L尿素, 0.2 mol/L CaCl₂以及培养基的混合溶液2 mL, 持续7 d, 然后于室温下静置90 d后, 研究微生物诱导碳酸钙沉积修复情况.
2.2 沉积产物分析如图 6所示, 90 d后每两个立方体试件均被粘结在一起.为了分析结构面处诱导的沉积物质, 将结构面分离, 肉眼清晰可见连续的白色沉积产物.取样借助XRD仪(型号X’ Pert Pro)分析, 如图 7所示, 试验结果的图谱与CaCO₃标准XRD图谱(JCPDS#01-081-2027)吻合, 说明沉积产物为CaCO₃.
图 6(Fig. 6)

图 6 被粘结的试件与白色沉积产物Fig.6 Bonded specimen and white precipitates (a)—粘结在一起的试件；(b)—结构面处白色沉积产物.

图 7(Fig. 7)

图 7 白色沉积产物XRD图谱Fig.7 XRD spectrum of white precipitates

为了进一步分析沉积产物的构成与微观形态, 对结构面制样、喷金, 利用扫描电镜(SEM)(型号Ultra Plus)及其附带的能谱仪(EDS)对沉积颗粒进行能谱分析并观察颗粒形貌.如图 8所示, 由于试验岩石试件为混合花岗岩, 故EDS分层图像中底层主要为Si, Al元素, 在结构面上层可以明显看出覆盖大量的C, O, Ca三种元素.分别取Ⅰ~Ⅳ 4个区域进行能谱分析, 如图 9所示, 能谱显示沉积产物主要含C, O, Ca三种元素, 验证了沉积物质为CaCO₃.
图 8(Fig. 8)

图 8 沉积产物分层图像Fig.8 Stratified image of precipitates

图 9(Fig. 9)

图 9 沉积产物EDS分析Fig.9 EDS analysis of precipitates (a)—图 8Ⅰ区；(b)—图 8Ⅱ区；(c)—图 8Ⅲ区；(d)—图 8Ⅳ区.

由于本文试验中选用培养24 h后的菌液, 此时细菌活性最高, 故Ca²⁺浓度对碳酸钙晶型的影响可被忽略^[13].利用扫描电镜观察碳酸钙颗粒形貌, 参见图 10a, 碳酸钙颗粒相互聚集在一起形成密实的膜层, 大多呈立方体状, 棱角分明, 结晶生长良好.根据图 3曲线换算可得, 巴氏芽孢杆菌培养过程中生物量最高为1.6×10⁹个/mL, 而采用离心获取的菌株湿细胞生物量为2×10¹⁰个/mL, 生物量提高近13倍, 使得微环境中水溶性有机质提高, 碳酸钙晶体生长过程中受有机蛋白质大分子调控更加明显, 如图 10b所示, 晶体出现多级生长和螺旋位错结晶现象, 结晶尺寸约在5~10 μm.
图 10(Fig. 10)

图 10 结构面上CaCO3颗粒SEM照片Fig.10 SEM images for CaCO3 particles on structural plane (a)—花岗岩表面和CaCO3晶体；(b)—CaCO3晶体.

3 结论1) 通过对巴氏芽孢杆菌的生长规律研究发现, 试验选用22~28 h培养后的菌液, 其脲酶活性最高; 对巴氏芽孢杆菌进行大规模培养时, 以30 ℃的培养温度最为合适; pH为8时最适合巴氏芽孢杆菌的生长繁殖.
2) 通过XRD与EDS分析, 说明巴氏芽孢杆菌在岩石试件结构面上诱导的沉积产物为CaCO₃.
3) 通过SEM观察CaCO₃颗粒形貌, 晶体呈立方体状, 棱角分明, 呈多级生长与螺旋位错结晶现象, 结晶尺寸约在5~10 μm.
4) 微生物诱导碳酸钙沉淀作为修复岩体裂隙以及结构面的技术手段是可行的.试验采用混合花岗岩作为待修复的结构面, 后续将开展不同基体对碳酸钙生长的影响以及修复后结构面的力学性能测试研究.
参考文献

[1]	Adolphe J P, Loubière J F, Paradas J, et al. Procédé de traitement biologique d'une surface artificielle: EP 0388304 A1[P]. 1990.
[2]	Kantzas A, Stehmeier L, Marentette D F, et al. A novel method of sand consolidation through bacteriogenic mineral plugging[C]//Annual Technical Meeting, Petroleum Society of Canada. Calgary, 1992: 1-15.
[3]	Chu J, Ivanov V, Naeimi M, et al. Optimization of calcium-based bioclogging and biocementation of sand[J].Acta Geotechnica, 2013, 9(2): 1–9.
[4]	Gollapudi U K, Knutson C L, Bang S S, et al. A new method for controlling leaching through permeable channels[J].Chemosphere, 1995, 30(4): 695–705.DOI:10.1016/0045-6535(94)00435-W
[5]	Dick J, Windt W D, Graef B D, et al. Bio-deposition of a calcium carbonate layer on degraded limestone by Bacillus species[J].Biodegradation, 2006, 17(4): 357–367.DOI:10.1007/s10532-005-9006-x
[6]	Whiffin V S, van Paassen L A, Harkes M P. Microbial carbonate precipitation as a soil improvement technique[J].Geomicrobiology Journal, 2007, 24(5): 417–423.DOI:10.1080/01490450701436505
[7]	Rodriguez-Navarro C, Rodriguez-Gallego M, Ben C K, et al. Conservation of ornamental stone by Myxococcus xanthus-induced carbonate biomineralisation[J].Applied & Environmental Microbiology, 2003, 69(4): 2182–2193.
[8]	Kim D, Park K, Kim D. Effects of ground conditions on microbial cementation in soils[J].Materials, 2013, 7(1): 143–156.DOI:10.3390/ma7010143
[9]	Jonkers H M, Schlangen E. Crack repair by concrete-immobilized bacteria[C]// Proceedings of the First International Conference on Self Healing Materials. Noordwijk, 2007: 18-20.
[10]	Jonkers H M, Thijssen A, Muyzer G, et al. Application of bacteria as self-healing agent for the development of sustainable concrete[J].Ecological Engineering, 2010, 36(2): 230–235.DOI:10.1016/j.ecoleng.2008.12.036
[11]	Qian C X, Wang J Y, Wang R X, et al. Corrosion protection of cement-based building materials by surface deposition of CaCO3 by Bacillus pasteurii[J].Materials Science & Engineering:C, 2009, 29(4): 1273–1280.
[12]	Whiffin V S. Microbial CaCO3 precipitation for the production of biocement[D]. Perth: Murdoch University, 2004.
[13]	王剑云, 钱春香, 王瑞兴, 等. 菌液浸泡法在水泥基材料表面覆膜研究[J].硅酸盐学报, 2009, 37(7): 1097–1102. ( Wang Jian-yun, Qian Chun-xiang, Wang Rui-xing, et al. Application of carbonate-mineralization bacterium in surface protection of cement based materials[J].Journal of the Chinese Ceramic Society, 2009, 37(7): 1097–1102.)