图1.论文版头
从海洋到陆地，动物的登陆是进化史上的重大事件。由于海水具有较高的比热容，海洋生境的温度较为稳定，而陆地生境的温度波动则非常剧烈。为了应对更为剧烈的温度波动，陆生动物需要快速而精确的温度响应能力来识别陆地生境复杂的温度信号。在分子层面，皮下感觉神经末梢上分布的温度敏感TRP离子通道是动物的温度感受器。其中，动物对“热”或“温暖”的感受是一切生命过程的前提和保障，所以，热敏感受体基因的起源是古老的（譬如，trpv1基因广泛存在于鱼类、昆虫类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳动物中）。相较于热敏感受体，编码冷感受器的trpm8基因并未在鱼类及更为低等动物的基因组中被发现，仅在陆生脊椎动物的基因组中被注释。因此，揭示trpm8基因的起源及其功能获得的机理能够深化我们对动物生境温度探测及其适应性进化的理解，同时能在生物物理层面深入剖析冷感受器TRPM8响应低温的结构功能机理。
近年来，东北林业大学杨仕隆教授团队围绕温度敏感受体的结构功能与动物生存适应策略开展了一系列研究工作(PNAS 2013/2019/2020a,b; NatCommun2015/2019/2020;CurrBiol 2021; Sci Adv 2017/2020;PloSBiol 2018; Natl Sci Rev 2018等)。需要提及的是，该团队前期研究揭示了TRPM8孔区氨基酸的疏水性改变能够有效调控其冷激活效率，并发现了陆生脊椎动物广泛采用这种策略以适应物种特异的生境温度（PNAS, 2020a）。显然，这种策略虽调控了陆生脊椎动物TRPM8的冷激活效率，但并非是TRPM8进化中获得冷激活功能的机理。为了构建TRPM8“起源—冷激活功能获得—冷激活效率调控”的完整机制，该团队继续了trpm8基因起源和功能进化的研究，探讨了TRPM8冷激活功能获得的机理及其与动物水陆演化之间的关系。
研究人员通过对不同物种基因组的分析发现，硬骨鱼不具有trpm8基因，现存最早进化出trpm8基因的物种是肺鱼（所有陆生四足动物的祖先）。在肺鱼基因扩张的过程中，trpm2基因的复制和外显子的重排形成了trpm8基因雏形（编码的蛋白不具备功能）。为了揭示trpm8基因的功能进化，研究人员检测了不同脊椎动物TRPM8通道的功能，发现除肺鱼（Pa）、蚓螈(Rb)和绿海龟(Cm)外，其他两栖和爬行动物的TRPM8都能够被冷激活，提示TRPM8的功能获得可能出现在动物登陆的适应性进化过程中。而肺鱼、原始的两栖动物蚓螈以及水生的绿海龟则为探究TRPM8冷激活功能获得的分子机制提供了机会。
研究人员进而对硬骨鱼、肺鱼和两爬动物的TRPM8进行了正选择进化分析，发现具有冷敏感性的TRPM8通道正选择位点主要集中于N端。通过对N端嵌合体和突变体的功能检测证实：MHR1-3是决定TRPM8是否具有冷敏感性的关键结构域，MHR1-3在冷敏感性TRPM8和非冷敏感性TRPM8之间的相互替换能够赋予或消除TRPM8的冷激活过程。为了进一步检测MHR1-3结构域独立响应低温的变构能力，研究人员引入了非天然氨基酸ANAP荧光成像、蛋白质三维结构计算建模、不同温度下的凝胶色谱和圆二色谱等手段，并发现非冷敏感性TRPM8的MHR1-3不具有低温变构的能力（譬如肺鱼、蚓螈和绿海龟），而冷敏感性TRPM8的MHR1-3结构域能够独立响应低温进行构象变化（譬如爪蟾、陆龟、蛇等）。
而孔区的进化选择则发生在陆生脊椎动物的演化中，这种机制通过调整孔区的整体疏水性来调控TRPM8的冷激活效率，进而辅助陆生脊椎动物适应生境温度。研究人员还发现，MHR1-3结构域是孔区进行冷激活效率调控的前提，若MHR1-3不具备独立的温度变构能力，则单独的孔区疏水性调节无法使非冷敏感性TRPM8获得冷敏感性。因此，陆生脊椎动物在进化出低温响应MHR1-3结构域的基础上，进而通过物种特异性的孔区结构域来调节TRPM8的冷激活效率。
综上所述，该研究提出了TRPM8冷激活功能的两步进化机制：1）在动物由水生向陆生演化的过程中，为了应对陆生环境的剧烈温度波动，两栖类和爬行类TRPM8的MHR1-3结构域发生结构功能进化，赋予了这些物种TRPM8冷敏感性以及对低温的瞬时感知能力；2）登陆后的陆生脊椎动物通过孔区结构域的进化来调节TRPM8的冷激活效率，进而辅助不同陆生脊椎动物特异的生境温度适应（图2）。该研究不仅推进了我们对低温感知起源和进化的理解，同时在生物物理层面深化了对TRPM8冷激活机制的认识，构建了TRPM8“起源—冷激活功能获得—冷激活效率调控”的完整机制。
图2. TRPM8冷激活起源和进化机制
东北林业大学陆先翠副教授、博士研究生姚志豪以及王云飞副教授为该论文的共同第一作者，东北林业大学杨仕隆教授和中国科学院昆明动物研究所赖仞研究员为该论文的共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金项目、黑龙省科技厅、国家林业和草原局等项目的支持。
全文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2201349119
