, 郑裕国1,2 1. 浙江工业大学 生物工程学院 生物有机合成技术研究浙江省重点实验室，浙江 杭州 310014;
2. 浙江工业大学 生物工程学院 生物转化与生物净化教育部工程研究中心，浙江 杭州 310014
收稿日期：2020-09-25；接收日期：2021-02-02
基金项目：国家重点研发计划(No. 2017YFE0129400)，浙江省博士后科研择优资助项目(No. ZJ2020125) 资助
通讯作者：Renchao Zheng. Tel: +86-571-88320391; Fax: +86-571-88320884; E-mail: zhengrc@zjut.edu.cn.
摘要：以微水溶剂热法快速制备的稳定锆基金属有机框架为载体，戊二醛为交联剂，采用交联法对酰胺酶进行固定化，考察了不同条件对酰胺酶固定化效率的影响。结果表明，戊二醛浓度为1.0%、交联时间为180 min、载体与酶的质量比为8︰1，固定化效率最佳，固定化酶活力回收率达86.4%，蛋白负载量达115.3 mg/g。固定化酶最适温度为40 ℃，最适pH值为9.0，在40 ℃下半衰期为72.2 d，该固定化酶的Km为58.32 mmol/L，Vmax为16.23 μmol/(min·mg)，kcat为1 670 s–1。此外，考察了固定化酶催化合成(S)-4-氟苯甘氨酸的工艺：最适底物浓度300 mmol/L，固定化酶用量10 g/L，反应时间180 min，在最佳反应条件下转化率达49.9%，对映体过量(Enantiomeric excess，e.e.) 为99.9%。进一步考察了该固定化酶分批催化反应性能，重复使用20批次后，固定化酶活力仍保留95.8%。
关键词：金属有机框架酰胺酶固定化(S)-4-氟苯甘氨酸
Synthesis of (S)-4-fluorophenylglycine by using immobilized amidase based on metal-organic framework
Chaoping Lin1,2, Jiangtao Tang1,2, Renchao Zheng1,2
, Yuguo Zheng1,2 1. Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province, College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, Zhejiang, China;
2. Engineering Research Center of Bioconversion and Biopurification, Ministry of Education, College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, Zhejiang, China
Received: September 25, 2020; Accepted: February 2, 2021
Supported by: National Key Research and Development Program of China (No. 2017YFE0129400), Postdoctoral Science Foundation of Zhejiang Province, China (No. ZJ2020125)
Abstract: A stable Zr-based metal-organic framework (MOF, UiO-66-NH2) synthesized via micro-water solvothermal method was used to immobilize amidase by using the glutaraldehyde crosslinking method. The effect of immoblization conditions on enzyme immoblization efficiency was studied. An activity recovery rate of 86.4% and an enzyme loading of 115.3 mg/g were achieved under the optimal conditions: glutaraldehyde concentration of 1.0%, cross-linking time of 180 min, and the weight ratio of MOF to enzyme of 8:1. The optimal temperature and optimal pH of the immobilized amidase were determined to be 40 ℃ and 9.0, respectively, and the Km, Vmax and kcat of the immoblized amidase were 58.32 mmol/L, 16.23 μmol/(min·mg), and 1 670 s–1, respectively. The immobilized enzyme was used for (S)-4-fluorophenylglycine synthesis and the optimal reaction conditions were 300 mmol/L of N-phenylacetyl-4-fluorophenylglycine, 10 g/L of immobilized enzyme loading, and reacting for 180 min at pH 9.0 and 40 ℃. A conversion rate of 49.9% was achieved under the optimal conditions, and the conversion rate can be increased to 99.9% under the conditions of enantiomeric excess. The immobilized enzyme can be repeatedly used, 95.8% of its original activity can be retained after 20 cycles.
Keywords: metal-organic frameworkamidaseimmobilization(S)-4-fluorophenylglycine
酶作为一种天然生物催化剂，具有催化效率高、特异性好、环境友好、反应条件温和等优势，被广泛应用于医药、能源、食品以及饲料等众多领域，被誉为工业生物技术的“芯片”[1-2]。酰胺酶(EC 3.5.1.4) 能够催化酰胺键水解合成手性羧酸及其衍生物。酰胺酶在制备光学纯氨基酸等系列活性化合物领域具有巨大的潜力[3-8]。然而，游离酶在催化反应中易受高温、强酸/强碱、有机溶剂等工业环境影响而失活，导致其表观催化活性较低，且难以回收和重复利用，使其在工业应用中受到限制。
为了提高酶催化剂的工业应用属性，固定化酶技术应运而生。固定化酶能够增强酶蛋白的稳定性，使其能够在苛刻的工业生产环境下表现出良好的催化活性和操作稳定性[9-11]。此外，固定化酶催化因操作简单、可重复使用及易于下游分离纯化等优势已成为合成手性化学品的理想途径之一。近年来，研究者成功将酰胺酶固定在有机、无机及杂化材料上，如壳聚糖、树脂、二氧化硅、碳纳米管等[12-14]，这些材料具有官能团丰富和机械强度高等优点而备受关注，但仍存在着各种弊端，如二氧化硅具有较高的孔隙率，但是后续固定化酶易泄露等；其他杂化材料存在着合成过程复杂、酶固定化过程易失活、不易回收利用等问题。因此，选择制备简单、高效、稳定的载体材料对酶固定化至关重要。
金属有机框架(Metal-organic frameworks，MOF) 是一种由有机配体和金属离子或团簇通过配位键自组装形成的具有分子内空隙的有机-无机杂化纳米材料[15-16]。金属有机框架因其结构的高度可调节性、丰富的配位位点、开放的框架结构和埃级孔道尺寸，为不同酶分子创造稳定的微环境，从而在极大地提高酶负载率的同时限制了酶分子的泄露，甚至极端条件下仍能维持酶的活性，已被广泛应用于酶的固定化[17-20]。
本研究以快速合成的稳定的金属有机框架(Fast-UiO-66-NH2) 作为载体，利用戊二醛交联法固定酰胺酶，研究了不同条件对蛋白固定化效率和酶活力回收率的影响，筛选获得了最佳的固定化条件。系统优化了固定化酰胺酶合成抗肿瘤化疗止吐药阿瑞匹坦手性中间体(S)-4-氟苯甘氨酸合成工艺，为大规模酶法生产(S)-4-氟苯甘氨酸提供了理论基础。
1 材料与方法1.1 材料与试剂酰胺酶由本实验室制备[16]。
N-苯乙酰-4-氟苯甘氨酸由本实验室制备[21]；异硫氰酸荧光素(FITC) 购于阿拉丁试剂有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司；氯化锆、氨基对苯二甲酸、戊二醛(50%) 均购于百灵威科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备恒温水浴振荡器SHA-C，德国Julabo SW22公司；SpectraMax M5，美国Molecular Devices公司；PFDS8508型冷冻干燥机，韩国浩瀚有限公司；超纯水系统，Sartorius公司。
1.3 酰胺酶的固定化1.3.1 金属有机框架Fast-UiO-66-NH2的制备采用微水溶剂热制备锆基金属有机框架材料。在250 mL圆底烧瓶中添加N, N-二甲基甲酰胺DMF (100 mL)、氨基对苯二甲酸(1.5 g，6.4 mmol)、氯化锆(1.17 g，6.44 mmol)、超纯水2 mL，混合后超声5 min，然后将混合液置于反应釜中加热至120 ℃反应20 min。冷却室温后，将溶液离心，沉淀用无水乙醇洗涤3次，得到的固体在50 ℃真空干燥12 h，即为金属有机框架Fast-UiO-66-NH2。
1.3.2 固定化酶的制备取制备的金属有机框架材料100 mg与酰胺酶20 mg加入到10 mL磷酸盐缓冲液(500 mmol/L，pH 8.0) 充分混合，加入一定量25% (W/V) 的戊二醛溶液。固定反应一定时间，离心除去上清。用磷酸盐缓冲液(100 mmol/L，pH 8.0) 清洗3次，自然风干，收集后保存待用。每一部分溶液采用BCA蛋白试剂盒测定蛋白含量，计算固定化效率和固定化酶活力回收率。采取单因素试验分别进行戊二醛浓度(0.1%–3.0%)、载体与酶的质量比(6︰1–12︰1)、固定化时间(30–270 min) 等条件优化。
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1.3.4 固定化酶酶学性质研究固定化酶反应体系1 mL：固定化酶10 mg，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(100 mmol/L，pH 9.0)，N-苯乙酰-4-氟-苯甘氨酸50 mmol/L。在20–50 ℃、200 r/min条件下反应3 min，随后离心分离固定化酶，取上清液用HPLC检测底物和产物。采用不同pH 7.0–11.0的缓冲溶液，加入固定化酶10 mg，N-苯乙酰-4-氟-苯甘氨酸50 mmol/L，在40 ℃、200 r/min条件下反应3 min，分离固定化酶，取上清检测。
将固定化酶置于不同温度(30–50 ℃) 的缓冲液中保温1–12 d后，定时取固定化酶测定活力，计算残存酶活力百分数(初始酶活力定义为100%)。将固定化酶置于pH 9.0、4 ℃下储藏，定时取样测定残存酶活力。
固定化酶反应体系1 mL：固定化酶10 mg，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(100 mmol/L，pH 9.0)，20–200 mmol/L N-苯乙酰-对氟苯甘氨酸。在40 ℃、200 r/min条件下反应3 min，随后分离固定化酶，取上清液用HPLC检测。
酶活力单位定义：在标准酶活力测定条件下，酶每分钟催化底物N-苯乙酰-对氟苯甘氨酸生成1 μmol/L (S)-4-氟苯甘氨酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位，即1 U。
N-苯乙酰-4-氟-苯甘氨酸和(S)-4-氟苯甘氨酸及e.e.的检测分析参考前期建立的高效液相色谱(HPLC) 方法[21]。
1.4 固定化酶催化合成(S)-4-氟苯甘氨酸将一定量固定化酶和底物N-苯乙酰-4-氟-苯甘氨酸加入10 mL的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0) 中，在40 ℃、200 r/min条件下反应一定时间，分离固定化酶，取上清用HPLC分析。采取单因素试验分别优化固定化酶用量(4–16 g/L)、底物浓度(100–350 mmol/L) 和反应时间(60–240 min)。
1.5 固定化酶的操作稳定性向25 mL锥形瓶中加入10 mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0) 与300 mmol/L的N-苯乙酰-4-氟-苯甘氨酸，接着加入10 g/L的固定化酶混匀，40 ℃恒温水浴摇床中反应180 min后取样测定底物转化率。每一批次反应结束后，离心回收固定化酶，用蒸馏水清洗3次后用于下批次反应，每批次实验重复3次，转化率取其平均值。
2 结果与分析2.1 金属有机框架结构的表征对合成的金属有机框架(Fast-UiO-66-NH2)进行表征，结果如图 1所示。样品呈现淡黄色粉末状，扫描电镜和透射电镜分析表明金属有机框架颗粒尺寸为200–300 nm。
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| 图 1 金属有框架的外观图(A)、扫描电镜图(B) 及透镜图(C) Fig. 1 Appearance (A), scanning electron microscope image (B) and transmission electron microscope image (C) of metal-organic framework. |
| 图选项 |
对金属有机框架进行N2等温吸-脱附、热重分析以及X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)测试表征，结果如图 2所示。N2等温吸-脱附(图 2A)、热重曲线(图 2B) 与XRD (图 2C) 衍射峰与文献报道溶剂热法合成金属有机框架相符[22]，合成时间仅需20 min，远比一般溶剂热法短(12–24 h)。金属有机框架比表面积达到769.3 cm2/g，其孔径分布在1.8 nm左右，故后续很难通过吸附对酶进行固定化。此外，考察了金属有机框架在pH 9.0条件下的稳定性，结果如图 2C所示。金属有机框架放置10 d的XRD衍射峰几乎未变化，表明金属有机框架比较稳定。
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| 图 2 金属有机框架的等温吸-脱附(A)、热重分析(B)及XRD图(C) Fig. 2 The N2 adsorption-desorption isotherms (A), TGA curve (B) and XRD (C) of metal-organic framework. |
| 图选项 |
2.2 固定化条件优化2.2.1 交联剂浓度对固定化效率的影响该金属有机框架孔径小，酶分子很难进入空隙内部，但其表面具有丰富的氨基基团，可为载体与酶分子进行交联提供反应位点。因此，采用戊二醛介导的交联法固定酰胺酶。
考察了戊二醛浓度对固定化的影响，结果如图 3所示。由图可知，随着戊二醛浓度从0.1%增加到1.0%，蛋白固定化效率和酶活力回收率都有所增加。当戊二醛浓度为1.0%时，酶活力回收率达到最高，继续增加戊二醛浓度，酶活力回收率下降趋势明显，蛋白固定化效率变化不大。故后续实验均采用的戊二醛浓度为1.0%。
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| 图 3 交联剂浓度对固定化效率的影响 Fig. 3 Effect of cross-linking agent concentration on immobilization efficiency. |
| 图选项 |
2.2.2 交联时间对固定化效率的影响交联时间是影响酶固定化的重要参数，交联时间过短，交联不完全，影响酶与载体结合的牢靠程度，导致后续使用过程中容易发生酶泄漏；交联时间过长，交联剂对酶蛋白有一定的毒害作用，导致固定化酶活力偏低。因此，考察了交联时间对酶固定化效率的影响，结果如图 4所示，当交联180 min时，酶活力回收率达到最高，延长交联时间，蛋白固定化效率缓慢增加，但酶活力回收率逐渐下降，因此，后续实验采用交联时间180 min。
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| 图 4 交联时间对固定化效率的影响 Fig. 4 Effect of cross-linking time on immobilization efficiency. |
| 图选项 |
2.2.3 金属有机框架与酶质量比对固定化效率的影响金属有机框架与酶的质量比同样是影响酶固定化效率的一个重要参数。比例过低，酶分子之间会发生交联作用导致酶的活力损失；比例过高，造成载体材料的浪费，使得酶蛋白固定效率下降。因此，考察了金属有机框架与酶质量比对固定化效率的影响，结果如图 5所示。当金属有机框架与酶质量比在6︰1至8︰1时，固定化酶活力回收率随之增大，蛋白固定化效率缓慢下降。
当该比例为8︰1时，固定化酶活力回收率达到86.4%，蛋白负载量达到115.3 mg/g，当该比例超过8︰1时，酶活力回收率急剧下降。故后续实验均采用载体与酶的质量比为8︰1。
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| 图 5 金属有机框架与酶的质量比对固定化效率的影响 Fig. 5 Effect of weight ratio of MOF to enzyme on immobilization efficiency. |
| 图选项 |
2.3 固定化酶物理特性图 6显示以FITC标记酰胺酶制备的固定化酶的激光共聚焦图像，图中可见分布的绿色荧光斑点。由于金属有机框架本身不是荧光材料，故所观察到的荧光信号是金属有机框架中固定的FITC-酰胺酶。结果表明，酶被固定于金属有机框架上。
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| 图 6 FITC-酰胺酶激光共聚焦显微镜图 Fig. 6 Confocal microscopy image of the FITC-amidase. |
| 图选项 |
图 7显示制备固定化酰胺酶的扫描电镜图像，图中金属有机框架表面聚集大量交联的酶蛋白，进一步验证酶成功固定在金属有机框架上。
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| 图 7 固定化酰胺酶扫描电镜图 Fig. 7 Scanning electron microscope images of the immobilized amidase. |
| 图选项 |
2.4 固定化酶学性质2.4.1 温度对固定化酶活力的影响考察了25–50 ℃范围内温度对固定化酶活力的影响，结果如图 8所示，固定化酶在25–40 ℃下，活力缓慢增加，在40 ℃达到最大。而游离酶在25–35 ℃下随着温度升高活力增加，35 ℃时活力最高。在实验温度范围内，酶经过固定化后最适温度由35 ℃偏移至40 ℃，产生最适温度偏移原因一方面可能是由于酶的稳定性和耐受性有所提高[22]，酶经交联作用固定在载体上，其结构发生一定的改变，进而酶的刚性提升，使其对温度的敏感性降低；另外一方面可能是由于较高的温度使得固定化酶附近底物传质效率加快，因而导致固定化酶作用的最适温度向高温方向移动[23]。
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| 图 8 温度对固定化酶活力的影响 Fig. 8 Effect of temperature on the activity of immobilized enzyme. |
| 图选项 |
2.4.2 pH对固定化酶活力的影响考察了不同pH对固定化酶活力的影响，结果如图 9所示。当pH在7.0–9.0之间时，固定化酶活力随着pH升高而逐渐增加，当pH为9.0时达到最大，随后pH在9.0–11.0范围内固定化酶活力逐渐降低。相比于游离酶，固定化酶对pH变化的敏感性较小，在实验范围pH内，其保留的酶活力均高于游离酶。这可能是由于固定化酶稳定性提升以及酶固定化后周围微环境的变化引起的[24]。
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| 图 9 pH对固定化酶活力的影响 Fig. 9 Effect of pH on the activity of immobilized enzyme. |
| 图选项 |
2.4.3 固定化酶温度稳定性考察进一步考察了固定化酶在30–50 ℃范围的热稳定性，结果如图 10所示。固定化酶在最适温度40 ℃下保温12 d，仍保留80.4%的酶活力；而在50 ℃下保温12 d，固定化酶仍保留45.6%的酶活力。根据固定化酶半衰期计算公式：
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| 图 10 温度对固定化酶活力的影响 Fig. 10 Effect of temperature on the activity of immobilized enzyme. |
| 图选项 |
2.4.4 动力学参数考察在最适条件下测定了固定化酶动力学参数Km、Vmax和kcat，结果如表 1所示。固定化酶的Km比游离酶大，说明固定化酶对底物的亲和力降低。这可能是由于游离酶经过固定化后其结构发生一定变化，导致活性位点与底物结合效率下降。固定化酶催化效率值kcat/Km相比于游离酶小幅下降，可能是由于酶通过交联方式固定在载体表面，导致酶构象发生变化或者底物的传质受阻[25-26]。
表 1 固定化酶和游离酶酶学性质Table 1 Kinetic parameters of immobilized and free amidase
| Michaelis-Menten | Free amidasea | Immobilized amidase |
| Km (mmol/L) | 53.65±0.9 | 58.32±0.6 |
| Vmax (μmol/(min·mg) | 21.32±0.6 | 16.23±0.4 |
| kcat (103 s–1) | 1.89±0.2 | 1.67±0.01 |
| kcat/Km (104 L/(s·mol) | 3.53±0.01 | 2.87±0.05 |
| a Reported by our previous study[16]. | ||
表选项
2.5 固定化酶催化合成(S)-4-氟苯甘氨酸的条件优化2.5.1 固定化酶用量对催化反应的影响酶的添加量是酶催化工业应用的一个重要的因素，酶用量不足使得反应不完全，酶用量过多导致成本过高。在最适温度、最适pH条件下考察了不同酶用量对催化反应的影响，结果如图 11所示。最佳酶用量为10 g/L。
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| 图 11 固定化酶用量对催化反应的影响 Fig. 11 Effect of immobilized enzyme loading on catalytic reaction. |
| 图选项 |
2.5.2 底物浓度、反应时间对催化反应的影响在上述优化条件确定后，考察了不同底物浓度对催化反应的影响，结果如表 2所示。当底物浓度在100–200 mmol/L范围内，反应120 min，转化率达到49.9%；当底物浓度在200–300 mmol/L范围内，适当延长时间(150–180 min)，转化率均可达到49.9%；当底物浓度超过300 mmol/L时，反应180 min，转化率为48.3%，即使延长时间，转化率仍低于49%。说明底物浓度小于200 mmol/L时，反应没有抑制作用且反应迅速，在200–300 mmol/L，有轻微的底物抑制作用，通过适当延长反应时间仍可以使得转化完全，当底物浓度高于300 mmol/L时，反应出现严重的抑制作用，导致转化不完全。此外，不同底物浓度催化反应生成的(S)-4-氟-苯甘氨酸的e.e.始终为99.9%。为了使催化反应转化率维持在比较高的水平，因此选择最佳底物浓度为300 mmol/L，反应时间180 min。
表 2 反应底物浓度、反应时间对固定化酶催化的影响Table 2 Effect of substrate concentration and reaction time on the reaction catalyzed by immobilized enzymes
| Substrate concentration (mmol/L) | Reaction time (min) | Conversion (%) | e.e. (%) |
| 100 | 60 | 49.9 | 99.9 |
| 150 | 90 | 49.9 | 99.9 |
| 200 | 120 | 49.9 | 99.9 |
| 250 | 120 | 49.5 | 99.9 |
| 250 | 150 | 49.9 | 99.9 |
| 300 | 150 | 49.5 | 99.9 |
| 300 | 180 | 49.9 | 99.9 |
| 350 | 180 | 48.3 | 99.9 |
| 350 | 240 | 48.5 | 99.9 |
表选项
2.5.3 固定化酶的操作稳定性在实际工业应用中酶催化剂重复使用性能是评价固定化酶的重要指标之一。为了考察固定化酶操作稳定性，利用固定化酶进行连续催化合成(S)-4-氟苯甘氨酸，结果如图 12所示。固定化酶连续反应20批次以后，残余酶活力仍保留原始酶活力的95.8%，表现出良好的操作稳定性。
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| 图 12 固定化酶的操作稳定性 Fig. 12 Operational stability of immobilized enzyme. |
| 图选项 |
3 讨论本研究以微水溶剂热法合成锆基金属有机框架Fast-UiO-66-NH2作为载体，利用戊二醛作为交联剂对酰胺酶固定化进行系统的考察，研究结果表明：当戊二醛添加浓度为1.0%、交联时间180 min、载体与酶质量比为8︰1，固定化效果最好，酶活力回收率达到86.4%，蛋白固定化效率为88.5%，酶负载量达到115.3 mg/g。虽然Fast-UiO-66-NH2的最佳蛋白负载量(115.3 mg/g)低于前期构建的多级孔金属有机框架(211.3 mg/g)，但是其酶活力回收率(86.4%) 与固定化效率(88.5%) 与多级孔金属有机框架比较接近(88.2%，92.2%)。这可能是由于微水溶剂热法制备金属有机框架是微孔，限制了酶大量进入孔道内部，此外，两者都采用戊二醛交联法，使二者具有较好的酶固定化效率[17]。固定化酶学性质分析表明，该固定化酶最适温度为40 ℃，最适pH值为9.0，在40 ℃的半衰期为72.2 d，具有较好的稳定性。该固定化酶的Km为58.32 mmol/L，Vmax为16.23 μmol/(min·mg)，kcat为1 670 s–1。利用含有氨基的有机配体制备金属有机框架，使其含有丰富的氨基可作为酶固定化结合位点。以戊二醛为交联剂，与酶表面的亲核性基团进一步共价结合。采用共价交联对进行固定化使得酶与载体结合得更加牢固，同时制备的固定化酶稳定性较好，在使用过程中没有酶的泄露。表 3总结并归纳了最近几年常用的“一锅法”固定化酶方法，与已报道的“一锅法” (共沉淀或仿生矿化) 的方法相比，利用该方法固定酰胺酶具有以下特点：(1) 酶与载体结合更加牢固；(2) 固定化酶在催化过程中没有酶的泄露；(3) 固定化酶在水相环境中有较好的稳定性。因此，金属有机框架Fast-UiO-66-NH2合成简单、快速、稳定、成本较低，同时固定化酰胺酶效果较好。
表 3 近年来不同框架固定化酶的比较Table 3 Comparison of enzyme immobilization based on different support
| Enzymes | Supports | Methods | Applications | References |
| Catalase | ZIF-90 | Co-precipitation | H2O2 degradation | [2] |
| Cyt c | ZIF-8 | Co-precipitation | Biocatalysis | [15] |
| Hydratase | ZIF-67 | Biomimetic mineralization | Biocatalysis | [27] |
| Peroxidase | Cu-BDC | Biomimetic mineralization | Biosensing | [28] |
| Amidase | UiO-66-NH2 | Cross-linking | Biocatalysis | The study |
表选项
利用固定化酰胺酶催化合成(S)-4-氟苯甘氨酸，优化后的反应条件为：底物N-苯乙酰-4-氟苯甘氨酸浓度为300 mmol/L，固定化酶用量为10 g/L，在100 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0) 中，反应温度为40 ℃，反应时间180 min。反应转化率达到49.9%，e.e.为99.9%。进一步考察固定化酶分批次催化反应，结果表明，连续使用20次，固定化酶仍保留95.8%的原始酶活力，表现出良好的操作稳定性。本研究为固定化酶催化合成(S)-4-氟苯甘氨酸的工业化生产奠定了基础。
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