, 郑裕国 浙江工业大学 生物工程学院，浙江 杭州 310014
收稿日期：2020-07-20；接收日期：2020-09-09
基金项目：国家重点研发计划(No. 2018YFA0901400)，国家自然科学基金(Nos. 31700095, 31971342) 资助
摘要：L-高丝氨酸是一种非必需氨基酸，在工业生产中常被用作重要的平台化合物和添加剂。为提高产物合成效率，本文以实验室构建的L-高丝氨酸高产工程菌大肠杆菌Escherichia coli H0-0作为底盘菌株进行代谢改造。首先对ppc和pyccgP458S基因进行过表达来优化柠檬酸循环，然后通过thrAC1034T和lysCcgC932T提高产物的合成效率，随后对iclR基因进行了敲除以减少副产物的积累。同时导入scrA、scrB、scrK三个蔗糖代谢基因使大肠杆菌能利用蔗糖作为碳源进行发酵。L-高丝氨酸产量从3.2 g/L提高至11.1 g/L，本研究也为L-高丝氨酸的工业化生产奠定了基础。
关键词：L-高丝氨酸平台化合物柠檬酸循环过表达副产物蔗糖
Metabolic engineering of Escherichia coli for L-homoserine production
Bo Zhang, Zhenhao Yao, Zhiqiang Liu
, Yuguo Zheng College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, Zhejiang, China
Received: July 20, 2020; Accepted: September 9, 2020
Supported by: National Key Research and Development Program of China (No. 2018YFA0901400), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31700095, 31971342)
Corresponding author: Zhiqiang Liu. Tel: +86-571-88320630; Fax: +86-571-88320614; E-mail: microliu@zjut.edu.cn.
Abstract: L-Homoserine is a non-essential amino acid that is often used as an important platform compound and additive in industrial production. To improve the production efficiency, a previously constructed L-homoserine producing strain E. coli H0-0 was used as a chassis for further metabolic modification. Firstly, the ppc and pyccgP458S genes were overexpressed to optimize the Kreb's cycle. Subsequently, thrAC1034T and lysCcgC932T were overexpressed to improve the product synthesis, followed by inactivation of iclR gene to reduce the accumulation of by-products. The introduction of three sucrose metabolism genes, scrA, scrB and scrK, enabled E. coli to ferment sucrose. The titer of L-homoserine increased from 3.2 g/L to 11.1 g/L.
Keywords: L-homoserineplatform compoundKreb's cycleoverexpressingby-productssucrose
L-高丝氨酸(L-homoserine, 2-amino-4- hydroxybutyric acid，HS) 是苏氨酸、甲硫氨酸和胱硫醚生物合成的中间代谢物。拥有丰富的生物活性，因此被广泛地应用于医药、饲料和美妆等产品的生产[1-2]。此外L-高丝氨酸还是一种重要的平台化合物，可以通过化学法转化为四氢叶酸、高丝氨酸环二酮哌嗪等多种产品[3]。目前L-高丝氨酸的主要生产方式为化学合成[4-5]。
根据文献记载，Matsunosuke等将来自植物中和动物肝脏中的刀豆酸进行水解后获得了天然高丝氨酸[6-7]。1907年Fischer和Blumenthal使用化学法首次合成了高丝氨酸，随后Marvin从结构和性质上解释并验证了Fischer的研究[3]。时至今日，仍主要以丁内酯为原料通过化学法生产L-高丝氨酸，但是存在原料成本高、流程复杂等缺点。1984年Plachy等使用苏氨酸缺陷型谷氨酸棒杆菌进行蔗糖发酵得到了高丝氨酸[8]。Li等使用基因编辑技术构建得到了一株高丝氨酸高产的大肠杆菌HM4 (pBRmetL–pNrhtA)，其在500 mL摇瓶中发酵得到2.12 g/L的产量。在敲除工程菌株的外转运蛋白基因tdcC后得到菌株HM5 (pBRmetL–pNrhtA)，经过补料发酵得到了39.9 g/L的高丝氨酸[9]。与化学法相比发酵法的原料成本低、步骤少。
大肠杆菌拥有明确的基因背景、清晰的代谢网络、较短的生长周期，所以被用于多种天然产物的发酵生产。在正常情况下大肠杆菌中L-高丝氨酸的合成路径如图 1所示：首先，葡萄糖经过糖酵解后以乙酰辅酶A的形式进入柠檬酸循环后转化为草酰乙酸参与到高丝氨酸的合成中。首先在天冬氨酸转氨酶作用下转化为天冬氨酸。天冬氨酸在天冬氨酸激酶(由thrA、metL、lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(由asd编码)、高丝氨酸合成酶(由thrA、metL编码) 作用下催化为L-高丝氨酸[10]。
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| 图 1 工程菌株中L-高丝氨酸代谢途径改造示意图 Fig. 1 L-homoserine biosynthetic pathway in L-homoserine-producing strain. S6P: sucrose-6-phosphate; G6P: glucose-6-phosphate; FRU: fructose; F6P: fructose-6-phosphate; F1, 6P: fructose-1, 6-diphosphate; GA3P: 3-phosphoglyceraldehyde; PEP: phosphoenolpyruvate; PYR: pyruvate; Ac-CoA: acetyl-CoA; ACE: acetic acid; OAA: oxalacetic acid; CIT: citric acid; ICL: isocitric acid; α-KG: α-ketoglutaric acid; SUCC: succinyl-CoA; SUC: succinic acid; MAL: l-malate; Asp: l-aspartic acid; Asp-P: aspartyl-phosphate; Asp-SA: l-aspartate-4-semialdehyde; Glu: glutamic acid; Hom: homoserine; Met: methionine; Lys: lysine; Thr: threonine; scrA: sucrose-specific transporter subunit IIABC; scrB: sucrose-6-phosphate hydrolase; scrK: fructokinase; ppc: phosphoenolpyruvate carboxylase; pyc*: mutated pyruvate carboxylase, P458S; iclR: DNA-binding transcriptional repressor; aceA: isocitrate lyase; aceB: malate synthase A; aceK: isocitrate dehydrogenase phosphatase; thrA*: mutated aspartokinase Ⅰ and homoserine dehydrogenase Ⅰ, C1034T; lysC*: mutated aspartokinase Ⅲ, C932T; IDH: isocitrate dehydrogenase; IDHP: isocitrate dehydrogenase (phosphorylated). |
| 图选项 |
L-高丝氨酸在野生型大肠杆菌中不易积累[11]。在前期工作中，本实验室利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除了旁路代谢的相关基因(metB、thrB、metA、lysA) 和调节基因(metJ)，将metL基因的天然启动子替换为Trc启动子，并且敲除转运基因metI构建得到了高产菌株E. coli H0-0。该菌株经过48 h葡萄糖发酵后能积累3.2 g/L产物，同时产生大量乙酸和α-酮戊二酸。这是因为柠檬酸循环和产物合成效率偏低所致。
本研究以大肠杆菌Escherichia coli H0-0为底盘菌株，使用CRISPR-Cas9基因编辑和质粒过表达技术对柠檬酸循环、产物合成、乙醛酸循环和蔗糖代谢这4个模块进行了改造：首先将ppc基因(编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶) 的天然启动子替换为Trc启动子[12]，又通过质粒过表达了突变基因pyccgP458S (pyc*)[13]。基因ppc和pyc*分别编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶，这两种酶可以减少乙酰辅酶A积累，增加柠檬酸循环的物质输入[14-15]。然后过表达thrAC1034T (thrA*)和lysCcgC932T (lysC*) 基因，thrA*编码抗反馈抑制的天冬氨酸激酶Ⅲ和高丝氨酸脱氢酶Ⅰ融合蛋白，lysC*编码抗反馈抑制的天冬氨酸激酶Ⅰ[16]。thrA*和lysC*的过表达将提高产物的合成速率，能减少草酰乙酸、柠檬酸等副产物的积累。随后敲除乙醛酸途径转录调控因子基因iclR来强化乙醛酸循环，从而来强化菌株对乙酰辅酶A的利用能力[17]。最后，为了让菌株能利用高效易得的蔗糖进行发酵，外源导入了蔗糖代谢基因[18]。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与质粒本试验所用菌株与质粒如表 1和表 2所示。
表 1 本研究所用的质粒Table 1 Plasmids used in this study
| Plasmids | Relative characteristics | Sources |
| pCas | repA101(Ts) kan Pcas-cas9 ParaB-Red lacIq Ptrc-sgRNA-pMB1 | Lab collection |
| pTarget | pMB1 aadA sgRNA | Lab collection |
| pTrc99a | Trc-promo, kan, lacI, ori | Lab collection |
| pACYC* | Trc-promo, lac operator, p15A ori, cmr, lacI | Lab collection |
| ppyc* | cmr, p15A ori, trc-pyc*, lacI | This study |
| pSCR | trc-scrA, scrB, scrK, lacI, kan | This study |
| pACP | p15A ori trc-thrA*lysC*pyc*, lacI | This study |
表选项
表 2 本研究所用的菌株Table 2 Strains used in this study
| Strains | Relative characteristics | Sources |
| E. coli DH5α | F–, endA, endA1, glnV44, thi-1, recA, relA1, gyra96, deoR, nupG, purB20, φ80dlacZ, ΔM15, Δ(lacZYA-argF) U169, hsdR17(rK–mK+), λ– | Beijing TransGen |
| E. coli H0-0 | E. coli W3110 derivative ΔmetI, ΔmetJ, ΔthrB, ΔmetB, ΔmetA, ΔlysA, Trc-metL | Lab collection |
| E. coli H1-0 | E. coli H-0 derivative, Trc-ppc | This study |
| E. coli H2-0 | E. coli H0-0 derivative, Trc-ppc harboring ppyc* | This study |
| E. coli H3-0 | E. coli H0-0 derivative, Trc-ppc harboring pACP | This study |
| E. coli H4-0 | E. coli H0-0 derivative, Trc-ppc, ΔiclR harboring pACP | This study |
| E. coli H5-0 | E. coli H0-0 derivative, Trc-ppc, ΔiclR harboring pACP and pSCR | This study |
| E. coli H0-5 | E. coli H0-0 harboring pSCR | This study |
| E. coli H0-2 | E. coli H0-0 harboring ppyc* | This study |
| E. coli H0-4 | E. coli H0-0 derivative, ΔiclR | This study |
| E. coli H3-1 | E. coli H0-0 harboring pACP | This study |
| E. coli H4-3 | E. coli H0-0 derivative, Trc-ppc, ΔiclR harboring ppyc* | This study |
| E. coli H4-23 | E. coli H0-0 derivative, Trc-ppc, ΔiclR | This study |
表选项
1.1.2 主要试剂卡那霉素(工作浓度50 mg/mL)、氯霉素(工作浓度25 mg/mL)、壮观霉素(工作浓度50 μg/mL)购自生工生物工程(上海) 股份有限公司；TransStart Fast Pfu DNA聚合酶购自昆明诺唯赞生物科技有限公司；Clone ExpressTM Ⅱ一步克隆试剂盒C112和C113购自昆明诺唯赞生物科技有限公司。质粒小量快速提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker购自北京康为世纪生物科技有限公司；L-高丝氨酸标准品购自阿拉丁试剂(上海) 有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠5 (固体培养基加入2%琼脂粉)。
摇瓶葡萄糖发酵MS培养基(g/L)：葡萄糖40，KH2PO4 4，MgSO4·7H2O 2，酵母粉4，CaCO3 15。微量元素(mg/L) 包括：CaCl2 40，FeSO4 40，MnSO4 20，CoCl2 8，ZnSO4 4，CuCl2 2，H3BO3 1。
摇瓶蔗糖发酵MS培养基(g/L)：蔗糖70，KH2PO4 4，MgSO4·7H2O 2，酵母粉4，CaCO3 15。微量元素(mg/L)包括：CaCl2 40，FeSO4 40，MnSO4 20，CoCl2 8，ZnSO4 4，CuCl2 2，H3BO3 1。
氨基酸(g/L) 包括：蛋氨酸0.2，苏氨酸0.2，赖氨酸0.02。
1.2 方法1.2.1 培养方法摇瓶发酵生产L-高丝氨酸：挑取单菌落到有5 mL LB的试管中，37 ℃、200 r/min培养12 h，取200 μL接种到10 mL MS培养基中，30 ℃、200 r/min培养24 h或48 h或72 h，再选取合适的时间点取样测定OD600以及柠檬酸、α-酮戊二酸、乙酸、草酰乙酸和L-高丝氨酸的浓度。
1.2.2 代谢产物和菌体量检测利用氨基酸分析仪来检测发酵液中的L-高丝氨酸等氨基酸的浓度，以高效液相色谱测定发酵液中的小分子酸浓度。取发酵液1 mL于12 000 r/min离心5 min后分离上清和沉淀。将沉淀用水进行冲洗并离心分离后使用20%的乙酸悬浮去除沉淀中的碳酸钙。最后用1 mL水悬浮后用分光光度计于600 nm处测定OD600值作为单位时间的菌体量。
取发酵上清用水稀释一定倍数后用液相和氨基酸分析仪分别检测胞外的副产物和产物积累量。
副产物检测条件：Aminex HPLC(BIO-RAD)色谱柱，流动相为8.3‰ (m/m) 硫酸。
产物检测条件：全自动氨基酸分析仪(SYKAM S-433D，德国)
样品均有3个以上平行样，结果取平均值。用L-高丝氨酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、乙酸、草酰乙酸标品配制标准液并绘制标准曲线。
1.2.3 蔗糖代谢基因表达载体的构建在NCBI网站上获得了来自变形链球菌Streptococcus mutans UA159蔗糖代谢基因scrA、scrB、scrK的序列，由金斯瑞生物科技有限公司负责密码子优化后合成到了质粒载体上。
以合成的质粒载体为模板，用引物scrA-F和scrA-R/scrB-F和scrB-R/scrK-F和scrK-R分别进行扩增后使用NEB (北京) 有限公司的DpnⅠ消化模板并纯化获得具有同源臂的scrA、scrB、scrK序列。以实验室保存的pTrc99a质粒为模板，用引物pTrc99a-F和pTrc99a-F进行扩增获得线性化的pTrc99a质粒片段(图 2)。纯化后用一步克隆试剂盒Clone ExpressTMⅡ的C113系列产品进行多片段连接，将连接产物转化到大肠杆菌E. coli DH5α后，用引物p99a-F和p99a-R进行菌落PCR挑取阳性菌落测序验证后获得重组质粒pSCR。
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| 图 2 文中所用质粒的图谱 Fig. 2 Diagram of recombinant plasmids used in this study. |
| 图选项 |
1.2.4 突变基因表达载体的构建以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，分别用引物pyc-F和pyc-R、lysC-F和lysC-R进行扩增消化并纯化后获得pyccg、lysCcg基因片段(表 3)。以大肠杆菌E. coli W3110基因组为模板，用引物thrA-F和thrA-R进行扩增消化并纯化后获得thrA基因片段。
表 3 本研究所用的引物Table 3 Primers used in this study
| Target gene | Primer name | Sequence (5′–3′) | Size (bp) | |
| ppc | pTDppc-F | CCGAAGTGGTGAACTACTGTACCGAAGCGCCGTTTATTC | 39 | |
| pTDppc-R | CGGTATCGTTTGATAGCCCTGTAATTATACCTAGGAC | 37 | ||
| pTppc-1 | CTTTTTTTGAATTCTCTAGACCGAAGTGGTGAACTACTGTACCGAAGCG | 49 | ||
| pTppc-2 | GCCGGATGATTAATTGTCAAAAGCCACGTAAAAGCGGTGACGTCA | 45 | ||
| pTppc-3 | ATCATCCGGCTCGTATAATGCAGGGCTATCAAACGATAAGATGGG | 45 | ||
| pTppc-4 | GGTAATAGATCTAAGCTTCTGCAGGCTGGTTGTGTTCGTAGTCAGC | 46 | ||
| T-ppc-F | GTTTGCTCAACGATGCATTGGC | 22 | ||
| T-ppc-R | CTTCCAGCCATGCCTGTGTC | 20 | ||
| lysCcg | lysC-F | GTGGCCCTGGTCGTAC | 16 | |
| lysC-R | TTAGCGTCCGGTGCC | 15 | ||
| thrA | thrA-F | ATGCGAGTGTTGAAGTTCG | 19 | |
| thrA-R | TCAGACTCCTAACTTCCATGAG | 22 | ||
| lysCcg* | lysCcg*-1 | GTTAGGAGTCTGAAGGAAGGAGATATACGTGGCCCTGGTCGTAC | 44 | |
| lysCcg*-2 | GAAGGTGATGTCGGTGGTG | 19 | ||
| lysCcg*-3 | CATCACCTTCACCTGCC | 17 | ||
| lysCcg*-4 | GTGAGTCGACACGTATATCTCCTTCCTTTAGCGTCCGGTGCC | 42 | ||
| thrA* | thrA*-1 | CACAGGAAACAGACCATGCGAGTGTTGAAGTTCGGCGG | 38 | |
| thrA*-2 | CCACGGAAATACGGGCGCGTG | 21 | ||
| thrA*-3 | GTATTTCCGTGGTGCTGATTACGCAATCATCTTC | 34 | ||
| thrA*-4 | CATAGAGCCGGCAATGTATATCTCCTTCCTTCAGACTCCTAACTTCCATGAG | 52 | ||
| iclR | pTDiclR-F | CCGAAGTGGTGAACTACTGTACCGAAGCGCCGTTTATTC | 39 | |
| pTDiclR-R | CGGTATCGTTTGATAGCCCTGTAATTATACCTAGGAC | 37 | ||
| pTiclR-1 | CTTTTTTTGAATTCTCTAGACCGAAGTGGTGAACTACTGTACCGAAGCG | 49 | ||
| pTiclR-2 | GCCGGATGATTAATTGTCAAAAGCCACGTAAAAGCGGTGACGTCA | 45 | ||
| pTiclR-3 | ATCATCCGGCTCGTATAATGCAGGGCTATCAAACGATAAGATGGG | 45 | ||
| iclR | pTiclR-4 | GGTAATAGATCTAAGCTTCTGCAGGCTGGTTGTGTTCGTAGTCAGC | 46 | |
| T-iclR-F | GTTTGCTCAACGATGCATTGGC | 22 | ||
| T-iclR-R | CTTCCAGCCATGCCTGTGTC | 20 | ||
| pyc | pyc-F | GTGTCGACTCACACATCTTC | 20 | |
| pyc-R | TTAGGAAACGACGACGATCAAG | 22 | ||
| pyc* | pyc*-1 | GTGTCGACTCACACATCTTCAACG | 24 | |
| pyc*-2 | AGTGATCGGCAATGAATCCGGT | 22 | ||
| pyc*-3 | GTGCGAGTGATCGGCAATG | 19 | ||
| pyc*-4 | CAGCCAAGCTTTTAGGAAACGACGACGATC | 30 | ||
| ppyc*-F | GAAACAGACCGTGTCGACTCACACATCTTC | 30 | ||
| pT-seq-F | GGCCTTTTGCTCACATGTTC | 20 | ||
| pT-seq-R | TAGCACGATCAACGGCACTG | 20 | ||
| Target-C-F | CTGCAGAAGCTTAGATCTATTACCC | 25 | ||
| Target-C-R | TCTAGAGAATTCAAAAAAAGCACCG | 25 | ||
| T-Trc-R | CGAGCCGGATGATTAATTGTC | 21 | ||
| pACYC184*-seq-F | GCACTCCCGTTCTGGATAAT | 20 | ||
| pACYC184*-seq-R | GGCGGATTTGTCCTACTCAG | 20 | ||
| pACYC*P-F | GTGTCGACTCACACATCTTCAAC | 23 | ||
| pACYC*P-R | GGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATC | 28 | ||
| pTrc99a-F | AATTCGAGCTCGGTACCCGGGG | 22 | ||
| pTrc99a-R | CAATTTCACACAGGAAACAGACC | 23 | ||
| pACYC184*-F | AATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATC | 25 | ||
| pACYC184*-R | GGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATC | 28 | ||
表选项
突变过程以pyc为例：首先以pyc基因为模板分别使用引物pyc*-1和pyc*-2，pyc*-3和pyc*-4进行扩增获得pyc*片段A和pyc*片段B，使用Axygen胶回收试剂盒进行纯化后将pyc*片段A和pyc*片段B作为模板，以pyc*-1和pyc*-4作为引物进行融合PCR，纯化后获得具有同源臂的pyc*基因片段。具有同源臂的thrA*和lysC*基因片段可通过类似方法获得。
以pyc*基因片段为模板，使用引物ppyc*-F和pyc*-4进行扩增并纯化后获得pyc*s基因片段。
用实验室保存的pACYC*质粒为模板以引物pACYC184*-F和pACYC184*-F进行扩增获得线性的载体片段并纯化。将线性的载体片段用一步克隆试剂盒Clone ExpressTMⅡ的C113系列产品与pyc*、thrA*和lysC*进行多片段连接。将线性的载体片段用一步克隆试剂盒Clone ExpressTMⅡ的C112系列产品与pyc*s进行单片段连接。将以上连接产物转化到大肠杆菌E. coli DH5α后，用引物pACYC184*-F和pACYC184*-R进行菌落PCR，根据产物条带长度挑取阳性菌落送测验证后获得重组质粒pACP和ppyc*。
1.2.5 基因敲除和启动子的替换在E. coli H0-0等菌株中通过CRISPR-Cas9系统编辑ppc、iclR基因。以Trc启动子替换基因ppc的原有启动子，敲除iclR基因。操作流程按照文献[19]所述。使用引物pTppc-1和T-Trc-R，pTiclR-1和pTiclR-4进行PCR验证，根据产物条带长度挑取阳性菌落测序验证后获得相应的菌株。
2 结果与分析2.1 柠檬酸循环的优化L-高丝氨酸高产菌E. coli H0-0发酵过程中副产物积累情况如图 3所示。其中乙酸和α-酮戊二酸为主要的副产物，乙酸积累9.8 g/L，α-酮戊二酸积累4.0 g/L，草酰乙酸积累0.2 g/L。
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| 图 3 底盘菌株摇瓶发酵过程中高丝氨酸、乙酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸的积累情况 Fig. 3 Production of L-homoserine (HS), acetic acid (ACE), and α-ketoglutaric acid (α-KG) by the chassis strain in shake flask fermentation at 48 h. |
| 图选项 |
为了减少乙酸的积累，通过基因组启动子替换和质粒导入的方法过表达了ppc和pyc*基因。如图 3所示，这两种基因编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶能分别将磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸催化为草酰乙酸，促进柠檬酸循环物质输入。在工程菌株中过表达ppc和pyc*基因后进行48 h摇瓶发酵，发酵结果如图 4所示。
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| 图 4 在菌株中过表达ppc和pyc*后产物高丝氨酸与副产物乙酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸的积累情况 Fig. 4 Production of L-homoserine and by-products when ppc and pyc* were overexpressed. |
| 图选项 |
ppc基因的过表达促进了柠檬酸循环的物质输入，菌体量增加，产量提高。随着磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸代谢通量的增加，在一定程度上也缓解了乙酰辅酶A节点处的溢流代谢。菌株E. coli H0-1产量达到5.5 g/L，乙酸减少至9.0 g/L，草酰乙酸积累2.9 g/L。
pyc*基因的质粒过表达能将部分丙酮酸转化为草酰乙酸，促进产物的合成。丙酮酸到乙酰辅酶A的代谢通量也随之减少，明显减少了乙酸的积累。在菌株E. coli H0-2中，产量达到4.4 g/L，乙酸积累减少至2.6 g/L，草酰乙酸积累1.0 g/L。
在菌株E. coli H2-0中，将ppc和pyc*基因进行了组合过表达。乙酸积累减少至2.1 g/L，产量提高至5.9 g/L。ppc和pyc*基因的作用产生了叠加，但产量提高受到了限制。
2.2 强化产物的合成为了将柠檬酸循环中积累的物质转化为产物，对lysC*和thrA*基因进行了过表达以提高产物的合成速率。thrA*编码抗反馈抑制的天冬氨酸激酶Ⅲ和高丝氨酸脱氢酶Ⅰ融合蛋白，lysC*编码抗反馈抑制的天冬氨酸激酶Ⅰ，这两种基因的过表达将促进产物合成。在ppyc*质粒上连接lysC*和thrA*基因获得质粒pACP后转入工程菌株进行48 h摇瓶发酵。发酵结果如图 5所示。
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| 图 5 在菌株中组合过表达基因thrA*和lysC*后产物高丝氨酸与副产物乙酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸、柠檬酸的积累情况 Fig. 5 Production of L-homoserine and by-products when thrA* and lysC* were overexpressed. CIT: citric acid. |
| 图选项 |
在菌株E. coli H0-0和E. coli H1-0中分别导入pACP质粒后，产量都出现了明显的提高，乙酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸积累下降。比较菌株E. coli H3-1和E. coli H3-0可知，在过表达lysC*和thrA*基因时，柠檬酸循环物质输入量越大，产量提高越明显。
最终菌株E. coli H3-0经过发酵后产量提高至8.6 g/L，乙酸积累降低至1.4 g/L，α-酮戊二酸积累降低至3.0 g/L。
2.3 强化乙醛酸循环经过以上对柠檬酸循环和产物合成的改造产量获得了明显的提高，但副产物乙酸和α-酮戊二酸仍未降低至理想浓度。所以将iclR基因敲除来强化乙醛酸循环，提高工程菌株对乙酰辅酶A的利用能力，同时减少流向α-酮戊二酸的碳流。转录调节蛋白ICLR能抑制乙醛酸循环相关基因aceA、aceB、aceK、iclR的转录。其中异柠檬酸裂解酶(ACEA) 可以将异柠檬酸裂解为乙醛酸和琥珀酸，苹果酸合成酶(ACEB) 可以使用乙酰辅酶A合成苹果酸，异柠檬酸脱氢酶磷酸化酶(ACEK) 能将异柠檬酸脱氢酶磷酸化使其失活。在工程菌株中敲除iclR基因后进行48 h摇瓶发酵，发酵结果如图 6所示。
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| 图 6 在菌株中敲除iclR基因后产物高丝氨酸与副产物乙酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸和柠檬酸的积累情况 Fig. 6 Production of L-homoserine and by-products when iclR was knocked out. |
| 图选项 |
在菌株E. coli H0-4经过48 h发酵后产量和副产物未明显增加的情况下，菌体量达到了43。这证明了乙醛酸循环也能增加柠檬酸循环的物质供给。在其他高产菌株中敲除iclR基因后，产量均获得了16%–42%的提高，乙酸积累低于0.6 g/L。说明敲除iclR基因后，菌株能高效地将乙酰辅酶A用于苹果酸和琥珀酸的合成，随后参与到产物的合成中。但在iclR基因敲除的菌株中α-酮戊二酸的积累却未出现明显的减少，只有菌株E. coli H4-3出现了明显的下降。据此猜测α-酮戊二酸作为产物合成过程中关键的氨基载体，无法通过碳流调节实现减少。最终，在菌株E. coli H4-0中产量达到了9.9 g/L，乙酸积累0.6 g/L，α-酮戊二酸积累3.2 g/L。
2.4 蔗糖发酵碳源是发酵中的关键因素，蔗糖发酵有着更高的效率并且已经推广用于部分产品的发酵生产。Lu等使用蔗糖发酵琥珀酸在副产物明显减少的同时产率达到80% (g/g蔗糖)[20]。菌株FTR-SH使用蔗糖进行发酵生产O-琥珀酰高丝氨酸达到了65.5% (g/g蔗糖) 的相对产率[4]。在优化了工程菌株的代谢路径后，碳源摄入速率和菌株内外的发酵环境限制了产量的提高。所以参照Ju等的专利中所述的蔗糖利用改造思路构建了蔗糖代谢质粒pSCR[18]。首先在底盘菌株中导入质粒pSCR分别进行了葡萄糖发酵和蔗糖发酵，结果如图 7所示。可以发现：葡萄糖发酵时，菌株E. coli H0-5产量和菌体量略低于菌株E. coli H0-0。蔗糖发酵时，菌株E. coli H0-0生长缓慢、产量低，无法有效利用蔗糖。而菌株E. coli H0-5的产量达到了5.0 g/L，高于底盘菌株进行葡萄糖发酵时的产量。虽然蔗糖代谢基因的导入造成了一定的负担，但总体来说蔗糖作为碳源进行发酵时更利于菌株的生长与产物的合成。
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| 图 7 蔗糖代谢途径的导入对产量和菌体量的影响 Fig. 7 Effect of introducing sucrose metabolic pathway on the production of L-homoserine and biomass. H0-0 GL: strain E. coli H0-0 fermented in glucose; H0-5 GL: E. coli H0-5 fermented in glucose; H0-0 SU: strain E. coli H0-0 fermented in sucrose; H0-5 SU: strain E. coli H0-5 fermented in sucrose. |
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在工程菌株E. coli H4-0中转入质粒pSCR后进行72 h蔗糖发酵，每24 h测定发酵液成分，结果如图 8所示。在发酵前期菌体生长较为缓慢，但在中后期逐渐升高，最终OD600值达到了40。在发酵的前中后期菌株主要积累的物质依次为柠檬酸、α-酮戊二酸、L-高丝氨酸。在前期蔗糖就已被高效地利用，以柠檬酸的形式在发酵液中积累。在中后期随着菌体量的增加柠檬酸被用于产物的合成。发酵过程中未出现草酰乙酸积累。菌株E. coli H5-0经过72 h蔗糖发酵产量达到了11.1 g/L。
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| 图 8 在蔗糖发酵的不同阶段产物高丝氨酸与副产物乙酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸、柠檬酸的积累情况 Fig. 8 Production of L-homoserine and by-products at different stages during sucrose fermentation. |
| 图选项 |
3 讨论碳源的利用和产物的合成是工程菌株在发酵过程中两个关键的环节，两者之间的协调才能保证产物的积累。ppc和pyc*基因的改造消除了乙酰辅酶A处的溢流代谢，碳源可被顺利摄入。thrA*和lysC*基因将柠檬酸循环中的草酰乙酸转化为产物。iclR基因的敲除提高了菌株对酰辅酶A的利用能力。蔗糖代谢基因的导入则实现了碳源的高效摄入并改善了胞内的转录环境。这些改造都减少了副产物的积累，逐步提高了产量。
蔗糖是一种来源广泛的碳源，蔗糖代谢菌株的构建不仅进行了新的尝试，也为资源利用提供了一种可行的路线。对于蔗糖发酵过程中表现出的高效性可以从以下两种角度来进行解释：(1) 蔗糖发酵的优势可能与转录调节蛋白CRA有关。CRA蛋白可对大量基因进行转录调节，这些基因涉及碳代谢、能量代谢等[21-22]。而在代谢过程中由于蔗糖的水解和菌株的转运，发酵液中会积累果糖。这些果糖代谢产生的果糖-1-磷酸会造成部分转录调节蛋白CRA失活，菌株的代谢效率因此获得提高[22-24]。(2) 蔗糖发酵时由于蔗糖的自然水解，发酵液中存在蔗糖、果糖、葡萄糖3种碳源。菌株可以通过对应的PTS系统对碳源进行摄入，这提高了碳源摄入的效率。菌株在进行蔗糖代谢时所需的磷酸基团主要由磷酸烯醇式丙酮酸提供，减少了从碳源摄入到丙酮酸代谢路径中ATP的消耗。
与葡萄糖发酵相比，正因为存在这两种差异，蔗糖发酵时细胞内磷酸烯醇式丙酮酸和α-酮戊二酸的合成与消耗情况也发生了变化。在发酵前期胞内的磷酸烯醇式丙酮酸作为PTS系统的磷酸化供体被转化为丙酮酸。由于ppc和pyc*基因的过表达，在磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸节点处不易发生溢流代谢。因此对碳源摄入的影响较小，产生的丙酮酸也能被有效转化为草酰乙酸用于合成。这些变化有利于以丙酮酸为前体的氨基酸进行合成[23]。在蔗糖发酵过程中仅在48 h观察到α-酮戊二酸积累，与菌株转录环境的变化有着密切的联系。根据文献与Biocyc网站提供的数据，CRA蛋白的部分失活将导致icd、sucA、sucB、lpd基因转录的变化，最终减少了α-酮戊二酸的合成量，增加了消耗量。
在蔗糖发酵过程中菌株能更高效地将碳源用于菌体的增殖与产物的合成，但在实验中过多的物质与能量被用于了细胞的增殖。若能平衡二者关系，将实现产率的提高。
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